1、分析化学分析化学1第十三章 高效液相色谱法 学习目的学习目的 知识要求知识要求 能力要求能力要求 分析化学分析化学2学习目的学习目的u通过通过学习高效液相色谱法的特点、类型、速率理论、学习高效液相色谱法的特点、类型、速率理论、分离条件和高效液相色谱仪的主要部件及工作流程，分离条件和高效液相色谱仪的主要部件及工作流程，加深对高效液相色谱法的分离原理、条件的理解，熟加深对高效液相色谱法的分离原理、条件的理解，熟悉主要类型特别是化学键合相色谱法的特点和应用，悉主要类型特别是化学键合相色谱法的特点和应用，能利用高效液相色谱仪对待测组分进行分离与分析。能利用高效液相色谱仪对待测组分进行分离与分析。为学习
2、药物分析、天然药物化学等专业课程奠定基础为学习药物分析、天然药物化学等专业课程奠定基础。分析化学分析化学3知识要求知识要求1.熟悉高效液相色谱法的主要类型，化学键合相色谱法熟悉高效液相色谱法的主要类型，化学键合相色谱法及其流动相、固定相的选择；高效液相色谱法速率理及其流动相、固定相的选择；高效液相色谱法速率理论的特点及分离条件的选择，高效液相色谱仪的主要论的特点及分离条件的选择，高效液相色谱仪的主要部件，定性与定量分析方法。部件，定性与定量分析方法。2.了解高效液相色谱法与经典液相色谱法、气相色谱法了解高效液相色谱法与经典液相色谱法、气相色谱法的区别，其他类型高效液相色谱法在分析中的应用。的区
3、别，其他类型高效液相色谱法在分析中的应用。分析化学分析化学4能力要求能力要求u掌握高效液相色谱仪的基本结构及仪器的基本操作掌握高效液相色谱仪的基本结构及仪器的基本操作方法，学会使用高效液相色谱仪对药物进行分离与方法，学会使用高效液相色谱仪对药物进行分离与分析的操作技术。分析的操作技术。分析化学分析化学5第一节概 述 第一节第一节 概概 述述 u高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC）的特点：）的特点：以经典液相色谱法为基础以经典液相色谱法为基础引入气相色谱法的理论和实验技术引入气相色谱法的理论和实验技术高压输送流动相高压输送流动相高效固定相及高灵敏度检测器高效固定相及高灵敏度检测器现代液相色
4、谱分析方法（具有分离、分析双重作用）现代液相色谱分析方法（具有分离、分析双重作用）分析化学分析化学6第一节概 述一、与经典液相色谱法相比一、与经典液相色谱法相比 颗粒极细（一般为颗粒极细（一般为1010 m m以下）、规则均匀的固定相，传以下）、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高；质阻抗小，柱效高，分离效率高；高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达测限可达1010 9 9g g，而荧光检测器最小检测限可达，而荧光检测器最小检测限可达
5、1010 1212g g。分析化学分析化学7 分析化学分析化学8第一节概 述二、与气相色谱法相比二、与气相色谱法相比不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广；不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广；流动相的选择范围宽，使分离的选择性高；流动相的选择范围宽，使分离的选择性高；一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。分析化学分析化学9第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理 第二节第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理高效液相色谱法的主要类型及原理 一、主要类型一、主要类型u化学键合相色谱法化学键合相色谱法u离子抑制色谱法离子抑制色谱法u离子对色谱法
6、离子对色谱法u离子色谱法离子色谱法u亲合色谱法亲合色谱法 分析化学分析化学10第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理二、化学键合相色谱法二、化学键合相色谱法u以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法(BPC)(BPC)。u化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相。体表面所形成的固定相。分析化学分析化学11第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理u键合相色谱法的优点：键合相色谱法的优点：固定相的均一性和稳定性好，使用过程中不易流失，固定相的均一性和稳定性好，使用过程中不易流失
7、，使用周期长；使用周期长；柱效高；重现性好；柱效高；重现性好；能使用的流动相和键合相的种类多，分离的选择性高。能使用的流动相和键合相的种类多，分离的选择性高。u键合相色谱法的分类键合相色谱法的分类根据化学键合相与流动相极性的相对强弱分类：根据化学键合相与流动相极性的相对强弱分类：正相（正相（NPNP）键合相色谱法）键合相色谱法 反相（反相（RPRP）键合相色谱法）键合相色谱法 分析化学分析化学12第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理（一）正相键合相色谱法（一）正相键合相色谱法（固定相极性大于流动相极性固定相极性大于流动相极性）u固定相：极性键合相固定相：极性键合相 如氰基（如氰基（CNCN）
8、、氨基（）、氨基（NHNH2 2）或二羟基键合硅胶。）或二羟基键合硅胶。u流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调节剂流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调节剂如烷烃加醇类（正己烷如烷烃加醇类（正己烷-甲醇）。甲醇）。u适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。物。分析化学分析化学13第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理u分离机制：分离机制：分配：把有机键合层看作一层液膜，溶质在两相间分配：把有机键合层看作一层液膜，溶质在两相间 溶解。溶解。极性强的组分极性强的组分k k大，保留时间（大，保留时间（t tR R）长）长,后洗脱出柱。后洗脱出
9、柱。分析化学分析化学14第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理（二）反相键合相色谱法（二）反相键合相色谱法（固定相极性小于流动相极性固定相极性小于流动相极性）u固定相：非极性键合相固定相：非极性键合相如十八烷基硅烷（如十八烷基硅烷（C18，ODS）辛烷基（辛烷基（C8）键合硅胶。）键合硅胶。u流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调节剂，常用甲醇调节剂，常用甲醇-水、乙腈水、乙腈-水等。水等。u应用范围：较广泛，适用于非极性至中等极性的组分应用范围：较广泛，适用于非极性至中等极性的组分分离。分离。分析化学分析化学15第二节 高效液相色谱法的
10、主要类型及原理u分离机制分离机制保留行为保留行为 主要是利用非极性溶质分子或溶质分子中主要是利用非极性溶质分子或溶质分子中非极性基团与极性溶剂接触时产生排斥力，而从非极性基团与极性溶剂接触时产生排斥力，而从溶剂中被溶剂中被“挤出挤出”，即产生疏溶剂作用，促使溶，即产生疏溶剂作用，促使溶质分子与键合相表面的非极性的烷基发生疏水缔质分子与键合相表面的非极性的烷基发生疏水缔合，而使溶质分子保留在固定相中。合，而使溶质分子保留在固定相中。分析化学分析化学16第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理u保留行为的主要影响因素保留行为的主要影响因素溶质的分子结构（极性）溶质的分子结构（极性）极性越弱，疏水性越
11、强，极性越弱，疏水性越强，k k越大，越大，t tR R也越大；反之亦然也越大；反之亦然。固定相固定相 键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k k也增大。也增大。硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k k越大。越大。分析化学分析化学17第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理流动相流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k k越大越大溶剂种类：水（洗脱能力弱）为弱溶剂，溶剂种类：水（洗脱能力弱）为弱溶剂，醇（洗脱能力强）为强溶剂醇（洗脱能力强）为强溶剂溶剂比例：水的比例增加，使溶剂
12、比例：水的比例增加，使k k增大增大 分析化学分析化学18第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理三、其他高效液相色谱法三、其他高效液相色谱法（一）离子抑制色谱法（一）离子抑制色谱法（ISC ISC）通过调节流动相的通过调节流动相的pHpH，抑制组分的解离，增，抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解度，改善峰形，以达到加组分在固定相中的溶解度，改善峰形，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的。适用于分离有机弱酸、弱碱的目的。适用于u3p3pK Ka a77的弱酸的弱酸u7p7pK Kb b88的弱碱的弱碱 分析化学分析化学19第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理（二）离子对色谱法（二）离子对色谱法（
13、IPC）把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离子在流动把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子生成中性离子对，增加溶质与相中与离子对试剂的反离子生成中性离子对，增加溶质与非极性固定相的作用，使非极性固定相的作用，使k增加，改善分离效果。增加，改善分离效果。u该方法适用于分离可离子化或离子型的化合物，如生物碱该方法适用于分离可离子化或离子型的化合物，如生物碱类、儿茶酚氨类、有机酸类、维生素类、抗生素类药物等。类、儿茶酚氨类、有机酸类、维生素类、抗生素类药物等。分析化学分析化学20第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理-u离子对模型离子对模型以通式表示为：以通式表示为
14、：分析化学分析化学21第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理分析酸类或带负电荷的物质，一般用季铵盐；如分析酸类或带负电荷的物质，一般用季铵盐；如四丁基铵磷酸盐；四丁基铵磷酸盐；分析碱类或带正电荷的物质，一般用烷基磺酸盐分析碱类或带正电荷的物质，一般用烷基磺酸盐或硫酸盐。或硫酸盐。u适用范围和离子对试剂的选择适用范围和离子对试剂的选择 分析化学分析化学22（三）离子色谱法（三）离子色谱法（IC）离子交换色谱法对许多正、负离子可实现分离。离子交换色谱法对许多正、负离子可实现分离。但由于一些常见的无机离子在可见或近紫外区没但由于一些常见的无机离子在可见或近紫外区没有吸收，因此难用紫外有吸收，因此难用
15、紫外-可见检测器进行检测。可见检测器进行检测。19751975年年Small提出了将离子交换与电导检测器相提出了将离子交换与电导检测器相结合分析各种离子的方法并称为离子色谱法。结合分析各种离子的方法并称为离子色谱法。适用于分离阴、阳离子，以及氨基酸、糖类、适用于分离阴、阳离子，以及氨基酸、糖类、DNA和和DNA水解物等。水解物等。第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理 分析化学分析化学23（四）亲和色谱法（四）亲和色谱法（ACAC）亲和色谱法是将具有生物活性的配位基键合到载亲和色谱法是将具有生物活性的配位基键合到载体或基质表面形成固定相，利用蛋白质和生物大体或基质表面形成固定相，利用蛋白质和生
16、物大分子与固定相表面上配位基的专属性亲和力进行分子与固定相表面上配位基的专属性亲和力进行分离的色谱方法。分离的色谱方法。是生物大分子分离和分析的重要方法。是生物大分子分离和分析的重要方法。第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理 分析化学分析化学24第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及选择一、固定相一、固定相uHPLC的固定相多采用化学的固定相多采用化学键合相。键合相。键合相的特点：键合相的特点：使用过程中不流失；使用过程中不流失；化学稳定性好；化学稳定性好；适用梯度洗脱；适用梯度洗脱；载样量大。载样量大。第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及选择第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及选择 分
17、析化学分析化学25第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及选择（一）非极性键合相（一）非极性键合相 非极性烃基，如非极性烃基，如C18C8等键合在等键合在硅胶硅胶表面；表面；用于反相色谱；用于反相色谱；长链烷基可使溶质的长链烷基可使溶质的k k增大，载样量提高，稳增大，载样量提高，稳定性更好。定性更好。分析化学分析化学26第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及选择键合反应键合反应 硅氧烷（硅氧烷（SiSiO OSiSiC C）型：氯硅烷与硅胶进行）型：氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应硅烷化反应 22SiOHClCH+SiSiSiClH18OR118HC3737RRR1 分析化学分析化学27第三节高效液
18、相色谱法的固定相和流动相及其选择（二）中等极性键合相（二）中等极性键合相醚基键合相醚基键合相用于反相或正相色谱用于反相或正相色谱（三）极性键合相（三）极性键合相常用氨基（常用氨基（NHNH2 2）氰基（氰基（CNCN）键合相）键合相一般用于正相色谱一般用于正相色谱 分析化学分析化学28第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择不与固定相发生反应。不与固定相发生反应。对试样有适宜的溶解度，要求对试样有适宜的溶解度，要求k在在110范围内。范围内。与检测器相匹配，例如用紫外检测器时，不能选与检测器相匹配，例如用紫外检测器时，不能选用对紫外光有吸收的溶剂。用对紫外光有吸收的溶剂。纯度高，黏度小。常
19、使用低黏度的甲醇、乙腈，纯度高，黏度小。常使用低黏度的甲醇、乙腈，可以降低柱压，提高柱效。可以降低柱压，提高柱效。二、化学键合相的流动相二、化学键合相的流动相u对流动相的要求：对流动相的要求：分析化学分析化学29第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择 u流动相对分离的影响：流动相对分离的影响：溶剂的配比影响流动相的洗脱能力，改变保留时间；溶剂的配比影响流动相的洗脱能力，改变保留时间；溶剂种类影响流动相的选择性，改变分离效果。溶剂种类影响流动相的选择性，改变分离效果。正相色谱法：溶剂的极性越强，洗脱能力越强。正相色谱法：溶剂的极性越强，洗脱能力越强。反相色谱法：溶剂的极性强，洗脱能力弱。反
20、相色谱法：溶剂的极性强，洗脱能力弱。分析化学分析化学30第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择例如：例如：水的极性大于甲醇，所以在反相色谱法中，甲醇水的极性大于甲醇，所以在反相色谱法中，甲醇的洗脱能力比水强，增大甲醇的比例，流动相的的洗脱能力比水强，增大甲醇的比例，流动相的洗脱能力增强，洗脱能力增强，k与与tR减小。减小。分析化学分析化学31第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择 分析化学分析化学32 分析化学分析化学33第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择正相键合相色谱法常选用乙醚、氯仿和二氯甲烷为极性正相键合相色谱法常选用乙醚、氯仿和二氯甲烷为极性调节剂，正己烷为底剂。
21、调节剂，正己烷为底剂。分析化学分析化学34第四节分离条件的选择第四节分离条件的选择第四节分离条件的选择一、一、高效液相色谱中的速率理论高效液相色谱中的速率理论uGC中的速率理论方程式：中的速率理论方程式：uHPLC中的速率理论方程式：中的速率理论方程式：H H=A A+C Cm mu u +C Csmsmu u 分析化学分析化学35第四节分离条件的选择u涡流扩散项涡流扩散项(A A)A A=2=2ddp p 减少固定相颗粒的直径减少固定相颗粒的直径（d dp p）；采用球形、粒度均匀的固定相，用匀浆法装柱，采用球形、粒度均匀的固定相，用匀浆法装柱，以减小填充因子以减小填充因子（同（同GC）。分
22、析化学分析化学36第四节分离条件的选择u纵向扩散项纵向扩散项(B/u)该项可忽略该项可忽略 B=2rDm 溶质在流动相中的扩散系数（溶质在流动相中的扩散系数（Dm）很小，室）很小，室温操作，且温操作，且u大于大于u最佳最佳。u传质阻力项（传质阻力项（Cu）固定相传质阻力：固定相传质阻力：CS可以忽略可以忽略，因，因df（固定液膜厚度）（固定液膜厚度）极小。极小。分析化学分析化学37第四节分离条件的选择流动相传质阻力：流动相传质阻力：Cm与固定相颗粒粒度（与固定相颗粒粒度（dp）及组分分子在流动相中的扩散）及组分分子在流动相中的扩散系数系数 Dm有关。有关。Dp越小，越小，Cm越小；越小；Dm越
23、大，越大，Cm越小。越小。要求：要求：dp小，小，Dm大。大。静态流动相传质阻力：静态流动相传质阻力：由部分流动相在固定相微孔内的滞留而产生。由部分流动相在固定相微孔内的滞留而产生。静态流动相传质阻抗系数静态流动相传质阻抗系数Csm Csm dp2，Csm 1/Dm，DmT/要求要求:固定相粒度（固定相粒度（dp2）、）、流动相黏度（流动相黏度（）都小。）都小。分析化学分析化学38第四节分离条件的选择uHPLC中的速率理论可表示为：中的速率理论可表示为：H=A+Cmu+Csmu 原因：原因：HPLC中流动相为液体，固定相为化中流动相为液体，固定相为化学键合相。学键合相。结果：结果：HPLC的实
24、验条件应该是：的实验条件应该是：小而均匀的球形化学键合相；小而均匀的球形化学键合相；低粘度的流动相，流速不宜过快；低粘度的流动相，流速不宜过快；柱温适当。柱温适当。分析化学分析化学39第四节分离条件的选择二、正相键合相色谱法的分离条件二、正相键合相色谱法的分离条件u固定相固定相极性键合相如氰基、氨基键合相等极性键合相如氰基、氨基键合相等u流动相流动相烷烃加适量极性调节剂（正己烷烷烃加适量极性调节剂（正己烷-甲醇）甲醇）分析化学分析化学40第四节分离条件的选择三、反相键合相色谱法的分离条件三、反相键合相色谱法的分离条件u固定相非极性键合相固定相非极性键合相 如如C18u流动相以水为基础溶剂，加入
25、甲醇、乙腈流动相以水为基础溶剂，加入甲醇、乙腈 等极性调节剂。等极性调节剂。分析化学分析化学41第五节高效液相色谱仪第五节高效液相色谱仪第五节高效液相色谱仪输液系统输液系统进样系统进样系统分离系统分离系统检测系统检测系统数据记录处理系统数据记录处理系统 u组成：组成：分析化学分析化学42 分析化学分析化学43进样口进样口检测器检测器色谱图色谱图色谱柱色谱柱溶剂溶剂高压泵高压泵混合器混合器高效液相色谱仪示意图高效液相色谱仪示意图第五节高效液相色谱仪 分析化学分析化学44u输液泵应具备的性能：输液泵应具备的性能：流量精度高且稳定流量精度高且稳定流量范围宽且可调流量范围宽且可调能在高压下连续工作能在
26、高压下连续工作液缸容积小液缸容积小密封性能好，耐腐蚀密封性能好，耐腐蚀第五节高效液相色谱仪一、输液系统（高压输液泵）一、输液系统（高压输液泵）分析化学分析化学45第五节高效液相色谱仪u高压输液泵：高压输液泵：恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定，常恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定，常用柱塞往复泵。用柱塞往复泵。双泵：为了克服流量的脉动，常用串联式。双泵：为了克服流量的脉动，常用串联式。分析化学分析化学46等强度洗脱等强度洗脱 在同一分析周期内流动相的组成保持恒定，适在同一分析周期内流动相的组成保持恒定，适合于组分数目少，性质差别小的试样。合于组分数目少，性质差别小的试样。梯度洗脱梯度洗脱 在一
27、个分析周期内，程序控制改变流动相的组在一个分析周期内，程序控制改变流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度、成，如溶剂的极性、离子强度、pHpH值等。分析组值等。分析组分数目多、性质差别大的复杂试样。分数目多、性质差别大的复杂试样。u洗脱方式：洗脱方式：第五节高效液相色谱仪 分析化学分析化学47第五节高效液相色谱仪u进样器进样器进样阀（六通阀），进样阀（六通阀），常用带有定量管的六通阀常用带有定量管的六通阀自动进样装置自动进样装置二、进样系统二、进样系统 分析化学分析化学48 分析化学分析化学49充样位置（充样位置（load)load)进样位置进样位置(inject)(inject)来自泵来自泵至
28、色谱柱至色谱柱 来自泵来自泵至色谱柱至色谱柱至至废废液液至至废废液液六通阀进样示意图六通阀进样示意图 第五节高效液相色谱仪 分析化学分析化学50u色谱柱色谱柱 由柱管和固定相组成由柱管和固定相组成可重复使用可重复使用实验结束，要用经过滤和脱气的适当溶剂冲洗实验结束，要用经过滤和脱气的适当溶剂冲洗色谱系统色谱系统 第五节高效液相色谱仪 分析化学分析化学51第五节高效液相色谱仪u对检测器对检测器的要求的要求：灵敏度（灵敏度（sensitivity）高（检测限低）高（检测限低）噪音（噪音（noise）低）低线性范围（线性范围（linear range）宽）宽重复性（重复性（repeatability
29、）好）好适用范围广（通用型、专属型）适用范围广（通用型、专属型）四、检测系统四、检测系统 分析化学分析化学52第五节高效液相色谱仪u检测原理：检测原理：朗伯朗伯-比尔定律：比尔定律：A=ECLu特点：特点：紫外检测器的灵敏度、精密度及线性范围好，紫外检测器的灵敏度、精密度及线性范围好，不易受温度和流速的影响，可用于梯度洗脱。不易受温度和流速的影响，可用于梯度洗脱。u局限：局限：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。长应小于检测波长。u为专属型、浓度型检测器。为专属型、浓度型检测器。（一）紫外检测器（一）紫外检测器 分析化学分析化学53
30、固定波长检测器固定波长检测器 ：254nm可变波长检测器：可变波长检测器：200400（800）nm，光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器(PDAD)：一系列光电二极管，可以进行波长快速扫描，一系列光电二极管，可以进行波长快速扫描，同时获得样品的色谱图和每个色谱组分的光谱图。同时获得样品的色谱图和每个色谱组分的光谱图。吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定量，量，判断峰纯度。判断峰纯度。第五节高效液相色谱仪u紫外检测器的紫外检测器的 分析化学分析化学54第五节高效液相色谱仪（二）荧光检测器（二）荧光检测器(FD)u特点：特点：选择性好，专属型检测器
31、选择性好，专属型检测器灵敏度比紫外检测器高（检测限灵敏度比紫外检测器高（检测限10-10 g/ml）分析化学分析化学55第五节高效液相色谱仪u微机采集和分析色谱数据微机采集和分析色谱数据 分析化学分析化学56 分析化学分析化学57图图1氨基酸标准品色谱氨基酸标准品色谱 图图2正常脑脊液色谱正常脑脊液色谱 分析化学分析化学58第六节定性与定量分析方法一、定性分析方法一、定性分析方法二、定量分析方法（同二、定量分析方法（同GCGC）：）：外标法外标法内标法内标法第六节第六节 定性与定量分析方法定性与定量分析方法 分析化学分析化学59白斑膏中克霉唑、氢化可的松等的检测白斑膏中克霉唑、氢化可的松等的检
32、测UV（紫外光检测器）液相色谱柱（紫外光检测器）液相色谱柱 分析化学分析化学60第六节 定性与定量分析1 1 外标法外标法 外标法是用待测组分的纯品作对照物，配制一系外标法是用待测组分的纯品作对照物，配制一系列不同浓度的标准液，进行色谱分析，以峰面积对浓列不同浓度的标准液，进行色谱分析，以峰面积对浓度作工作曲线。在相同操作条件下，对试样进行色谱度作工作曲线。在相同操作条件下，对试样进行色谱分析，算出样品中待测组分的峰面积，根据工作曲线分析，算出样品中待测组分的峰面积，根据工作曲线即可查出组分的含量。即可查出组分的含量。分析化学分析化学61第六节 定性与定量分析2 外标法外标法外标一点法外标一点
33、法:当待测样品中被测物的含量范围波当待测样品中被测物的含量范围波动不是很大时，可以采用直接比较法进行分动不是很大时，可以采用直接比较法进行分析。析。ssiimAAm 分析化学分析化学62第六节 定性与定量分析2 2 内标法内标法将一种纯物质作为内标物加入到将一种纯物质作为内标物加入到待测样品中，进行色谱定量的方法称为内待测样品中，进行色谱定量的方法称为内标法。组分含量计算公式为：标法。组分含量计算公式为：%100%sssiiimmAfAfc 分析化学分析化学63第六节 定性与定量分析 内标对比法（内标对比法（内标一点法）内标一点法）：先将被测组分的纯：先将被测组分的纯物配制成标准溶液，定量加入
34、内标物；再将同量的内物配制成标准溶液，定量加入内标物；再将同量的内标物加至同体积的样品溶液中，将两种溶液分别进样标物加至同体积的样品溶液中，将两种溶液分别进样测定，按下式计算组分含量：测定，按下式计算组分含量：标准标准样品样品（%)%isisiicAAAAc 分析化学分析化学642005年版二部年版二部354 鱼肝油鱼肝油YuganyouCod Liver Oil每每1g中含维生素中含维生素A应为标示量的应为标示量的90.0%120.0%【鉴别鉴别】（1）维生素）维生素A含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一
35、致。的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。（2）“供试品溶液供试品溶液B或定量分析柱系统中的维生素或定量分析柱系统中的维生素D流出液中主流出液中主峰的保留时间应与对照品溶液中相应的维生素峰的保留时间应与对照品溶液中相应的维生素D3主峰的保留时间一主峰的保留时间一致。致。”分析化学分析化学652005年版二部年版二部354【含量测定含量测定】维生素维生素A 取本品适量取本品适量,精密称定，加正己烷制成每精密称定，加正己烷制成每1ml中约含中约含45单位的溶液，照维生素单位的溶液，照维生素A测定法测定法(附录附录VII J)中的高效中的高效液相色谱法测定。液相色谱法测定。维生素维生素D3 取
36、本品取本品2g，照维生素测定法（附录，照维生素测定法（附录 K）测定）测定响应因子响应因子 取维生素测定法（附录取维生素测定法（附录 K）中的计算维生素）中的计算维生素D响应因响应因子子f1和计算前维生素和计算前维生素D的响应因子的响应因子f2的溶液适量，用正己烷稀释的溶液适量，用正己烷稀释至每至每1ml中含维生素中含维生素D3 0.625g的溶液。的溶液。分析化学分析化学66盐酸小檗碱修订修订 按无水物计算，含按无水物计算，含C20H18ClNO4提取品不得少于提取品不得少于 97.0，合成品不得少于，合成品不得少于98.0。【检查检查】有关物质有关物质 取本品适量，加流动相溶解并稀释制成每
37、取本品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含中含1.0mg的溶液，作为供试品溶液；另取盐酸药根碱对照品和盐的溶液，作为供试品溶液；另取盐酸药根碱对照品和盐酸巴马汀对照品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每酸巴马汀对照品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中含中含0.1mg的溶液，分别作为对照品溶液（的溶液，分别作为对照品溶液（1）和（）和（2）；精密）；精密量取供试品溶液量取供试品溶液2ml和对照品溶液（和对照品溶液（1）和（）和（2）各）各10ml，置，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；取对照品溶量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液
38、；取对照品溶液（液（2）1ml，用供试品溶液稀释至，用供试品溶液稀释至10ml，摇匀，作为系统适用性，摇匀，作为系统适用性试验用溶液。照高效液相色谱法试验用溶液。照高效液相色谱法(附录附录 D)测定，用十八烷基硅烷测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.01mol/L磷酸二氢铵溶液（用磷酸调磷酸二氢铵溶液（用磷酸调节节pH值为值为2.8）（）（25：75）为流动相；）为流动相；检测波长为检测波长为345nm。分析化学分析化学67盐酸小檗碱取系统适用性试验用溶液取系统适用性试验用溶液10l，注入液相色谱仪，巴马，注入液相色谱仪，巴马汀峰与小檗碱峰间的分离度应符合
39、规定；另取对照溶液汀峰与小檗碱峰间的分离度应符合规定；另取对照溶液10l注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使小檗碱色谱注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使小檗碱色谱峰的峰高为满量程的峰的峰高为满量程的20%25%。再精密量取对照溶液与。再精密量取对照溶液与供试品溶液各供试品溶液各10l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的至主成分色谱峰保留时间的2倍。供试品溶液的色谱图中，倍。供试品溶液的色谱图中，如显药根碱色谱峰和巴马汀色谱峰，按外标法以峰面积如显药根碱色谱峰和巴马汀色谱峰，按外标法以峰面积计算，均不得过计算，均不得过1.0%；其他杂质峰的峰面积
40、之和不得大；其他杂质峰的峰面积之和不得大于对照溶液中小檗碱峰的峰面积（于对照溶液中小檗碱峰的峰面积（2.0%）。）。分析化学分析化学68盐酸小檗碱水分水分 取本品，照水分测定法（附录取本品，照水分测定法（附录 M第一法第一法A）测）测定，含水分不得过定，含水分不得过12.0。分析化学分析化学691.1.化学键合相色谱法化学键合相色谱法正相化学键合相色谱法：固定相极性大于流动相极性正相化学键合相色谱法：固定相极性大于流动相极性反相化学键合相色谱法：固定相极性小于流动相极性反相化学键合相色谱法：固定相极性小于流动相极性 2.2.其他高效液相色谱法其他高效液相色谱法 离子抑制色谱法；离子对色谱法；离
41、子色谱法；亲和色谱法离子抑制色谱法；离子对色谱法；离子色谱法；亲和色谱法3.速率理论方程表达式：速率理论方程表达式：H=A+Cmu+Csmu。本章小结本章小结 分析化学分析化学704.4.化学键合相色谱法的固定相、流动相及化学键合相色谱法的固定相、流动相及分离条件的选择分离条件的选择正相键合相色谱法：正相键合相色谱法：固定相固定相为极性，常用氰基、氨基键合相为极性，常用氰基、氨基键合相 流动相为非极性，常用甲醇流动相为非极性，常用甲醇-水水 分离溶于有机溶剂的极性至中等极性化合物分离溶于有机溶剂的极性至中等极性化合物 反相键合相色谱法：反相键合相色谱法：固定相固定相为非极性，常用为非极性，常用C C1818流动相为极性，常用甲醇流动相为极性，常用甲醇-水水分离非极性至中等极性的分子型化合物分离非极性至中等极性的分子型化合物本章小结本章小结 分析化学分析化学715 5.高效液相色谱仪的组成高效液相色谱仪的组成 输液系统输液系统 进样系统进样系统 分离系统分离系统 检测系统检测系统 数据记录及处理系统数据记录及处理系统6 6HPLCHPLC定性与定量分析同定性与定量分析同GCGC 学习小结学习小结
