1、 自1886年M.W.Beijerinck分离到能共生固氮的根瘤菌后，人们共发现了50多属100多种生物有固氮能力，这些生物均为原核生物。按其固氮方式可分为3种类型：能独立固氮的微生物称为自生固氮菌；必须与其他生物共生才能固氮的微生物称为共生固氮菌；必须生活在植物根际、叶面或肠道等处才能固氮的微生物称为联合固氮菌。自生固氮菌 好氧化能异养：固氮菌属(Azotobacter)拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)固氮单胞菌属(Azomonas)固氮球菌属(Azococcus)德克斯氏菌属(Derxia)黄色分枝杆菌(Mycobacterium flavum)自养棒杆菌(Corynebacte
2、rium autotrophicum)产脂螺菌(Spirillum lipoferum)甲烷氧化菌等 化能自养：氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferroxidans 光能自养：念珠蓝菌属(Nostoc)鱼腥蓝菌属(Anabaena)着色菌属(Chromatium)绿假单胞菌属(Ch loropseudomonas)微好氧(化能异养)：棒杆菌属(Corymebact erium)固氮螺菌属(Azospirillum)兼性厌氧化能异养：克雷伯氏菌属(Klebsiella)无色杆 菌属(Achromobacter)多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)柠檬酸杆菌属(Cit r
3、obacter)欧文氏菌属(Erwinia)肠杆菌属(Enterobacter)光能异养：红螺 菌属(Rhodospirillum)红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)厌氧化能异养：巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)脱硫弧菌属(Desulforibrio)脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)共生固氮菌根瘤豆科植物：根瘤菌属(Rhizobium)非豆科植物：弗兰克氏菌属放线菌(Frankia)白蚁等动物肠道：肠杆菌属(Enterobacter)植物地衣：念珠蓝菌属(Nostoc)鱼腥蓝菌属(Anabaena)(单歧蓝菌属)等(Tolypothri
4、x)满江红：满江红鱼腥蓝菌(Anabaena azollae)苏铁珊瑚根：Nostoc,A nabaena肯乃拉草：Nostoc联合固氮菌 根际温带：Bacillus，Klebsiella 热带：雀稗固氮菌(Azotobacter paspali)，Azospirillum,Beijerinckia 叶面：Beijerinckia,Azoto bacter 固氮酶固氮酶：生物固氮反应的核心。1960年，J.E.Carnahan从巴氏梭菌(Clost ridium pasteurianum)中获得了具有固氮活性的无细胞抽提液，实现了分子氮还原为NH3 的实验。1966年，L.Mortenson从
5、巴氏梭菌(C.Pasteurianum)和维涅兰德固氮菌(Azotobacte r vinelandii)的无细胞抽提液中，分离出两种固氮蛋白钼铁蛋白和铁蛋白，使固氮研究进入分子水平。固氮反应的必要条件：固氮反应的必要条件：大量ATP 还原力NAD(P)H2 固氮酶 N2 Mg2+严格的厌氧微环境 固定1mol N2需要消耗1015molATP。这些ATP由呼吸、发酵或光合磷酸化过程提供。从不同生理类型的固氮微生物细胞中抽提到的固氮酶具有相同结构，它们均含、两种组分。组分为钼铁蛋白(MF)或钼铁氧还蛋白(MoFd)，是真正的“固氮酶”；组分为铁蛋白(F)，是固氮酶还原酶。固氮酶的固氮酶的、两种
6、组分两种组分 项目 组分 组分 蛋白质亚基数 4(2大2小)2(相同)分子量 22万左右 六万左右 Fe原子数 30(2432)4 不稳态S原子数 28(2032)4 Mo原子数 2 0 Cys的SH基数 3234 12 活性中心 铁钼辅因子(FeMoCo)电子活化中心(Fe4S4)功能 络合、活化和还原N2 传递电子到组分上 固氮酶活力测定：固氮酶活力测定：测定固氮酶活力的经典方法有微量K氏定氮法和同位素法，但前者精度低，后者程序复杂。1966年，M.J.Dilworth等发表了灵敏简便的乙炔还原法，促进了固氮酶活性及固氮机理研究。该法的理论依据是：固氮酶除了能催化N2 NH 3外，还能催化
7、C2H2(乙炔)C2H2(乙烯)及2H+H2等多种反应。乙炔还原反应中产生的乙烯及底物乙炔即使浓度很低，也能方便地用气相色谱仪测定。该测定方法灵敏度高、设备简单、成本低及操作简便，可用于纯酶制剂及自然固氮生态体系的固氮活力测定。固氮的生化途径固氮的生化途径 固氮总反应式为：N2+6e+6H+12ATP 2NH3+12ADP+12Pi N2分子经固氮酶催化还原为NH3，再通过转氨途径形成各种氨基酸。固氮酶除具有固氮功能外，还能催化2H+H2。在缺N2条件下，固氮酶可将H+全部还原为H2；在有N2条件下，固氮酶将75%的NAD(P)H2用于N2的还原，另外25%的NAD(P)H2形成H2浪费掉。但
8、在大多数固氮菌中，含有氢酶，可将固氮催化形成的无效H2重新转化为NAD(P)H2和ATP。图氮的生化途径 图氮的生化途径 N2经根瘤菌被植物吸收 固氮酶的两个蛋白组分对氧极端敏感，一旦遇氧就可发生不可逆失活。组分(铁蛋白)在空气中暴露45秒其酶活丧失一半，组分在空气中的活性半衰期约为10min。不同固氮微生物的钼铁蛋白具有不同的氧敏感性。大多数固氮菌为好氧菌，它们需要氧气进行呼吸和产能。固氮菌在长期的进化中形成了许多巧妙的机制，解决了细胞 需氧和固氮酶厌氧的矛盾。不同固氮菌钼铁蛋白的氧敏感性不同固氮菌钼铁蛋白的氧敏感性 名称 半衰期(min)大豆根瘤菌 4.5 肺炎克雷伯氏菌 8.0 维涅兰德
9、氏固氮菌 10.0 圆褐固氮菌 10.0 巴氏梭菌 60 好氧自生固氮菌的保护机制：好氧自生固氮菌的保护机制：抗氧方式主要有两种：呼吸保护和构象保护。固氮菌以较强的呼吸作用迅速将周围环境中的氧消耗掉，使细胞周围微环境处于低氧态，以保护固氮酶不受氧损伤，该抗氧方式称为呼吸保护。本机制存在的证据：属于固氮菌科(Azotobacterlaceae)的固氮菌都具有特别高的呼吸强度。例如，把生长在低氧分压下的A.vinelandii突然转移到高氧分压下培养时，其呼吸强度和NADPH2脱氢酶活性同时增高，细胞色素a2的含量增加，而氧化磷酸化的效率却明显降低。其原因在于细胞动用了一套消耗碳源除氧以保护固氮酶
10、 的呼吸系统。构象保护指固氮菌处于高氧分压环境下时，其固氮酶能形成一个无固氮活性但能防止氧损伤的特殊构象。该构象是由固氮酶与蛋白质或磷脂等稳定因子结合形成的。呼吸与构象两种保护互相协调，形成“双保险”机制。在一般含氧条件下，呼吸保护就可除去多余氧；若还有 过量分子氧，可利用构象保护使固氮酶免遭损害。蓝细菌的固氮酶保护：蓝细菌的固氮酶保护：蓝细菌是放氧光合生物。在光照下，通过光合作用放氧使细胞内的氧浓度增高。两种防氧措施：异形胞抗氧和非异形胞抗氧 异形胞抗氧机制：异形胞为一种特化细胞，个体较营养细胞大，细胞外有一层由糖脂组成的较厚的外膜，该膜具有防止氧气扩散进入细胞的物理屏障功能；异形胞内缺少产
11、氧光合系统，脱氢酶与氢酶活性高，使异形胞内维持在很强的还原态；胞内超氧化物歧化酶SOD(Superoxide dismutase)活性很高，有解除氧毒害的功能；异形胞比相邻营养细胞的呼吸强度高2倍，可通过呼吸消耗过多的O2并产生固氮所需ATP。非异形胞抗氧有多种形式：利用时间差解决固氮酶厌氧和光合放氧的矛盾，即在黑暗下固氮，在光照下进行光合作用(织线蓝细菌属)；提高细胞内SOD和过氧化物酶活性，消除有毒过氧化物，保护固氮酶活性(粘球粘细菌属)。根瘤菌固氮酶的保护：根瘤菌固氮酶的保护：根瘤菌分为豆科根瘤菌与非豆科根瘤菌两种类型。豆科根瘤菌以只能生长不能分裂的类菌体(bacteroids)形式存在
12、于豆科植物的根瘤中。许多类菌体被包裹在一层类菌体周膜中，膜内具有良好的氧、氮和营养条件。最重要的是在周膜内外存在着独特的豆血红蛋白(leghaemoglobin)。该蛋白具有极强的吸氧能力，可使近血红蛋白处的氧浓度比周围环境降低8万倍，以防止类菌体周围氧浓度过高使固氮酶失活。豆血红蛋白犹如氧缓冲剂，可调节根瘤中氧的浓度，使其稳定在固氮酶的最适范围内。豆血红蛋白的蛋白质部分由根瘤菌触发，植物基因编码合成；血红素由植物触发，根瘤菌基因编码合成。1973年发现，在一种生长于非州的非豆科植物榆科糙叶山黄麻(Parasponia)的根瘤中存在着豇豆根瘤菌，根瘤中无豆科植物根瘤中常见的豆血红蛋白，但却含有与豆血红蛋白功能相似的植物血红蛋白，保护着固氮酶不受氧之危害。在赤杨、杨梅及木麻黄等非豆科木本植物的根瘤中，存在着与之共生的弗兰克(Frankia)放线菌。该菌的营养菌丝未端有一膨大的球形囊泡囊，固氮反应在泡囊中进行。泡囊的固氮功能及防氧机制与蓝细菌的异形胞相似。
