1、1生物制药基础化学化工学院化学化工学院陶洪文陶洪文2第三章第三章 动植物细胞培养制药技术动植物细胞培养制药技术3第一节第一节 动物细胞培养制药技术动物细胞培养制药技术 概述概述 动物细胞培养的特性动物细胞培养的特性 动物细胞培养基的组成和制备动物细胞培养基的组成和制备 细胞培养过程的检测细胞培养过程的检测 动物细胞培养方法和操作方式动物细胞培养方法和操作方式 动物细胞大规模培养技术的应用动物细胞大规模培养技术的应用4一一.概概 述述 20 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质外突形成，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成。外突形成，还
2、是由神经细胞周围的其他细胞融合而成。1907 1907年，美国生物学家哈里森年，美国生物学家哈里森(Harrison)(Harrison)从蝌蚪的脊索从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。经纤维。哈里森的实验解决了神经纤维的起源问题，开创了动物哈里森的实验解决了神经纤维的起源问题，开创了动物组织培养的先河。此后，动物组织培养不断改进并逐渐发展组织培养的先河。此后，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培
3、养。成为动物细胞培养。1.1.动物细胞培养的起源动物细胞培养的起源5动物细胞培养动物细胞培养 就是从动物有机就是从动物有机体中取出相关的组体中取出相关的组织，将它分散成单织，将它分散成单个细胞，然后，放个细胞，然后，放在适宜的培养基中，在适宜的培养基中，让这些细胞生长和让这些细胞生长和增殖增殖.用培养的人细胞构建人造皮肤用培养的人细胞构建人造皮肤6动物动物胚胎胚胎或或幼龄幼龄动动物的组织、器官物的组织、器官胰蛋白酶胰蛋白酶剪碎剪碎单个细胞单个细胞培养液培养液制成制成细胞细胞悬浮悬浮液液1010代代细胞细胞部分细胞部分细胞“癌癌变变”，无限传，无限传代代动物细胞培养不能动物细胞培养不能最终培养成
4、动物体最终培养成动物体5050代细胞代细胞原代培原代培养养传代培养传代培养细胞贴壁细胞贴壁剥离、分瓶剥离、分瓶细胞株细胞株细胞细胞细胞系细胞系2.2.动物细胞培养过程：动物细胞培养过程：接触抑制接触抑制遗传遗传物质物质未改未改变变遗遗传传物物质质改改变变7动物细胞培养工艺流程动物细胞培养工艺流程8有关概念有关概念:原代培养：原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第原代细胞。培养的第1 1代细胞与传代细胞与传1010代以内的代以内的细胞称为原代细胞培养。细胞称为原代细胞培养。传代培养：传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制将原代细胞从培养瓶中取出，配
5、制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。瓶中继续培养，称为传代培养。9细胞株：细胞株：原代细胞一般传至原代细胞一般传至1010代左右细胞生长停代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40504050代，代，这种传代细胞为细胞株。这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞系：细胞株传代至细胞株传代至5050代后又出现细胞生长停代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。
6、培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。养。10细胞贴壁：细胞贴壁：细胞悬液中的分散细胞贴附到培养细胞悬液中的分散细胞贴附到培养瓶壁上。瓶壁上。要求培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易要求培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。于贴附。接触抑制：接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞会停止运动，但不影响细胞分裂增殖。触时，细胞会停止运动，但不影响细胞分裂增殖。密度抑制
7、：密度抑制：细胞长满培养平板，达到一定密度细胞长满培养平板，达到一定密度后，细胞会停止分裂增殖。后，细胞会停止分裂增殖。11动物细胞镜检形态动物细胞镜检形态高密度高密度低密度低密度悬浮型细胞悬浮型细胞12整体整体放大放大贴壁型细胞贴壁型细胞13二、动物细胞培养特性二、动物细胞培养特性 1.1.分裂期长分裂期长12-4812-48小时，细胞生长缓慢，易受微生小时，细胞生长缓慢，易受微生物污染。物污染。2.2.细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境影响大细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境影响大 动物细胞对周围环境十分敏感动物细胞对周围环境十分敏感,渗透压、酸度、离渗透压、酸度、离子浓度、剪切力、微量元
8、素等的变化都会影响其生子浓度、剪切力、微量元素等的变化都会影响其生长。动物细胞对培养基要求很高，需要长。动物细胞对培养基要求很高，需要 12 12种必需种必需氨基酸、氨基酸、8 8种以上维生素、多种无机盐和微量元素、种以上维生素、多种无机盐和微量元素、葡萄糖外，还需要多种细胞生长因子和贴壁因子葡萄糖外，还需要多种细胞生长因子和贴壁因子.143.3.培养需氧少，不耐强力通风和搅拌培养需氧少，不耐强力通风和搅拌正常二倍体细胞的寿命是有限的，一般繁殖正常二倍体细胞的寿命是有限的，一般繁殖5050代左右，就逐渐死亡。代左右，就逐渐死亡。4.4.培养时有群体效应、锚地依赖性、接触抑制培养时有群体效应、锚
9、地依赖性、接触抑制性和功能全能性性和功能全能性5.5.产物在胞外，成本高，但价格昂贵产物在胞外，成本高，但价格昂贵6.6.与微生物有区别，培养时不可套用经验与微生物有区别，培养时不可套用经验7.7.原代培养一般原代培养一般5050代及退化死亡代及退化死亡15三、动物细胞培养基的组成与制备三、动物细胞培养基的组成与制备 1)1)所有的与细胞接触的设备、器材和溶液都必须保持绝对所有的与细胞接触的设备、器材和溶液都必须保持绝对无菌，避免污染；无菌，避免污染；2)2)必须有足够的营养保证，绝对不可有有害的物质，避免必须有足够的营养保证，绝对不可有有害的物质，避免有害离子；有害离子；3)3)保证有适量的
10、氧气供应；保证有适量的氧气供应；4)4)需随时清除细胞代谢中的有害产物；需随时清除细胞代谢中的有害产物；5)5)有适于生存的外界环境，渗透压、离子浓度和酸度；有适于生存的外界环境，渗透压、离子浓度和酸度；6)6)及时分种，保持合适的细胞密度。及时分种，保持合适的细胞密度。1.1.动物细胞在体外培养所需条件动物细胞在体外培养所需条件 162.2.动物培养基的种类和组成动物培养基的种类和组成 1 1）天然培养基：血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸）天然培养基：血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。液、羊水、腹水。2 2）合成培养基：组成稳定可大量生产供应。成分为）合成培养基：组成稳定可大量生产
11、供应。成分为氨基酸（细胞合成蛋白质的原料）、维生素（维持细氨基酸（细胞合成蛋白质的原料）、维生素（维持细胞生命活动的低分子活性物质，形成酶的辅基或辅胞生命活动的低分子活性物质，形成酶的辅基或辅酶）、糖类（碳源）、无机盐（保持细胞的渗透压并酶）、糖类（碳源）、无机盐（保持细胞的渗透压并参与代谢）、缓冲系统、参与代谢）、缓冲系统、矿物类、矿物类、有机补充物、激素有机补充物、激素类、生长因子类。合成培养基中除了各种营养成分外，类、生长因子类。合成培养基中除了各种营养成分外，还需添加还需添加 5%-10%5%-10%的小牛血清，的小牛血清，才能使细胞很好地增才能使细胞很好地增殖殖.17 添加小牛血清的
12、作用：添加小牛血清的作用：1 1、提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因、提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素；子和激素；2 2、提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展、提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子；因子；3 3、提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结、提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白；合蛋白；4 4、提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素。、提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素。18 3 3、无血清培养基、无血清培养基 无血清培养基在天然或合成培养基的基础上添无血清培养基在天然或合成培养基的基础上添加激素、生长因子、结合蛋白、贴附和伸展因加激素、生长因子、结
13、合蛋白、贴附和伸展因子及其他元素。子及其他元素。优点：增加确定性；性能更一致；供应充足、优点：增加确定性；性能更一致；供应充足、稳定；容易进行纯化和下游加工提高制品安全稳定；容易进行纯化和下游加工提高制品安全性和产量。性和产量。19培养基的性质培养基的性质 1.pH1.pH：哺乳类动物细胞生长需要合适的酸碱度，多：哺乳类动物细胞生长需要合适的酸碱度，多为为7.27.27.4,7.4,不超过不超过6.86.87.67.6范围，同时范围，同时pHpH值的测值的测定也可以检查培养基的批间差异定也可以检查培养基的批间差异 2.2.渗透压：细胞必须生活在合适的渗透压环境中渗透压：细胞必须生活在合适的渗透
14、压环境中（690690850kPa850kPa）；同时渗透压值的测定也可以检）；同时渗透压值的测定也可以检查培养基的批间差异查培养基的批间差异 3.3.温度：哺乳动物多为温度：哺乳动物多为36.536.5 0.50.5 4.4.黏度：黏度：CMCCMC和聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯吡咯烷酮 5.5.表面张力和泡沫表面张力和泡沫20四、细胞培养过程的检测四、细胞培养过程的检测 （一）细胞生长的检测（一）细胞生长的检测 细胞计数（血小板计数器）细胞计数（血小板计数器）细胞常规检查（污染与否、细胞常规检查（污染与否、pHpH）生长情况、细胞形态、营养液、污染和细胞活性（死细胞着色生长情况、细胞形态、营养液
15、、污染和细胞活性（死细胞着色 计数）计数）生物学检查和鉴定生物学检查和鉴定 支原体污染检查支原体污染检查 21 细胞生长过程细胞生长过程 每代贴附生长细胞的生长过程：游离期、贴壁期、潜每代贴附生长细胞的生长过程：游离期、贴壁期、潜伏期、对数生和长期停止期（平台期）。伏期、对数生和长期停止期（平台期）。（1 1）游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态也）游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。1010分钟分钟-4-4小时。小时。（2 2）贴壁期：细胞附着于底物上，游离期）贴壁期：细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞结
16、束。细胞株平均在株平均在1010分钟分钟-4-4小时贴壁。小时贴壁。底物：胶原、玻璃、底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等塑料、其它细胞等.血清中有促使细胞贴壁的和纤粘血清中有促使细胞贴壁的和纤粘素、胶原等糖蛋白，这些糖蛋白的促贴壁因子先吸附素、胶原等糖蛋白，这些糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。22（3 3）潜伏期：此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。）潜伏期：此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为细胞株潜伏期一般为6 62424小时。小时。（4 4）对数生长期：）对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长
17、，细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。活力最佳，最适合进行实验研究。（5 5）停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽）停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。有活力但不再分裂。23培养物污染的预防培养物污染的预防 细菌、真菌、病毒或细胞均可导致培养物污染。生物细菌、真菌、病毒或细胞均可导致培养物污染。生物的组织材料、操作者自身、培养基、各种器皿、甚至的组织材料、操作者自身、培养基、各种器皿、甚至环境均可引起污染。显著污染的标志是培养基环境均可引起污染。显著污染的标志是培养基PHPH值迅值迅速改变、外形模糊、甚至出观漂浮的集落。速改变、外形模糊、甚至出观漂
18、浮的集落。常用抗生素：青霉素（常用抗生素：青霉素（200200单位单位/mLmL）；卡那霉素）；卡那霉素（200ug/mL200ug/mL）。）。支原体污染的控制：抗生素处理；支原体血清处理；支原体污染的控制：抗生素处理；支原体血清处理；高热处理高热处理24 防止交叉污染。从事体外细胞培养的工作者都防止交叉污染。从事体外细胞培养的工作者都必须遵循这样一个原则：在任何时间，在一个必须遵循这样一个原则：在任何时间，在一个工作区中决不能有一种以上的细胞系的细胞同工作区中决不能有一种以上的细胞系的细胞同时存在。一种细胞系的细胞所用的培养基、器时存在。一种细胞系的细胞所用的培养基、器皿、移液管等决不能为
19、另一种细胞系的细胞所皿、移液管等决不能为另一种细胞系的细胞所移用。一旦在同质的细胞群中出现不同形态的移用。一旦在同质的细胞群中出现不同形态的集落，则应怀疑是否发生了细胞污染，且用染集落，则应怀疑是否发生了细胞污染，且用染色体组型及同功酶组型鉴定。色体组型及同功酶组型鉴定。25（二）细胞培养工艺控制（二）细胞培养工艺控制 1.1.温度控制：采用铅电阻温度计控制温度控制：采用铅电阻温度计控制 2.pH2.pH与溶解氧控制：碳酸氢盐缓冲溶液，另外可与溶解氧控制：碳酸氢盐缓冲溶液，另外可以通过通以通过通COCO2 2,O,O2 2控制。控制。3.3.葡萄糖和乳酸检测葡萄糖和乳酸检测 4.4.产物的收集
20、和检测产物的收集和检测26五、动物细胞培养方法和操作方式五、动物细胞培养方法和操作方式 根据不同的需要将离体培养的细胞分为三类：根据不同的需要将离体培养的细胞分为三类：1 1、贴壁细胞、贴壁细胞 生长时必须要有给以贴附的支持物表面，细胞依生长时必须要有给以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长和繁殖，在培养过程中，随着培养该表面上生长和繁殖，在培养过程中，随着培养条件的变化细胞形态也会发生改变。条件的变化细胞形态也会发生改变。27 2 2、悬浮细胞、悬浮细胞 生长不依赖支持物表面，在培养液中悬浮生长，生长不依赖支
21、持物表面，在培养液中悬浮生长，如淋巴细胞等。如淋巴细胞等。3 3、兼性贴壁细胞、兼性贴壁细胞 根据生长条件的不同可贴壁也可悬浮生长，中国根据生长条件的不同可贴壁也可悬浮生长，中国地鼠卵巢细胞。地鼠卵巢细胞。281.1.细胞培养方法细胞培养方法 1)1)悬浮培养悬浮培养 优点：操作简单、培养条件均一、传质和传氧比较好，优点：操作简单、培养条件均一、传质和传氧比较好，容易扩大培养规模，可借鉴细菌发酵的经验。缺点：容易扩大培养规模，可借鉴细菌发酵的经验。缺点：体积小，较难采用灌流培养。常用反应器为搅拌和气体积小，较难采用灌流培养。常用反应器为搅拌和气升式升式 2)2)贴壁培养贴壁培养 优点：适用的细
22、胞种类多，较容易采用灌流培养，达优点：适用的细胞种类多，较容易采用灌流培养，达到高密度细胞。缺点：操作比较复杂，需要合适的贴到高密度细胞。缺点：操作比较复杂，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差。氧较差。29 3)3)固定化培养固定化培养（1 1）吸附培养）吸附培养 细胞贴附于支持物表面细胞贴附于支持物表面 （2 2）共价贴附）共价贴附 化学键结合化学键结合（3 3）离子）离子/共价交联共价交联（4 4）包埋和微囊培养，包埋或包裹在凝胶载体和微囊）包埋和微囊培养，包埋或包裹在凝胶载体和微囊内的细胞可获得保护，避免了剪切力
23、的损害；可以获得内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害；可以获得较高的细胞密度；通过控制微囊膜的孔径可使产品浓缩较高的细胞密度；通过控制微囊膜的孔径可使产品浓缩在微囊内有利于下游处理；可采用多种生物反应器进行在微囊内有利于下游处理；可采用多种生物反应器进行大规模培养大规模培养 302.2.细胞培养的操作方式细胞培养的操作方式 1 1）分批式培养操作）分批式培养操作 2 2）流加式培养操作）流加式培养操作 3 3）半连续式培养操作）半连续式培养操作 4 4）连续式培养操作）连续式培养操作 5 5）灌注式培养操作）灌注式培养操作31六、动物细胞培养的应用六、动物细胞培养的应用 1.1.用于生物制品
24、的生产：用于生物制品的生产：如病毒疫苗、干扰素、单克如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体隆抗体 2.2.基因工程中受体细胞的培养：基因工程中受体细胞的培养：选用合适宿主、改变选用合适宿主、改变细胞的某些酶基因、改进控制培养条件使产物正确糖细胞的某些酶基因、改进控制培养条件使产物正确糖基化。基化。3.3.组织工程研究组织工程研究:通过对细胞大量培养，并用细胞直接通过对细胞大量培养，并用细胞直接作为一种治疗手段用于临床，或用细胞进一步加工构作为一种治疗手段用于临床，或用细胞进一步加工构成一种组织，如皮肤、肝脏、胰腺等用于临床治疗。成一种组织，如皮肤、肝脏、胰腺等用于临床治疗。32第二节第二节 植物细胞培
25、养制药技术植物细胞培养制药技术 植物细胞培养：指在离体条件下，将愈伤组织或植物细胞培养：指在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的的组织置于液体培养基中，进行振其他易分散的的组织置于液体培养基中，进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过传代荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过传代培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞群体的一培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞群体的一种技术。种技术。一、概述一、概述33 植物细胞培养流程植物细胞培养流程 34二二 、植物细胞培养的特性与营养、植物细胞培养的特性与营养 （一）植物细胞的特性（一）植物细胞的特性 1.1.植物细胞的组成植物细胞的组成 植物细胞由细胞壁
26、和原生质体组成，原生质体包括植物细胞由细胞壁和原生质体组成，原生质体包括 细细胞质、细胞核和液泡。胞质、细胞核和液泡。2.2.细胞后含物和生理活性物质细胞后含物和生理活性物质 细胞中除含有生命物质原生质体外，还有许多非生命物细胞中除含有生命物质原生质体外，还有许多非生命物质，细胞的代谢产物，一类是后含物，储藏物质，分布于质，细胞的代谢产物，一类是后含物，储藏物质，分布于液泡内，生物碱、糖类、苷、盐类、有机酸、挥发油等，液泡内，生物碱、糖类、苷、盐类、有机酸、挥发油等，另一类是生理活性物质，对细胞内生化代谢和生理活动起另一类是生理活性物质，对细胞内生化代谢和生理活动起着调节作用。着调节作用。35
27、 3.3.细胞的全能性细胞的全能性:即单一的离体细胞在即单一的离体细胞在一定的环境条件一定的环境条件下下能分化成不同细胞组织乃至整个植株的能力。能分化成不同细胞组织乃至整个植株的能力。4.4.细胞分化：是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变细胞分化：是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。细胞分化也可以说是相同或潜在发育方式改变的过程。细胞分化也可以说是相同基因型的细胞所具有的各个不同的表现型。基因型的细胞所具有的各个不同的表现型。它包括：它包括：时间上的分化：一个细胞在不同的发育阶段上可以有不时间上的分化：一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态结构和功能；空间上的
28、分化：对于多细胞生物同的形态结构和功能；空间上的分化：对于多细胞生物来讲，同一细胞后代，由于所处的环境不同而可以有相来讲，同一细胞后代，由于所处的环境不同而可以有相异的形态结构和功能。异的形态结构和功能。5.5.脱分化脱分化：植株上已经分化的细胞或组织离体后在培养条：植株上已经分化的细胞或组织离体后在培养条件下逐渐恢复到分生状态的过程。细胞脱分化的结果通件下逐渐恢复到分生状态的过程。细胞脱分化的结果通常是形成常是形成愈伤组织愈伤组织（未分化的细胞团）。（未分化的细胞团）。36植物细胞培养的特性植物细胞培养的特性 植物细胞重量的增加主要在植物细胞重量的增加主要在对数期，对数期，次级代谢产物的累积
29、主次级代谢产物的累积主要在要在稳定期。稳定期。与动物细胞培养类同，生长速率慢，为防止培与动物细胞培养类同，生长速率慢，为防止培养过程中染菌，养过程中染菌，需加抗生素；需加抗生素；细胞大，细胞壁以纤维素为主要成分，表现为抗张力强度大，细胞大，细胞壁以纤维素为主要成分，表现为抗张力强度大，抗剪切力能力小。植物细胞常生长成各种大小的团块，增加抗剪切力能力小。植物细胞常生长成各种大小的团块，增加了悬浮培养的难度等。了悬浮培养的难度等。细胞培养需氧，但培养时不需要很高的气液传质速率，而是细胞培养需氧，但培养时不需要很高的气液传质速率，而是要控制氧量，以保持较低的溶氧水平要控制氧量，以保持较低的溶氧水平
30、泡沫性质不同于发酵，气泡大，黏度也大，通常要采用化学泡沫性质不同于发酵，气泡大，黏度也大，通常要采用化学或机械方法加以控制。或机械方法加以控制。产物在细胞内且产量低。产物在细胞内且产量低。37（二）植物细胞的营养成分及其培养基（二）植物细胞的营养成分及其培养基 培养基的成分由无机盐类、碳源、维生素、植物生长培养基的成分由无机盐类、碳源、维生素、植物生长激素、有机氮源、有机酸和一些复合物质组成。激素、有机氮源、有机酸和一些复合物质组成。1.1.无机盐无机盐 有大量元素和微量元素，有大量元素和微量元素，30 30 毫克每升为界限，大量毫克每升为界限，大量有氮、硫、磷、钾、镁、钙、氯、钠。微量有铁、
31、锰、有氮、硫、磷、钾、镁、钙、氯、钠。微量有铁、锰、碘、钼、铜、锌。碘、钼、铜、锌。2 2、有机质、有机质 有机营养物质（提供有机营养物质（提供C C、H H、O O和和N N）生理活性物质生理活性物质38 3 3、植物生长调节剂、植物生长调节剂 植物激素是植物代谢过程中形成的生长调节物质，植物激素是植物代谢过程中形成的生长调节物质，在极低浓度（小于在极低浓度（小于 1 1 微摩尔）时即能调节植物的微摩尔）时即能调节植物的生育过程，并能从合成部位转运到作用部位而发生育过程，并能从合成部位转运到作用部位而发挥作用。挥作用。常见的植物激素有常见的植物激素有生长素、分裂素、赤霉素、脱生长素、分裂素、
32、赤霉素、脱落酸、乙烯。落酸、乙烯。植物组织和细胞培养物的生长过程植物组织和细胞培养物的生长过程主要取决于生长素和分裂素的比例，比值高可刺主要取决于生长素和分裂素的比例，比值高可刺激细胞分裂，比值低则刺激细胞生长。激细胞分裂，比值低则刺激细胞生长。39 4.4.附加物：琼脂、蔗糖、活性碳等，非必须，但附加物：琼脂、蔗糖、活性碳等，非必须，但对生长有利。对生长有利。5.5.成分未知的天然汁液成分未知的天然汁液,提供必要的微量营养成分、提供必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素物质。生理活性物质和生长激素物质。40选择培养基的原则：选择培养基的原则：需要根据不同培养对象、培养目的及培养条件探需要
33、根据不同培养对象、培养目的及培养条件探索适宜培养基。索适宜培养基。选择的培养基在培养过程使细胞总体积倍增时间选择的培养基在培养过程使细胞总体积倍增时间1 1天左右为宜。天左右为宜。培养基的配制过程：母液配制、混合、稀释、培养基的配制过程：母液配制、混合、稀释、pHpH调调节、分装、包扎、灭菌。节、分装、包扎、灭菌。41（三）植物细胞的培养（三）植物细胞的培养 植物细胞培养的基本步骤植物细胞培养的基本步骤（1 1）植物材料的准备和清洗、消毒等）植物材料的准备和清洗、消毒等 用于植物组织培养的外植体必须无菌。用于植物组织培养的外植体必须无菌。常用表面灭菌试剂的特点是灭菌后易于除去或容易分解的试剂，
34、常用表面灭菌试剂的特点是灭菌后易于除去或容易分解的试剂，根据所处理材料对灭菌试剂的敏感性选择适当的处理时间。常根据所处理材料对灭菌试剂的敏感性选择适当的处理时间。常用灭菌试剂有用灭菌试剂有次氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞。次氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞。次氯酸钙为工业漂白粉过滤后的饱和溶液，适用于草本植物和次氯酸钙为工业漂白粉过滤后的饱和溶液，适用于草本植物和柔软组织的灭菌处理，时间为柔软组织的灭菌处理，时间为5-305-30分。分。氯化汞灭菌效果好，但不易除去，时间不易过长，以免杀死植氯化汞灭菌效果好，但不易除去，时间不易过长，以免杀死植物细胞，当其用于休眠种子的灭菌剂最为理想，适用浓度为物细胞，当其
35、用于休眠种子的灭菌剂最为理想，适用浓度为 0.1%0.1%，2-10 2-10 分钟，种子皮较厚时可延长至分钟，种子皮较厚时可延长至 20 20分以上。分以上。42（2 2）准备培养基）准备培养基 培养基是指人工配制的含有营养培养基是指人工配制的含有营养 物质物质供培养物生长分化的介质。通常含无机营养物质供培养物生长分化的介质。通常含无机营养物质(大量元大量元素和微量元素素和微量元素)、碳源、碳源(1%-4%(1%-4%蔗糖蔗糖)、生长调节剂以及有、生长调节剂以及有机附加物机附加物(维生素、甘氨酸维生素、甘氨酸)等几类物质组成。等几类物质组成。（3 3）接种）接种 在无菌条件下操作，把材料放进
36、培养基在无菌条件下操作，把材料放进培养基43（4 4）愈伤组织的培养和诱导）愈伤组织的培养和诱导愈伤组织：原指植物体的局部受到创伤刺激后，在愈伤组织：原指植物体的局部受到创伤刺激后，在 伤伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成。在离体口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成。在离体培养条件下，外植体中的活细胞经诱导脱分化，恢复培养条件下，外植体中的活细胞经诱导脱分化，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织 愈伤组织类型：愈伤组织类型：结构致密型：表面光滑有光泽，结构致密，多为淡
37、结构致密型：表面光滑有光泽，结构致密，多为淡黄色或白色，易于再生芽黄色或白色，易于再生芽 结构松散型：多为白色，可以用于悬浮系建立结构松散型：多为白色，可以用于悬浮系建立44（5 5）诱导产生器官或体细胞胚）诱导产生器官或体细胞胚 调节培养基营养组织营养成分组成，愈伤组织调节培养基营养组织营养成分组成，愈伤组织在传代培养若干代后，产生细胞团在传代培养若干代后，产生细胞团(器官原基器官原基),),该细胞群能适应进一步的的悬浮培养，形成器官该细胞群能适应进一步的的悬浮培养，形成器官（先芽后根），从而建立稳定的悬浮培养植物细（先芽后根），从而建立稳定的悬浮培养植物细胞系胞系（6 6）移栽）移栽454
38、6三三.植物细胞培养的类型与技术植物细胞培养的类型与技术 根据所处状态的不同，分为悬浮培养与固定化植根据所处状态的不同，分为悬浮培养与固定化植物细胞培养法。物细胞培养法。悬浮培养法悬浮培养法 分批培养法分批培养法半连续培养法半连续培养法连续培养法连续培养法 固定化培养法固定化培养法 包埋技术包埋技术吸附技术吸附技术共价结合技术共价结合技术471.1.分批培养法分批培养法 与微生物的分批培养类同。由于操作简单，从实验室到与微生物的分批培养类同。由于操作简单，从实验室到大型罐广泛应用。大型罐广泛应用。分批培养中，植物细胞的生长曲线一般呈分批培养中，植物细胞的生长曲线一般呈S S型，可明显型，可明显
39、观察出诱导期、对数生长期、减速期、静止期和衰亡期。观察出诱导期、对数生长期、减速期、静止期和衰亡期。但是与细菌和酵母菌的培养相比，即使是生长速率快的但是与细菌和酵母菌的培养相比，即使是生长速率快的烟草细胞，分批培养时间（一个周期）也要烟草细胞，分批培养时间（一个周期）也要6 6天以上，天以上，生长缓慢。生长缓慢。主要采用气升式反应器，其培养过程用通气代替搅拌，主要采用气升式反应器，其培养过程用通气代替搅拌，细胞产量高。细胞产量高。48 生物种类生物种类 (h-1)平均世代时间平均世代时间(h)烟草烟草 0.0320.044 421.717.3 番茄番茄 0.0140.026 49.526.7
40、胡萝卜胡萝卜 0.021 33.0 酿酒酵母酿酒酵母 0.50.65 1.391.07 红曲霉红曲霉 0.125 5.54 植物与微生物细胞生长速率的比较植物与微生物细胞生长速率的比较49 目前，无论在实验室还是在工厂中，大至目前，无论在实验室还是在工厂中，大至2020吨罐，广泛吨罐，广泛采用分批式操作。采用分批式操作。藤田开发的二步培养法是分批培养法的一种变形，同时藤田开发的二步培养法是分批培养法的一种变形，同时使用两个反应器，使用两个反应器，第一个反应器主要是为大量培养细胞第一个反应器主要是为大量培养细胞，即使用生长培养基使细胞大量增殖，达到了一定的细胞密即使用生长培养基使细胞大量增殖，达
41、到了一定的细胞密度。度。第二个反应器是为增加目的产物的含量第二个反应器是为增加目的产物的含量。改用适合细。改用适合细胞产物积累的培养基，促进细胞启动，次级代谢途径并提胞产物积累的培养基，促进细胞启动，次级代谢途径并提高产物的产量。高产物的产量。分批培养中，在一定范围内增加底物浓度，可增加目的分批培养中，在一定范围内增加底物浓度，可增加目的产物的产量，但浓度过高又会造成接种细胞的死亡。产物的产量，但浓度过高又会造成接种细胞的死亡。502.2.半连续培养法半连续培养法 在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称分培养液和
42、新鲜培养液进行交换的培养方法称之为半连续培养法。之为半连续培养法。反应过程通常以一定时间间隔进行数次反复操反应过程通常以一定时间间隔进行数次反复操作以达到培养细胞与生产有用物质的目的。作以达到培养细胞与生产有用物质的目的。513.3.连续培养法连续培养法 采用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时采用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞与培养液，并以间后，以一定速度连续采集细胞与培养液，并以同样速度供给新鲜培养基，此种培养方式可使细同样速度供给新鲜培养基，此种培养方式可使细胞生长环境长期维持恒定。胞生长环境长期维持恒定。连续培养法细胞生产能力一般较分批法高，但因连
43、续培养法细胞生产能力一般较分批法高，但因细胞生长缓慢，培养时间长，要维持系统无菌状细胞生长缓慢，培养时间长，要维持系统无菌状态，技术条件要求相当苛刻。态，技术条件要求相当苛刻。524.4.固定化培养法固定化培养法 固定化培养采用固定化反应器，这类反应器有网状多固定化培养采用固定化反应器，这类反应器有网状多孔板、尼龙网套及中空纤维膜等形式。将细胞固定在孔板、尼龙网套及中空纤维膜等形式。将细胞固定在尼龙网套内或固定于中空纤维膜反应器的膜表面，或尼龙网套内或固定于中空纤维膜反应器的膜表面，或固定于网状多孔板上，放在培养液中进行培养，可通固定于网状多孔板上，放在培养液中进行培养，可通入净化空气代替搅拌
44、。入净化空气代替搅拌。固定化培养法的优点在于细胞位置固定，易于获得高固定化培养法的优点在于细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体及建立细胞间物理学和化学联系，维持密度细胞群体及建立细胞间物理学和化学联系，维持细胞间物理化学梯度，易于控制培养条件及获得次生细胞间物理化学梯度，易于控制培养条件及获得次生产物。产物。53 常用固化剂有琼脂、明胶、藻酸盐、羟乙基纤维素。常用固化剂有琼脂、明胶、藻酸盐、羟乙基纤维素。培养温度为培养温度为 25 25左右，常需光照。由于植物组织在左右，常需光照。由于植物组织在培养基上生长时要不断消耗养分、散失水分和累积代培养基上生长时要不断消耗养分、散失水分和累积代谢产物，
45、因此外植体在培养周左右必须移至新鲜培养谢产物，因此外植体在培养周左右必须移至新鲜培养基上，以保持继续生长。基上，以保持继续生长。移换一次培养基成为一次继代培养，经过一定次数的移换一次培养基成为一次继代培养，经过一定次数的继代培养，其培养物可用于悬浮培养。继代培养，其培养物可用于悬浮培养。54 优点：简便易行、所占空间小优点：简便易行、所占空间小 缺点：是外植体或愈伤组织仅有一部分与培养基缺点：是外植体或愈伤组织仅有一部分与培养基接触，培养基中产生浓度差，愈伤组织生长不平接触，培养基中产生浓度差，愈伤组织生长不平衡；外植体基部插入培养基中，该处气体交换不衡；外植体基部插入培养基中，该处气体交换不
46、畅阻碍了组织呼吸正常进行，会堆积生长过程中畅阻碍了组织呼吸正常进行，会堆积生长过程中的有害物质；在愈伤组织细胞间出现极化现象，的有害物质；在愈伤组织细胞间出现极化现象，细胞群体不均一。细胞群体不均一。55四、影响植物次级代谢物累积的因素四、影响植物次级代谢物累积的因素 1 1、组织来源：外植体、季节、休眠、分化等；、组织来源：外植体、季节、休眠、分化等；2 2、化学培养条件：无机盐、碳源、物质生长调节、化学培养条件：无机盐、碳源、物质生长调节剂、维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物质剂、维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物质和前体等；和前体等；3 3、物理条件：温度、光（光照时间、光强、光、物
47、理条件：温度、光（光照时间、光强、光质）、通气（氧气）、质）、通气（氧气）、pHpH和渗透压和渗透压561.1.组织来源组织来源 外植体直接影响所诱导的组织和细胞的生长，外植体直接影响所诱导的组织和细胞的生长，而且也关系到其次级代谢产物的生产能力。外而且也关系到其次级代谢产物的生产能力。外植体的前处理也可严重影响次级代谢产物的累植体的前处理也可严重影响次级代谢产物的累积方式。积方式。一定培养条件下不同植物细胞及同一植株不同一定培养条件下不同植物细胞及同一植株不同部位细胞生长速度不同，次生物产率也不同，部位细胞生长速度不同，次生物产率也不同，应选择生长速度快及次生物产率高的细胞为培应选择生长速度
48、快及次生物产率高的细胞为培养材料。养材料。572.2.化学培养条件化学培养条件 1 1）培养基的组成，基本培养基的各种成分是愈伤）培养基的组成，基本培养基的各种成分是愈伤组织和悬浮细胞培养的物质基础。组织和悬浮细胞培养的物质基础。碳源：自养培养的二氧化碳和异养培养的糖类，碳源：自养培养的二氧化碳和异养培养的糖类，性质和数量往往对培养细胞的生物量有很大的影性质和数量往往对培养细胞的生物量有很大的影响。糖的作用有：延长稳定期；通过蔗糖分解后响。糖的作用有：延长稳定期；通过蔗糖分解后的产物（葡萄糖）所产生的对内源性生长素合成的产物（葡萄糖）所产生的对内源性生长素合成的抑制作用；增强戊糖磷酸化途径有关
49、酶的活性的抑制作用；增强戊糖磷酸化途径有关酶的活性 磷：低磷会导致次级代谢产物的累积，缺乏磷会磷：低磷会导致次级代谢产物的累积，缺乏磷会导致生物量的大幅度降低。导致生物量的大幅度降低。58 氮：硝酸盐、铵盐、有机氮源。如天冬氨酸、尿素、酪蛋氮：硝酸盐、铵盐、有机氮源。如天冬氨酸、尿素、酪蛋白水解物或蛋白胨白水解物或蛋白胨 铜：作为邻及对铜：作为邻及对-二酚可抗坏血酸氧化酶活性基团的作用，二酚可抗坏血酸氧化酶活性基团的作用，是次级代谢产物累积的必要元素，还可作为非生物诱导子。是次级代谢产物累积的必要元素，还可作为非生物诱导子。生长调节物质：其种类和数量对培养细胞的生长、分化和生长调节物质：其种类
50、和数量对培养细胞的生长、分化和次生代谢产物的产量有很大影响。次生代谢产物的产量有很大影响。(2)(2)诱导子诱导子:植物抗毒素是在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某植物抗毒素是在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物，有些时候连续合成，或仅在被诱导下其些次级代谢产物，有些时候连续合成，或仅在被诱导下其产量才能增加。触发形成植物抗毒素信号的物质称为诱导产量才能增加。触发形成植物抗毒素信号的物质称为诱导子，能够诱导植物细胞中的一个反应，并能形成特征性自子，能够诱导植物细胞中的一个反应，并能形成特征性自身防御反应的分子。身防御反应的分子。593.3.物理培养条件的影响物理培养条件的影响（1
