1、蛋白质组学定量研究常见方法 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 1 1：常规双向电泳：常规双向电泳o 2 2：DIGEDIGEo 3 3：1515N N等同位素标记等同位素标记o 4 4：ICATICATo 5 5：iTRAQiTRAQo 6 6：SILACSILAC 辉骏生物：辉骏生物：http:/ electrophoresis)的基本原理是利用蛋白质的等电点（pI)和分子量(Mr)不同而分离蛋白质：第一向电泳等电聚焦（Isoelectric Focusing，IEF）根据蛋白质的等电点不同将蛋白质分离，第二向电泳十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate
2、-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDSPAGE）利用蛋白质的分子量大小不同将蛋白质分离。双向电泳一次可以从细胞、组织或其它生物样本中分离上千种蛋白质，凝胶上的斑点都对应着样品中的蛋白质，且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能通过质谱鉴定和软件分析获得。因此其在蛋白质组分析、疾病标志物检测、细胞差异分析、药物开发、癌症研究等领域都得到了广泛的应用。o二：双向电泳分离蛋白质混合物具有以下优势：二：双向电泳分离蛋白质混合物具有以下优势：1、经典方法、应用范围广、适用于各类材料；2、经济实惠，可大规模多个样本筛选和分析。辉骏生物：辉骏生物：http:/ 1
3、：双向电泳：双向电泳 基于基于2D-PAGE2D-PAGE的经典定量分的经典定量分析方法。析方法。1 1、样品准备、样品准备和定量：和定量：抽提对照组和各种不同实验组的蛋白质。2 2、蛋白质分、蛋白质分离：离：蛋白质经过2D-PAGE分离后染色（银染、考染等）。3、蛋白质的、蛋白质的定性与定量分定性与定量分析：析：通过与对照组相Image Master 7.0分析出实验组中差异点，质谱鉴定差异点蛋白质,同时应用软件分析出其表达量的变化。2 2：DIGEDIGE 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 双向荧光差异凝胶电泳，利用荧光染料（Cy2,Cy3,Cy5）能与蛋白质赖氨酸的氨基反应而使蛋白质被标
4、记，标记后蛋白质的等电点和分子量基本不受影响，等量混合标记好的蛋白质后进行双向电泳，蛋白质表达量的变化则通过不同荧光的强度来体现。技术优势：技术优势：1：高效性，同一块凝胶上可以电泳两个样品，减轻了工作量；2：与常规银染相比灵敏度更高；3：检测动态范围更大；4：定量精确,采用内标而消除了胶与胶之间的实验误差；5：统计学分析，ImageMaster7.0（DIGE）软件可以得到统计学可信的结果，降低了操作者之间的偏差。2 2：DIGEDIGE DIGEDIGE荧光定量方法流程图荧光定量方法流程图.1 1、样品准备、样品准备：提取对照组和不同实验组的蛋白质,定量,cy3和cy5交叉标记，同时将所有
5、实验组与对照组的样品等量混合后cy2标记，作为内标。2 2、蛋白质分离：、蛋白质分离：等量混合三种荧光素标记后的蛋白质，2D-PAGE电泳分离，荧光显色。3 3、蛋白质定量分析：、蛋白质定量分析：Image Master 7.0（DIGE)分析同一蛋白质不同处理后的表达量变化。3 3：代谢标记法：代谢标记法1515N N标记法标记法简介：简介：在培养基中添加15N，细胞经过若干代培养后，蛋白质将完全被同位素标记，等量混合标记与没有标记同位素的样本、液相色谱和SDS-PAGE分离，质谱鉴定和定量。根据质谱谱图中成对峰的面积之比可判断出同一肽段在不同样品中的含量变化，根据二级谱图对肽段进行序列测定
6、从而鉴定蛋白质。优点：优点：高效性：15N标记法是体内标记技术，标记效率可高达95%；重现性：降低由于样品制备不同而造成的实验内差异；灵活性：在培养基中添加同位素标记15N，操作方便。缺点：缺点：（1）只有已知蛋白质的氨基酸序列，才可以对14N/15N标记的蛋白质或肽段的相应质量位移进行预测。（2）由于使用的15N培养基纯度96%，无法完全置换14N,所以15N标记的肽段在质谱中会有额外的同位素峰。辉骏生物：辉骏生物：http:/ 4：化学标记法：化学标记法ICATICATA:ICAT试剂结构，包括3个部分，SH反应集团，biotin标签，同位素臂，试剂具有两种形式：重型（含8个氘）和轻型（不
7、含氘）B:ICAT标记定量技术流程，来源不同处理的蛋白质分别用重型ICAT试剂和轻型ICAT试剂标记，标记后等量混合，胰蛋白酶酶切，亲和纯化得到ICAT标记的多肽，质谱分析，依据MS质谱峰图强度进行定量，MS/MS鉴定肽段。4 4：化学标记法：化学标记法ICATICATICATICAT法的缺点：法的缺点：（1）它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。（2）ICAT分子量相对较大（约500Da），与蛋白质连接后可能会造成分子的空间位阻 （3）ICAT分子量相对较大（约500Da），由于在MS分析中标签仍保留在每个肽上，使得在碰撞诱导解吸（CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特异化
8、的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复杂化，（4）ICAT分子量相对较大（约500Da），这对小肽而言是一个较大的修饰物，会增加数据库搜索的复杂性 （5）标记时通常需要延长时间来保证ICAT与蛋白质充分结合，这可能会造成赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸局部衍化。（6）与原子结合的硫醚键化学稳定性较低，可能会自发发生-消除反应使部分标签断裂。辉骏生物：辉骏生物：http:/ iTRAQ 结构结构 iTRAQ包括三部分：报告部分、肽反应部分、平衡部分。1、报告部分：有八种，因此iTRAQ可同时标记8组样品。2、肽反应部分：能与肽N端及赖氨酸侧链发生共价连接而标记上肽段，几乎可以标记所
9、有蛋白质。3、平衡部分：保证iTRAQ标记的同一肽段的质荷比相同。辉骏生物：辉骏生物：http:/ iTRAQ法。1：样本经过不同处理后，提取蛋白质;2：蛋白质经过还原，封闭后胰蛋白酶酶切;3：肽段混合物分别用不同的iTRAQ标记;4：等量混合各种iTRAQ试剂标记的肽段;5：MS/MS质谱检测及分析。辉骏生物：辉骏生物：http:/ isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)，其基本原理是在细胞培养时，采用含有轻、中、重同位素型必需氨基酸的培养基进行细胞培养，用于SILAC主要的稳定同位素氨基酸是Lys和Arg,细胞在传代
10、培养过程中同位素氨基酸将被细胞用于合成蛋白质，细胞经传代培养5-6代后，细胞的所有蛋白质将被同位素标记，等量混合标记的蛋白质后经过SDS-PAGE分离和质谱分析，通过比较一级质谱图中三个同位素型肽段的面积大小进行相对定量，同时二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。o由于SILAC标记技术是体内标记技术，几乎不影响细胞的功能，同时灵敏度高，因此其在蛋白质组学相关领域中得到了广泛的应用，如比较蛋白质组学，蛋白质与蛋白质相互作用，蛋白质与DNA相互作用，蛋白质与RNA相互作用等领域。辉骏生物：辉骏生物：http:/ 技术优势技术优势目前比较蛋白质组学最先进方法目前比较蛋白质组学最先进方法 （1）
11、高效性：）高效性：SILAC是体内标记技术，标记效率可高达100%；（2）定量精确：）定量精确：线性范围广，降低由于样品制备不同而造成的实验内差异；（3）高通量、灵敏度高：）高通量、灵敏度高：可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质，且检可测测到纳克级水平；（4）相容性：）相容性：可以对多种在DMEM或RPMI 1640培养基中能够培养的细胞或细菌中表达的蛋白进行标记；（5）灵活性：）灵活性：在缺乏L-赖氨酸和L-精氨酸的培养基中添加同位素标记的这两种氨基酸，操作方便。辉骏生物：辉骏生物：http:/ 6：SILACSILAC SILAC法。1、标记：在缺乏Lys和Arg的培养基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C6 15N4)、Arg(13C6,或13C6 15N4)等培养细胞，使蛋白质被标记成“中型”或“重型”；2、细胞处理，如药物处理；3、细胞裂解、提取蛋白质；4、等量混合对照与处理组蛋白质、SDS-PAGE电泳、染色；5、割取蛋白质条带，胰蛋白酶消化，质谱分析。THANKS!辉骏生物：辉骏生物：http:/
