1、“十二五”职业教育国家规划教材编写组 食品理化检验技术（第二版）子情境六 蛋白质的测定学习情境二学习情境二 学习目标知识目标：1.了解蛋白质的含义、组成及性质。2.了解食品中蛋白质的作用及测定意义。3.熟悉各种蛋白质测定方法的适用范围及操作要点。技能目标：1.能进行样品消化、蒸馏、滴定等基本操作。2会用凯氏定氮法测定样品的蛋白质含量。子情境六 蛋白质的测定 一、蛋白质概述蛋白质由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物，它主要含的元素是C、H、O、N。一般来说，pro的平均含氮量为16/100，既一份氮相当于6.25份蛋白质，此数值称为蛋白质系数。所以在用凯氏定氮法定量pro时，将测得的总氮
2、%乘上pro的换算系数K=6.25即为该物质的pro含量。学习情境二学习情境二 学习情境二学习情境二 评价食品的营养价值 合理开发利用食品资源 提高产品质量 优化食品配方 指导经济核算及生产过程控制二、食品中糖类物质测定的意义学习情境二学习情境二 三、蛋白质的测定凯氏定氮法凯氏定氮法1分光光度法分光光度法2GB 5009.5-2010学习情境二学习情境二 检测依据燃烧法燃烧法3适用于各种食品适用于蛋白质含量在10g/100 g以上的固体试样测定原理凯氏定氮法GB 5009.5-2010 第一法学习情境二学习情境二 仪器：1、凯氏烧瓶500mL或250mL 2、凯氏定氮仪3、扭力天平 4、分析天
3、平5、5mL移液管 6、温度可以控制的电炉7、小漏斗 8、滴定管9、250mL锥形瓶 10、玻璃珠仪器及试剂学习情境二学习情境二 试剂：1、硫酸铜(CuSO45H2O)。2、硫酸钾。3、硫酸(密度为1.8419g/L)。4、硼酸溶液(20g/L)。5、氢氧化钠溶液(400g/L)。6、盐酸标准滴定溶液c(HCl)=0.0500mol/L或硫酸标准滴定溶液c(1/2H2SO4)=0.0500mol/L。7、混合指示液：1份甲基红乙醇溶液(1g/L)与5份溴甲酚绿乙醇溶液(1g/L)临用时混合。(也可用2份甲基红乙醇溶液(1g/L)与1份次甲基蓝乙醇溶液(1g/L)临用时混合)。学习情境二学习情境
4、二 盐酸标准滴定溶液c(HCl)=0.0500mol/L配制与标定（GB/T 601-2002）1、配制 按下表的规定量取硫酸，缓缓往入1000mL水中，冷却，摇匀。2、标定 按下表的规定称取于270300高温炉中灼烧至恒重的工作基准试剂无水碳酸钠，溶于50mL水中，加10滴溴甲酚绿-甲基红指示液，用配制好的硫酸溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，煮沸2min，冷却后继续滴定至溶液再呈暗红色。同时做空白试验。硫酸标准滴定溶液的浓度c(1/2H2SO4)mol/L硫酸的体积V/mL1300.5150.13硫酸标准滴定溶液的浓度c(1/2H2SO4)/mol/L工作基准试剂无水碳酸钠的质量m/g 1
5、11.9 1.9 0.50.50.950.950.10.10.20.2学习情境二学习情境二 盐酸标准滴定溶液c(HCl)=0.0500mol/L配制与标定（GB/T 601-2002）2、标定 按下表的规定称取于270300高温炉中灼烧至恒重的工作基准试剂无水碳酸钠，溶于50mL水中，加10滴溴甲酚绿-甲基红指示液，用配制好的盐酸溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，煮沸2min，冷却后继续滴定至溶液再呈暗红色。同时做空白试验。说明：u称量工作基准试剂的质量的数值小于等于0.5g时，按精确至0.01mg称量;数值大于0.5g时，按精确至0.1mg称量。u在标定和使用标准滴定溶液时，滴定速度一般应保持
6、在6 mL/min8 mL/min。u制备标准滴定溶液的浓度值应在规定浓度值的5%范围以内。盐酸标准滴定溶液的浓度c(HCl)mol/L工作基准试剂无水碳酸钠的质量m/g 1 11.9 1.9 0.50.50.950.950.10.10.20.2学习情境二学习情境二 2、标定 盐酸标准滴定溶液的浓度c(HCl)，数值以摩尔每升（mol/L）表示,按下式计算:式中:m无水碳酸钠的质量的准确数值，单位为克(g)；V1盐酸溶液的体积的数值，单位为毫升(mL)；V2空白试验盐酸溶液的体积的数值，单位为毫升(mL)；M无水碳酸钠的摩尔质量的数值，单位为克每摩尔（g/mol）（1/2Na2CO3）=52.
7、994。u标准滴定溶液的浓度小于等于0.02mol/L时，应于临用前将浓度高的标准滴定溶液用煮沸并冷却的水稀释，必要时重新标定。u除另有规定外，标准滴定溶液在常温1525下保存时间一般不超过两个月。当溶液出现浑浊、沉淀、颜色变化等现象时，应重新制备。u贮存标准滴定溶液的容器，其材料不应与溶液起理化作用，壁厚最薄处不小于0.5mm。MVVmc211000)HCl(学习情境二学习情境二 工作任务分解任务3：盐酸滴定任务2：蒸馏、吸收任务4：结果计算任务1：湿法消化学习情境二学习情境二 任务一：湿法消化1、仪器及试剂的准备学习情境二学习情境二 学习情境二学习情境二 试剂作用硫酸铜a催化作用：加速有机
8、物的氧化分解。b消化完全的指示剂：蓝绿色，澄清，透明；c蒸馏时碱性反应的指示剂：变深蓝色或产生黑色沉淀硫酸钾提高溶液沸点，从而加快有机物分解 浓硫酸氧化作用：有机物质氧化分解为H2O和CO2学习情境二学习情境二 2、样品预处理固体试样 0.22g半固体试样 25g液体试样 1025g样品充分混匀直接消化学习情境二学习情境二 样品充分混匀3、样品称量、消化、样品称量、消化1.000g奶粉0.2g硫酸铜6g硫酸钾20mL浓硫酸玻璃珠小火加热炭化至泡沫完全停止轻摇 大火加热保持瓶中液体微沸至蓝绿色澄清透明继续加热0.51h冷却加20mL水冷却同时做试剂空白试验学习情境二学习情境二 3、样品称量、消化
9、任务二：碱法蒸馏、硼酸吸收1、仪器及试剂的准备10mL100mL 3只只学习情境二学习情境二 水蒸气发生器：装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数ml，使水呈微红色按上图所示搭好装置注意装置搭建好了之后要先进行捡漏，利用虹吸原理。在蒸汽发生瓶中要加甲基橙指示剂数滴及硫酸数ml以使其始终保持酸性，以防水中氨蒸出。学习情境二学习情境二 试剂：40%氢氧化钠20%硼酸溶液混合指示剂1、1份甲基红乙醇溶液（1g/L）与5份溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）临用时混合 酒红色绿色2、2份甲基红乙醇溶液（1g/L）与1份亚甲基蓝乙醇溶液（1g/L）临用时混合 紫红色绿色学习情境二学习情境二
10、2、碱化蒸馏、硼酸吸收10.0mL10.0mL硼酸溶液硼酸溶液 100mL100mL三角瓶三角瓶 加加1 12 2滴混合指示剂滴混合指示剂 冷冷凝管下端插入三角瓶液面下凝管下端插入三角瓶液面下 准确吸取准确吸取10mL10mL试样试样 由小玻由小玻杯流入反应室杯流入反应室 少量水洗涤小漏斗少量水洗涤小漏斗 盖紧玻璃塞盖紧玻璃塞 量筒取量筒取10.0mLNaOH10.0mLNaOH溶液溶液 倒入小玻杯倒入小玻杯 提起玻塞使其缓慢流入反提起玻塞使其缓慢流入反应室应室 立即塞紧玻璃塞立即塞紧玻璃塞 加水于小玻杯防漏气加水于小玻杯防漏气 通蒸汽通蒸汽 颜色变化时开始计时蒸馏颜色变化时开始计时蒸馏5mi
11、n 5min 移动接受瓶使液面离开冷移动接受瓶使液面离开冷凝管下端凝管下端 再蒸馏再蒸馏1min 1min 用少量水冲洗冷凝管下端外部用少量水冲洗冷凝管下端外部 取下接收瓶取下接收瓶学习情境二学习情境二 注意加入NaOH一定要过量，判断NaOH是否过量的方法，看反应室内液体颜色学习情境二学习情境二 加碱足量的判断：溶液会变成深蓝色或产生黑色沉淀原理：过量的氢氧化钠会跟硫酸铜反应生成氢氧化铜蓝色沉淀，蓝色沉淀在加热的情况下会分解成黑色的氧化铜沉淀。如果没有上述现象，说明氢氧化钠加的量不足，需要继续加入氢氧化纳，直到产生上述现象为止。样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，为防止样液中氨气逸出。一是加
12、入氢氧化钠溶液要过量，二是要水封，三要夹紧废液蝴蝶夹后再通蒸汽，四要在蒸馏过程中要注意接头处有无松漏现象加热蒸馏出来的氨可以用硼酸进行吸收，因为硼酸只呈微弱酸性，不影响指示剂的变色反应，但是具有吸收氨的作用，与氨形成强碱弱酸盐。冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏。吸收液温度不应超过40，避免氨气逸出，若超过时可置于冷水浴中使用。学习情境二学习情境二 检验蒸馏是否完成的方法：奈氏试纸法。原理:NH4+或NH3遇奈氏试剂会反应生成综红色的碘化汞铵化合物，如NH4+或NH3含量较少，试纸呈黄色，若含量过多，呈棕黄色或棕红色的沉淀反应在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断汽,否则会
13、发生倒吸。蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，再蒸1分钟，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。所用的试剂溶液 必须用无氨蒸馏水配制。学习情境二学习情境二 任务三：盐酸滴定1、仪器及试剂的准备仪器：25mL酸式滴定管1套试剂0.0500mol/L HCL标准溶液学习情境二学习情境二 2、盐酸滴定接收瓶 以HCL标准滴定液滴定 灰色终点 记录VHcl（1）硼酸吸收液的颜色（2）吸收氨气后的硼酸吸收液的颜色（3）盐酸滴定终点的颜色学习情境二学习情境二 注意混合指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈红色。酸
14、式滴定管的正确使用学习情境二学习情境二 学习情境二学习情境二 任务四：结果记录并分析处理 计算公式：式中：X试样中蛋白质的含量，（g/100g）；V1试样消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；V2试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；V3吸取消化液的体积，mL；c硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，mol/L；0.01401.0mL硫酸c(1/2H2SO4)=1.000 mol/L或盐酸c(HCl)=1.000 mol/L标准滴定溶液相当的氮的质量，g；m试样的质量，g；F氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25；纯乳与纯乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高粱为6.24；花生为5.46；
15、大米为5.95；大豆及其粗加工制品为5.71；大豆蛋白制品为6.25；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30；复合配方食品为6.25。有效数字：以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，蛋白质含量1g/100g 时，结果保留三位有效数字；蛋白质含量1g/100g时，结果保留两位有效数字。精密度：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值10%。学习情境二学习情境二 分光光度法GB 5009.5-2010 第二法学习情境二学习情境二 食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH 4.8 的
16、乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。特点：快速、污染少、操作简单、省时测定原理学习情境二学习情境二 豆奶粉是一种新型固体饮料，它综合了大豆和牛奶的营养成分，含有人体所必需的氨基酸，其中赖氨酸的含量高于谷物，是植物性食物当中最合理、最接近于人体所需比例的。另外，牛奶蛋氨酸含量较高，可以补充大豆蛋白质中蛋氨酸的含量，动、植物蛋白的互补，使氨基酸的配比更合理，更利于人体的消化吸收。试设计试验检验豆奶粉样品中蛋白质含量，并判断是否符合要求。学习
17、情境二学习情境二 检测依据GB/T 5009.39-20031甲醛值法甲醛值法2比色法比色法适用于以粮食和其副产品豆饼、麸皮等为原料酿造或配制的酱油四、氨基酸态氮的测定学习情境二学习情境二 1、测定意义氨基酸是某些发酵产品的质量指标，如酱油。氨基酸含量也是保健食品及酒类饮料中的质量指标。学习情境二学习情境二 2、测定原理 氨基酸含有酸性的-COOH和碱性的-NH2，它们相互作用使氨基酸成为中性的内盐，不能直接用碱液滴定它的羧基。当加入甲醛时，氨基与甲醛结合，其碱性消失，使羧基显示出酸性，这样就可以用氢氧化钠溶液滴定-COOH，并用间接法测定氨基酸的总量。以酸度计测定终点。NNaOH甲醛值法 此
18、法根据酸度计指示的PH值判断和控制滴定终点 适合有色样液的测定，对于混浊和色深样液可不经处理而直接测定。由于本项目测定是酱油，故选用电位滴定法。学习情境二学习情境二 1、仪器及试剂的准备仪器：10ml碱式滴定管、5ml移液管、200mL烧杯、100mL容量瓶、100mL量筒、酸度计、磁力搅拌器、滴定台试剂：36%甲醛；氢氧化钠标准溶液：0.050mol/L学习情境二学习情境二 2、样品预处理（稀释）准确移取5mL酱油溶液100ml容量瓶定容混匀3、氨基酸态氮检测取20ml稀释样品200mL烧杯加60ml蒸馏水，开动磁力搅拌器，0.05mol/L NaOH标液滴定至pH8.2，记录消耗体积加10
19、ml甲醛，混匀，0.05mol/L NaOH标液滴定至pH9.2，记录消耗体积同时取水80ml，做试剂空白试验中和样品中游离酸中和样品中氨基酸酸基学习情境二学习情境二 4、数据记录与计算项目名称项目名称样品名称样品名称接样日期接样日期设备设备检验日期检验日期检验依据检验依据GB/T 5009.39-2003GB/T 5009.39-2003（第一法）（第一法）样品体积（样品体积（mLmL）NaOHNaOH浓度浓度c c（mol/Lmol/L）吸取样品的体积（吸取样品的体积（mLmL）2020202020200 0加甲醛前滴定初读数加甲醛前滴定初读数V V初初（mLmL）加甲醛前滴定终读数加甲醛
20、前滴定终读数V V终终（mLmL）加甲醛前消耗加甲醛前消耗NaOH VNaOH V前前（mLmL）加甲醛后消耗加甲醛后消耗NaOH VNaOH V后后（mLmL）氨基酸态氮消耗氨基酸态氮消耗NaOHNaOH的体积的体积V=VV=V后后-V-V前前（mLmL）计算公式计算公式氨基酸态氮（氨基酸态氮（g/100mLg/100mL）平均（平均（g/100mLg/100mL）学习情境二学习情境二 计算公式：式中：X试样中氨基酸态氮的含量，（g/100mL）；V1测定用试样稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；V2试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；V3试样稀释液
21、取用量，mL；c氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L；0.0140与1.00mL氢氧化钠标准滴定溶液（1.000mol/L）相当的氮的质量，g。有效数字：计算结果保留两位有效数字。精密度：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值10%。学习情境二学习情境二 123()0.0141005/100VVcXV 对于混浊和色深的样液可不经处理而直接测定。36%中性甲醛试剂应避光存放，不含有聚合物。样品中如含有铵盐会使氨基酸态氮测定结果偏高。滴定的结果仅表示-氨基酸态氮的含量，故精确度仅达氨基酸理论含量的90。甲醛是有毒易挥发的溶液，一定要在通风橱中进行，实验室保持通风良好；实验时最好戴口罩。注意滴定过程烧杯中酸度计的电极安装位置，不要触及磁力搅拌器的搅拌棒，否则会破坏电极。技术提示学习情境二学习情境二
