1、第三节第三节 外植体的取材与培养外植体的取材与培养外植体的取材与培养第三节第三节外植体的选择一一三三外植体灭菌二二外植体的接种及培养四四培养中的常见问题及对策原生质体培养原生质体培养1.外植体的概念外植体（explant）：用于离体培养的活的植物组织、器官等材料，是植物离体培养的基础材料。（Ex-plant离开植物体的一部分）一、外植体的选择一、外植体的选择生长在自然环境中的植物控制环境条件下生长的植物无菌环境下已经离体培养的植物2.2.外植体的来源外植体的来源不同植物以及同一植物各个不同部位的组织、器官，其形态发生能力都可能因植株的年龄、季节及生理状态等而有很大不同根据培养需求，应选取最易表
2、达全能性的部位做为外植体，从而增加成功的机会3.3.外植体的选择外植体的选择取材的部位取材的部位不同植物、不同部位组织的形态发生能力不同茎尖在植物组织培养中普遍采用的外植体，其分生能力强、生长速度快，也是获得脱毒苗的重要途径一般顶芽生长势比侧芽旺，比较容易成往往受到材料来源的限制例：许多兰科植物、石刁柏、非洲菊等叶片 材料来源最为丰富，使用普遍 规律：老叶和幼嫩的小叶比成熟叶片难于培养 幼嫩的小叶生理功能还不健全，分化能力差；老叶生理功能已经衰退，难以分化 成熟叶片营养丰富，生理功能旺盛，光合作用能力强，细胞处于活性状态，容易脱分化和再分化 例：罗汉果、猕猴桃、番茄、矮牵牛等茎 茎段：雪松、桉
3、树、薄荷等 花茎：大花萱草等植物的侧芽在土中，极易污染，而且分化能力很差，用花茎做外植体时效果很好，细胞脱分化和再分化都很快 鳞茎：百合、大蒜等。且鳞茎的不同部位的再生能力有很大的差别，外层比内层鳞片叶的再生能力强，同一鳞片下段比中上段再生能力强其它 子叶或下胚轴 胎座 胚珠 种子 花瓣 花药和花粉 因此，选择合适的部位和组织（最能表达全能性），是决定组织培养成功的前提之一器官的发育阶段和生理状态器官的发育阶段和生理状态外植体的发育年龄是影响器官形成的重要因素一般幼年组织比老年组织有较好的形态发生能力取材季节也有影响：如百合的鳞片外植物体，在春秋取材容易形成小鳞茎，而在夏冬取材则难以形成小鳞茎
4、大多数植物应在其生长旺盛期取材，生长末期或进入休眠状态的外植体对诱导反应迟钝或无反应Effect of cutting and leaf age Adventitious shoot regeneration from leaf explants of Gypsophila paniculata L.(宿根霞草宿根霞草)Multiple shoot formation on the explants after 35 days in culture.Callus began to accumulate on both adaxial and abaxial sides and after 12
5、15 days of cultureRooting of an elongating adventitious shoot.Regenerated plants established in soilEffect of cutting and leaf age on the percentage of leaves forming shoots(LFS)and the average number of shoots per leaf(AS)produced from cv.Arbel.Overall efficiency(OE)of shoot regeneration from leave
6、s.Regeneration efficiencies were evaluated following a total of 42 days in culture on medium外植体的大小外植体的大小一般来讲，较大的外植体有较大的再生能力许多植物的茎尖培养表明，材料越小，成活率越低（临界大小一般为一个茎尖分生组织带12个叶原基）但也不能过大，过大则难以消毒灭菌，容易引起污染一般愈伤组织诱导，可将材料切成5mm小段或5m5m小块脱毒培养在保证存活的前提下应尽量小（0.10.2mm）品品 种种愈伤组织愈伤组织大小大小（mm）愈伤组愈伤组织数织数出苗数出苗数芽分化率芽分化率（%）川蔗11号5
7、10298.85654873.8桂糖2号569811.651058782.6桂糖71/114556712.55686494.1甘蔗培养材料大小对分化的影响外植体消毒灭菌的要求包括两个方面：把外植体上的一切微生物，包括营养体、孢子和芽孢等全部杀死不能损伤组织材料，保持外植体的生活力，使外植体在良好的培养条件下很快恢复生机，正常生长 二、外植体的灭菌二、外植体的灭菌常用消毒剂的种类和特性要求：具有良好的消毒作用，既不会杀死植物的组织细胞，又易被无菌水冲洗掉，不影响消毒后外植体的生长和分化常用消毒剂效果比较消毒剂消毒剂使用浓使用浓度度(%)(%)消毒时间消毒时间（minmin）效效 果果去除难易去除
8、难易次氯酸钠25530好易次氯酸钙910530好易氯化汞0.10.2210最好最难H2O21012515较好最易溴水12210好易硝酸银1530较好较难酒精70750.22好易常用消毒剂的特性70%-75%的酒精 特点:具有很强的穿透力和杀菌力,通常外植体浸入1530秒种即可起到消毒作用 由于酒精对组织细胞的杀伤力比较强,使用时间不能过长,一般达不到彻底消毒的要求，但酒精的浸润作用可以促进其它消毒剂渗透到外植体的整个表面，提高杀菌效果，常做为外植体消毒的第一步次氯酸钠（NaClO）可以分解释放Cl2,具有较强的杀菌作用,对植物细胞的损伤较小,消毒时间10min左右为宜(2NaClO+H2O+2
9、CO2=2NaHCO3+Cl2)注意须防潮,要求密封储存,随配随用氯化汞(HgCl2)原理:具有剧毒的重金属盐杀菌剂,其Hg2+可与带负电荷的蛋白质结合,使微生物菌体蛋白变性而失活缺点:对植物组织的损伤较大,且不易被无菌水洗去,对人体也有毒害作用优点:消毒效果好,且稳定,能长期保存外植体消毒的一般程序 70%酒精外植体放入 灭菌的小烧杯(三角瓶等)中 15-30秒 加入消毒剂(氯化汞或次氯酸钠等)迅速倒出酒精 520分钟（振摇 加入无菌水数次）倒出消毒剂 振摇数次将水倒掉(反复35次)种子 清洗：将种子用自来水冲洗20min 酒精处理：70-75酒精处理0.5-1.0 min，立即除去酒精 加
10、入消毒剂（如0.1%升汞），同时滴加1-2滴Tween20，在摇床上消毒10-15min，重复一次 清洗：弃去消毒液，用无菌水清洗5次，每次1-2min 无菌滤纸吸干水分备用不同材料的消毒方法未成熟胚、子房及花药灭菌未成熟胚、子房及花药灭菌 选取适宜时期的花器官，对其进行适当整理选取适宜时期的花器官，对其进行适当整理 70-7570-75酒精处理酒精处理0.5-1.0 min0.5-1.0 min，立即除去酒精，立即除去酒精 加入消毒液，同时滴加加入消毒液，同时滴加1-21-2滴滴Tween20Tween20，在摇床，在摇床上消毒上消毒10-20min10-20min，重复一次，消毒，重复一次
11、，消毒5min5min 弃去消毒液，用无菌水清洗弃去消毒液，用无菌水清洗5 5次，每次次，每次1-2min1-2min 灭菌后置于垫有无菌纸的培养皿中备用灭菌后置于垫有无菌纸的培养皿中备用芽、茎段、叶片、花瓣的消毒 这些组织常暴露在空气中，表面的杂菌较多，而芽的外面有鳞片、茸毛、角质层和蜡质层，影响消毒剂的进入，在消毒前先用软毛刷和棉球蘸清水清洗干净，再用镊子或解剖刀除去部分鳞片和茸毛根、块根、块茎、鳞茎的消毒 由于这些材料生长在地下，带菌量多，一定要选用未伤害芽眼的根茎做外植体，选好后用软毛刷边刷边用自来水冲洗，再用吸水纸吸干多余的水分，切成较长的段或片进行消毒三、外植体的接种及培养三、外植
12、体的接种及培养接种接种用镊子、解剖刀对灭菌后的外植体进行适用镊子、解剖刀对灭菌后的外植体进行适当整理后，接种到培养基上，接种后瓶、当整理后，接种到培养基上，接种后瓶、管用棉塞或封口膜封口，培养皿用无菌胶管用棉塞或封口膜封口，培养皿用无菌胶带封口带封口接种器械接种器械(解剖刀、镊子等解剖刀、镊子等)的消毒方法：的消毒方法：将金属器械蘸入将金属器械蘸入95%95%酒精中，取出后再置于酒精中，取出后再置于酒精灯火焰上灼烧，待冷却后即可使用酒精灯火焰上灼烧，待冷却后即可使用(每每完成一次接种操作后需消毒一次完成一次接种操作后需消毒一次)切取切取 接种接种外植体接种的原则接种数量一般材料每瓶35个；贵重
13、或稀少的材料，切勿用大的培养瓶，应用小三角瓶或试管，每瓶只接种12个外植体如果用大的培养瓶，一般可接种10个外植体,但只要其中一个发生污染，由于培养基表面水的流动,全瓶外植体都将被污染接种位置如果一瓶只接种一个外植体,就放在培养基的正中央；接种几个外植体就分布均匀地接入培养基中接种深度茎段、茎尖等下端1/3左右插入培养基；胚或种子，胚根朝下插入培养基中2/3左右；接种的叶片，则叶背面接触培养基外植体的培养外植体的培养1.1.培养方式培养方式固体培养 实验设备要求简单，占有空间少，是普遍的植物组织培养方法 外植体只有一部分表面可以接触培养基，当外植体周围的营养被吸收后，容易造成培养基中营养物质的
14、浓度差异，影响培养物生长 外植体插入培养基的部分，常因气体交换不畅以及有毒代谢产物的积累而影响组织的呼吸或造成毒害固体培养solid culture液体培养 静置液体培养加滤纸桥 振荡液体培养2.2.培养类型培养类型（按培养材料层次）器器 官官 培培 养养胚胚 胎胎 培培 养养细细 胞胞 培培 养养原生质体培养原生质体培养组组 织织 培培 养养植植 株株 培培 养养植株培养植株培养 指以具备完整植株形态的材料（如幼苗和指以具备完整植株形态的材料（如幼苗和较大的植株）作为外植体的无菌培养较大的植株）作为外植体的无菌培养器官培养器官培养 指以植物的根、茎、叶、花、果实等器官指以植物的根、茎、叶、花
15、、果实等器官为外植体的离体无菌培养为外植体的离体无菌培养组织培养组织培养 指以分离出植物各部位的组织（如分生组指以分离出植物各部位的组织（如分生组织、成熟组织），或已诱导的愈伤组织为外织、成熟组织），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养植体的离体无菌培养（这是狭义的组织培养）（这是狭义的组织培养）胚胎培养胚胎培养 指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚 为外植体的离体无菌培养为外植体的离体无菌培养细胞培养细胞培养 由愈伤组织培养而成的悬浮细胞（游离的由愈伤组织培养而成的悬浮细胞（游离的花粉粒，分离的卵、精子、细胞、合子等）花粉粒，分离的卵、精子、细胞、合子
16、等）原生质体培养原生质体培养 指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养体无菌培养愈伤组织诱导培养愈伤组织诱导培养愈伤组织的形成标志着接种的外植体的生愈伤组织的形成标志着接种的外植体的生长状态已脱离分化状态，重新恢复分生能长状态已脱离分化状态，重新恢复分生能力，即力，即脱分化脱分化继代培养继代培养也称传代培养，指愈伤组织在培养基上生也称传代培养，指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上这些组织转移到新的培
17、养基上水稻幼穗愈伤组织分化培养分化培养愈伤组织的愈伤组织的再分化再分化过程过程生根培养生根培养在生根培养基在生根培养基 (with relatively higher(with relatively higher auxin/cytokinin ratios)auxin/cytokinin ratios)上进行根的诱导上进行根的诱导组培苗的炼苗组培苗的炼苗试管苗在进入自然环境前必须炼苗，进行适试管苗在进入自然环境前必须炼苗，进行适应训练，此步骤也十分关键应训练，此步骤也十分关键打开培养瓶，加入少量蒸馏水，在一定的温打开培养瓶，加入少量蒸馏水，在一定的温度和湿度条件下炼苗度和湿度条件下炼苗2 2
18、3 3天天移栽移栽和驯化和驯化炼苗后，洗净试管苗根上的琼脂，将幼苗移炼苗后，洗净试管苗根上的琼脂，将幼苗移栽至驯化苗圃中驯化。驯化应在能够有效控栽至驯化苗圃中驯化。驯化应在能够有效控制温度、湿度的驯化温室或大棚中进行，每制温度、湿度的驯化温室或大棚中进行，每天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，151520d20d驯化大棚驯化大棚4.4.培养条件的控制培养条件的控制光照温度湿度培养基pH气体调节光照 光照包括：光照包括：时间、强时间、强度和光质；度和光质；光照时间影响植株再光照时间影响植株再生状态生状态 光照强度应植物类型光照强度应植物类型不同而异不同而异 光质研
19、究报道较少光质研究报道较少温度 常用温度范围一般在2030 低于15或高于35均会影响培养物的生长 适宜的温度有利于细胞分裂；适当提高温度，则有利于细胞伸长；而在一定范围内降低培养温度，则使细胞的质量增加组织培养中湿度的影响有两个方面：组织培养中湿度的影响有两个方面：一是培养容器内的湿度条件，几乎是一是培养容器内的湿度条件，几乎是100%100%的相对湿度的相对湿度 二是环境的相对湿度，一般要求二是环境的相对湿度，一般要求707080%80%湿度pH.0气体液体振荡培养的烟草愈伤组织生长与振荡次数的关系四、培养中的常见问题及对策四、培养中的常见问题及对策污 染褐 化玻璃化1.1.污染污染细菌污
20、染细菌污染 现象：外植体周围形成细菌膜，逐渐产生粘液或浑浊的水迹，并进一步在外植体与培养基接触处产生气泡，时间长了会出现乳白色或橙黄色的菌落，呈圆形并很快扩大 原因：在某一个环节消毒不彻底，如：外植物消毒不彻底、无菌水消毒不彻底；或操作人员违反操作规程，在接种的同时，说话、咳嗽等都能引起污染细菌污染真菌污染真菌污染 现象：在培养基中生长，产生菌丝；在夏季阴雨天、空气湿度大时，甚至在棉塞表面都可以看到 预防：定期对接种室和培养室进行消毒；定期检查超净工作台的滤板是否因老化而失效；对已经污染的培养瓶，进行彻底灭菌后再清洗真菌污染培养基污染培养基污染 现象：在尚未接种的培养基的表面或中间产生细菌菌落
21、，进一步产生气泡；特点是几乎同一锅灭菌的培养基都发生污染 培养基污染的主要原因：灭菌锅内的冷空气未排净；放置物品过多或太挤等 对策：检查高压灭菌锅，如压力表、放气阀等是否出现问题；操作过程中放气和控温是否规范2.2.褐化（褐变）褐化（褐变）现象:外植体在培养过程中,由伤口表面出现褐色物质,颜色由浅变深,严重时可将材料周边的培养基染成褐色,影响外植体的启动、分化和生长原因：植物体内酚类化合物，被多酚氧化酶氧化成醌类物质，醌类物质呈棕褐色，扩散到培养基中，使培养基变成褐色，并影响外植体的生长，严重时会导致外植体死亡蝴蝶兰组培过程中的褐化现象引起褐变的因素：引起褐变的因素：植物种类和基因型植物种类和
22、基因型 如豆科和芸苔属植物在原生质体培养时易褐变外植体的取材部位和生理状态外植体的取材部位和生理状态 年幼的材料含酚类物质较少，而年老的材料含酚类物质较多，褐变比幼小的材料严重取材的季节取材的季节 春冬取材褐变较轻，夏秋季取材褐变较严重培养基成分培养基成分 如无机盐浓度过高、激素使用不当等培养时间和培养条件培养时间和培养条件 接种后培养时间过长，未及时转接 温度过高或光照过强也会加剧褐变解决办法解决办法选择合适的外植体和培养条件使用抗氧化剂 抗坏血酸、柠檬酸、半胱氨酸等加入活性碳或酚类物质的吸附剂（聚乙烯吡咯烷酮，PVP）及时更换新的培养基（连续转接）3.3.玻璃化玻璃化（vitrificat
23、ion）现象：植物组织培养中，有时会出现愈伤组织或试管苗呈半透明或水浸状的现象，即玻璃化特点 形态：呈半透明状 解剖：茎尖顶端分生细胞较小，结构简单，缺少维管束原组织，茎叶细胞体积膨大，液泡化程度高，胞质稀薄，细胞核变小，细胞无明显长轴 生理生化：细胞过度含水，还原糖、蔗糖、K、Ca2和Cl-含量明显增高，而木质素、叶绿素、蛋白质、F3和Cu2的含量则明显降低玻璃化培养材料培养材料 培养材料的种类和外植体的不同都可能影响玻璃化的发生（如瑞香茎尖外植体大小）环境因素环境因素 液体培养比固体培养更易发生玻璃化 蔗糖浓度与玻璃化呈负相关，而增加琼脂浓度可以降低玻璃化程度 通气不良易、温度过高往往导致玻璃化比率增加培养基成分培养基成分 培养基中NH4过多易导致玻璃化，6BA浓度与玻璃化呈正相关引起玻璃化的因素：引起玻璃化的因素：解决办法解决办法采用固体培养，适当提高琼脂浓度，提高蔗糖浓度或加入渗透剂，降低容器内的相对湿度适当提高光照强度；控制温度，避免温度过高降低培养基中NH4的浓度，根据具体情况调整其它元素含量；适当降低细胞分裂素浓度一些其它措施或添加物可有效减轻或防止某些植物的玻璃化 40热激处理瑞香；添加青霉素G钾（芥菜）
