1、PCR技术及应用分子生物学诊断组 江杨华 2019年3月25日 星期五l PCR的定义l PCR的原理l PCR反应体系的的成分及其作用l PCR反应体系的优化l PCR技术的特点l PCR产物的检测方法l PCR技术在临床检验中的应用 一、PCR的定义lPCR（polymerase chain reaction)：聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。是近年来发展起来的一种体外扩增DNA片段的技术。l PCR技术是由美国 的Kary Mullis 于1985年发明，用此方法可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。由于PCR方法带来的革命性作用，Kary Mullis 本人因此获1993年
2、诺贝尔化学奖。二、PCR技术的原理 PCR技术，其原理是模拟天然DNA的复制过程：以拟扩增的DNA分子为模板，在DNA聚合酶的作用下，以一对分别与模板5末端和3末端互补的引物（寡核苷酸片段）引导下，按照半保留复制的机制合成新的子链DNA的过程，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到不断的扩增。二、PCR技术的原理 PCR反应主要分为三个步骤：变性、退火、延伸。反应主要分为三个步骤：变性、退火、延伸。1.变性(Denaturation)：加热使模板DNA双链碱基间的氢键断裂而形成两条单链的过程。温度一般为90-95度。2.退火(复性)(Annealling):温度降低温度降低后，变性后的按碱基配
3、对原则互补结合的过程。温度一般为Tm-5度。二、PCR技术的原理 3.延伸(Extension):在适宜温度下，在DNA聚合酶作用下，以4种 dNTPs等为 原料，从引物的 3 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链的过程。耐热DNA聚合酶最适温度为72。上述上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环量就增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过的模板，经过35个循环后，理论上个循环后，理论上DNA的量可达到的量可达到235倍。倍。变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5CPCR
4、的指数扩增（2n）第第n次循环次循环二、PCR技术的原理1.缓冲液：缓冲液：l 10 50 mM Tris-Cl(pH8.4)：维持 Taq 酶作用环境的偏碱性l 25 50 mM KCl：促进引物退火，50 mM 会抑制 Taq 酶的活性。l 100g/ml 牛血清白蛋白(BSA)：对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作 用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、Tween-20、二硫苏糖醇(DTT)也有类似作用。三、PCR反应体系的的成分及其作用 2.MgCl2：Taq 酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，浓度一般为1.5 2.0 mM，浓度过高能增加非特异扩增并影
5、响产率，过低则酶活性显著下降。3.dNTPs:dATP、dGTP、dCTP、dTTP。浓度一般为0.05 0.2 mM。过高能加快反应速度，但可增加碱基的错误掺入 率和室验成本。过低则反应速度下降，但可提高实验的精确性。三、PCR反应体系的的成分及其作用 4.引物引物(Primer)：是一段寡核苷酸片段，即预扩增核酸片段两端的已知序列。浓度一般为0.2 1 uM，偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间形成引物二聚体，产量降低。偏低：产量降低。5.Taq DNA 聚合酶：聚合酶：耐高热，最初从火山口细菌中提取，具有连接酶活性和5 端至 3端的外切酶活性。目前市售的均为克隆表达产物。三、PCR反
6、应体系的的成分及其作用 6.模板模板DNA(Template):l 可以是DNA，也可以是RNA，RNA的扩增首先需逆转录成cDNA后才能进行正常的PCR循环。l 待扩增的核酸需部分纯化，使核酸标本中不含蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以及能与DNA结合的蛋白质。l 模板的量一般微克水平或102 105 拷贝，过高会引起非特异产物的增加；过低则产量降低。7.水：水：去离子水，补足整个反应体积。三、PCR反应体系的的成分及其作用 10buffer：130/10=3l MgCl2:1.530/25=1.8l dNTPs:0.230/10=0.6l 引物引物 P：0.4302/10=2.4l Ta
7、q 酶酶(5U/l)：1/5=0.2l 模板：模板：1l 水：水：30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21lPCR反应体系：反应体系：30ul 四、四、PCR反应条件优化：反应条件优化：1、温度、循环参数：、温度、循环参数：变性温度和时间：变性温度和时间：保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热9095，30 60 s，再复杂的DNA分子也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择94 30，可使各种复杂的DNA分子完全变性。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。四、四、PCR反应条件优化：反应条件优化
8、：复性温度和时间：复性温度和时间：PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板 的结合。复性温度的选择，可根据引物的长度和G+C含量确定，长度在15 25 bp 之间时，复性温度 Tm=4(G+C)+2(A+T)计算得到，一般位于40 60，30 60 s。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。一般情况下选择55 30，足以使引物与模板之间完全结合。四、四、PCR反应条件优化：反应条件优化：延伸温度和时间：延伸温度和时间：一般位于Taq酶最适作用温度70 75 之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引 物与模板的结合，可以缓慢升温到70 75。延伸反应时间，可根
9、据待扩增片段的长度而定，1Kb需加长延伸时间，10Kb片段延伸时间可达15分钟。延伸时间过长可出现非特异扩增，常用72 1。四、四、PCR反应条件优化：反应条件优化：循环数：循环数：其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说25 30次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，30 35次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。PCR扩增的特点基线期、指数期、平台期PCR程序四、四、PCR反应条件优化：反应条件优化：2、PCR反应体系成分的优化反应体系成分的优化l MgCl2浓度：1.5
10、2.0 mMl 模板：l dNTP：0.05 0.2 mMl 引物：0.2 1 M 注：引物设计总原则是提高扩增的效率和特异性。引物设计原则引物设计原则 长度1530 b，过短特异性降低，过长则成本增加，产量也下降。引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物 G+C 含量宜在45 55%左右。引物内部不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构，两个引物之间尤其在 3 末端不应有互补链存在，不然会形成引物二聚体。引物设计原则引物设计原则 引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性(70%)或少于连续8个的互补碱基。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。引物的 5 末端碱基：并
11、没有严格的限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够，其 5 末端碱基可以不与模板DNA匹配呈游离状态。最多可游离10个碱基并不影响PCR反应进行。引物设计原则引物设计原则 引物的 3 末端碱基：原则上要求引物的3末端与模板DNA一定要配对，另外 3末端的末位碱基在很大程度上影响着 Taq 酶的延伸效率。引物3末端碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大差异，最好选T、G、C，而不选A。引物设计软件：Primer7.0、Oligo6.0五、PCR技术的特点l 高度灵敏l 高特异性l 简便快捷1、凝胶电泳分析法：l 琼脂糖凝胶电泳l 聚丙烯酰胺凝胶电泳2、分子杂交：基因芯片和原位杂交3、限制性内
12、切酶酶切分析：点突变4、测序5、Real-time PCR：不是对PCR终产物进行检测六、六、PCR产物的检测方法产物的检测方法Real-time（实时荧光定量）PCR原理：原理：所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知量模板进 定量分析的方法。检测方法：1.SYBRGreen法:在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入 DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光 信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。注：PCR产物熔解曲线
13、图(单一峰图表明PCR扩增产物的单一性)2.TaqMan探针法（单链DNA探针）:探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子 形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。Real-time（实时荧光定量）PCRTaqMan探针法扩增曲线分析设置：基线和阈值线扩增曲线分析基线：3-15循环基线：1-3循环标准曲线：Ct值与logC0成反比七、七、PCR技术在临床检验中的应用技术在临床检验中的应用1、在常见病原体检测中的应用：HBV-DNA、HCV-RNA、EB-DNA、HCMV-DNA、MP-DNA、UU-DNA、CT-DNA、HSV2-DNA、NG-DNA2、分子遗传学研究：基因变异、表达、重组、进化等3、医学诊断：遗传病、基因病、癌变、代谢性遗传病等4、法医学鉴定5、组织器官移植配型：HLA-SSP配型
