1、蛋白质工程制药主要内容第一节 概述第二节 蛋白质的分子改造第三节 蛋白质工程在制药中的应用概述v蛋白质工程，是指在基因工程的基础上，结蛋白质工程，是指在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学，计算机辅助设计和蛋白质合蛋白质结晶学，计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识通过对基因的人工化学等多学科的基础知识通过对基因的人工定向改造等手段，对蛋白质进行修饰，改造定向改造等手段，对蛋白质进行修饰，改造和拼接以生产出能满足人类需要的新型蛋白和拼接以生产出能满足人类需要的新型蛋白质的技术。质的技术。v蛋白质工程制药是蛋白质工程在制药方面的蛋白质工程制药是蛋白质工程在制药方面的应用。应用。蛋白质工程程序
2、蛋白质工程程序蛋白类药物的种类多肽类多肽类蛋白类蛋白类一一 蛋白质工程的研究内容蛋白质工程的研究内容：1 利用已知的蛋白质一级结构的信息开发应用研究。利用已知的蛋白质一级结构的信息开发应用研究。2 定量确定蛋白质结构定量确定蛋白质结构-功能关系。这是目前蛋白功能关系。这是目前蛋白质工程研究的主体，它包括蛋白质三维结构模型质工程研究的主体，它包括蛋白质三维结构模型的建立，酶催化的性质、蛋白质折叠和稳定性研的建立，酶催化的性质、蛋白质折叠和稳定性研究等究等.3 从混杂变异体库中筛选具有特定结构从混杂变异体库中筛选具有特定结构-功能关系功能关系的蛋白质。的蛋白质。4 根据已知结构根据已知结构-功能关
3、系的蛋白质，用人工方法功能关系的蛋白质，用人工方法合成它及其变异体合成它及其变异体.二二 蛋白质工程的基本步骤蛋白质工程的基本步骤 1 1 分离纯化目的蛋白，使之结晶分离纯化目的蛋白，使之结晶,进行分析进行分析,得到其空间结构的尽可能多的信息。得到其空间结构的尽可能多的信息。2 2 对目的蛋白的功能作详尽的研究，确定它对目的蛋白的功能作详尽的研究，确定它的功能域。的功能域。3 3 通过对蛋白质的一级结构、空间结构和功通过对蛋白质的一级结构、空间结构和功能之间的相互关系分析，找出关键的基团和能之间的相互关系分析，找出关键的基团和结构。结构。v4围绕这些关键的基团和结构提出对蛋白质进围绕这些关键的
4、基团和结构提出对蛋白质进行改造的方案，并用基因工程的方法去实行改造的方案，并用基因工程的方法去实施。施。v v5对经过改造的蛋白质进行功能性测定对经过改造的蛋白质进行功能性测定.三三 蛋白质工程的改造策略蛋白质工程的改造策略1 1、疏水氨基酸常常出现在蛋白质的活动中心区域；、疏水氨基酸常常出现在蛋白质的活动中心区域；螺旋和螺旋和折叠区折叠区通常不会是酶的活性中心以及底物结通常不会是酶的活性中心以及底物结合的中心，而是作为结构的支架；环区、转角区域和合的中心，而是作为结构的支架；环区、转角区域和带电荷区域通常位于蛋白质的表面。带电荷区域通常位于蛋白质的表面。2 2、进行定点突变时，应注意保守氨基
5、酸残基。如果要、进行定点突变时，应注意保守氨基酸残基。如果要改变酶活性、底物结合活性等高度特异性的性质，则改变酶活性、底物结合活性等高度特异性的性质，则应尽量保留保守残基。应尽量保留保守残基。v3、应注意保留潜在的、应注意保留潜在的N糖基化位点糖基化位点(Asn-X-SerThr-X-Pro)中的中的Asn(天门冬酰胺天门冬酰胺)、Set(丝氨酸丝氨酸)或或Thr(苏氨酸苏氨酸)。v 4、对于含有内含子的序列，可以删除某一外显子、对于含有内含子的序列，可以删除某一外显子或外显子组合，因为单个外显子通常编码独立折叠或外显子组合，因为单个外显子通常编码独立折叠的结构域，删去该结构域后可能不会影响蛋
6、白其余的结构域，删去该结构域后可能不会影响蛋白其余部分的正确折叠。部分的正确折叠。v5、构建两个同源蛋白的嵌合体时，应尽量使其接、构建两个同源蛋白的嵌合体时，应尽量使其接合部位处在具有相同或相近功能的氨基酸序列中；合部位处在具有相同或相近功能的氨基酸序列中；而当两个非同源蛋白组成嵌合体时，则应使接合部而当两个非同源蛋白组成嵌合体时，则应使接合部分尽量位于所预测结构的边缘。分尽量位于所预测结构的边缘。v6、如果对目的蛋白的三维结构一无所知，那、如果对目的蛋白的三维结构一无所知，那么可以在目的序列中随机插入六聚体接头以么可以在目的序列中随机插入六聚体接头以鉴定功能性结构域。插入六聚体接头后，在鉴定
7、功能性结构域。插入六聚体接头后，在原蛋白质序列中添加两个氨基酸，比插入更原蛋白质序列中添加两个氨基酸，比插入更多的氨基酸对蛋白质整体功能的破坏要轻。多的氨基酸对蛋白质整体功能的破坏要轻。v7、进行缺失突变时，应避免直接利用天然存、进行缺失突变时，应避免直接利用天然存在的限制性酶切位点进行删除。在的限制性酶切位点进行删除。第二节、蛋白质的分子改造第二节、蛋白质的分子改造 在基因水平上对蛋白质进行改造，按改造的规在基因水平上对蛋白质进行改造，按改造的规模和程度可以分为：模和程度可以分为：初级改造：初级改造：个别氨基酸的改变和一整段氨基酸序列的个别氨基酸的改变和一整段氨基酸序列的删除、置换或插入删除
8、、置换或插入高级改造高级改造：蛋白质分子的剪裁，如结构域的拼接：蛋白质分子的剪裁，如结构域的拼接从头设计合成新型蛋白质从头设计合成新型蛋白质 v一、一、初级改造初级改造 v通过通过基因突变方法基因突变方法，以达到改变氨基酸进而，以达到改变氨基酸进而改造蛋白质的目的。改造蛋白质的目的。v目前，主要采用的基因突变方法：目前，主要采用的基因突变方法：基因定位突变基因定位突变盒式突变盒式突变。v基因定位突变基因定位突变v根据三联体密码，编码根据三联体密码，编码DNA（目的基因）的确定位（目的基因）的确定位点，改变其组成核苷酸的顺序或种类，使基因发生点，改变其组成核苷酸的顺序或种类，使基因发生定向变异，
9、使其控制合成的氨基酸种类、顺序发生定向变异，使其控制合成的氨基酸种类、顺序发生改变，合成出具有预期氨基酸序列的修饰蛋白质。改变，合成出具有预期氨基酸序列的修饰蛋白质。v这种通过造成一个或几个碱基这种通过造成一个或几个碱基定点突变定点突变，以达到修，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术技术。v基因定位突变的基本过程基因定位突变的基本过程：v首先使目的基因由环状载体折成单链，再对首先使目的基因由环状载体折成单链，再对指定的位点用寡聚核苷酸诱导或置入合成的指定的位点用寡聚核苷酸诱导或置入合成的寡聚核苷酸产生定位突变基因，最后将突变寡聚核
10、苷酸产生定位突变基因，最后将突变基因导入适宜的表达系统基因导入适宜的表达系统(如大肠杆菌等如大肠杆菌等)即即可产生突变体蛋白质。这是目前定向改造蛋可产生突变体蛋白质。这是目前定向改造蛋白质的基本手段。白质的基本手段。（1）M13-DNA寡聚核苷酸介导诱变技术寡聚核苷酸介导诱变技术 特点：特点：能够准确按照人们的意图进行能够准确按照人们的意图进行DNA突变，即想突变，即想改变哪一个碱基就只改变哪一个，其他的不变改变哪一个碱基就只改变哪一个，其他的不变基本过程：基本过程：将待研究的基因插入载体将待研究的基因插入载体M13，制得单链，制得单链模板，人工合成一段寡核苷酸（其中含一个或几个非模板，人工合
11、成一段寡核苷酸（其中含一个或几个非配对碱基）作为引物，合成相应的互补链，用配对碱基）作为引物，合成相应的互补链，用T4连接连接酶连接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双链分子酶连接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双链分子在胞内分别复制，因此就得到两种类型的噬菌斑，含在胞内分别复制，因此就得到两种类型的噬菌斑，含错配碱基的就为突变型。再转入合适的表达系统合成错配碱基的就为突变型。再转入合适的表达系统合成突变型蛋白质。突变型蛋白质。（2）寡核苷酸介导的寡核苷酸介导的PCR诱变技术诱变技术 特点：特点：利用利用PCRPCR技术定点诱变，可使突变体大技术定点诱变，可使突变体大量扩增，提高诱变率量扩增，提
12、高诱变率 以研究基因为模板，用人工合成的寡核苷酸以研究基因为模板，用人工合成的寡核苷酸（含有一个或几个非互补的碱基）为引物，直接（含有一个或几个非互补的碱基）为引物，直接进行基因扩增反应，就会产生突变型基因。分离进行基因扩增反应，就会产生突变型基因。分离出突变型基因后，在合适的表达系统中合成突变出突变型基因后，在合适的表达系统中合成突变型蛋白质。这种方法直接、快速和高效。型蛋白质。这种方法直接、快速和高效。v过程：过程：v将目的基因克隆到质粒载体上，质粒分置于两管中，每管各将目的基因克隆到质粒载体上，质粒分置于两管中，每管各加入两个特定的加入两个特定的PCR引物，一个引物与基因内部或其附近的引
13、物，一个引物与基因内部或其附近的一段序列完全互补，另一引物和另一段序列互补，但有一个一段序列完全互补，另一引物和另一段序列互补，但有一个核苷酸发生了突变；核苷酸发生了突变；v两管中，不完全配对的引物与两条相反的链结合，即两个突两管中，不完全配对的引物与两条相反的链结合，即两个突变引物是互补的。由于两个反应中引物的位置不同，所以变引物是互补的。由于两个反应中引物的位置不同，所以PCR扩增后，产物有不同的末端。扩增后，产物有不同的末端。v将两管将两管PCR产物混合、变性、复性，则每条链会与另一管中产物混合、变性、复性，则每条链会与另一管中的互补链退火，形成有两个切口的环状的互补链退火，形成有两个切
14、口的环状DNA，转入大肠杆菌，转入大肠杆菌后，这两个切口均可被修复。若同一管子中的两条后，这两个切口均可被修复。若同一管子中的两条DNA链结链结合，会形成线性合，会形成线性DNA分子，它不能在大肠杆菌中稳定存在，分子，它不能在大肠杆菌中稳定存在，只有环状只有环状DNA才能在大肠杆菌中稳定存在，而绝大多数的环才能在大肠杆菌中稳定存在，而绝大多数的环状分子都含有突变基因。状分子都含有突变基因。（3）盒式突变技术）盒式突变技术 l19851985年年WellsWells提出的一种基因修饰技术，可经过一提出的一种基因修饰技术，可经过一次修饰，在一个位点上产生次修饰，在一个位点上产生2020种不同氨基酸
15、的突变种不同氨基酸的突变体，从而可以对蛋白质分子中某些氨基酸进行体，从而可以对蛋白质分子中某些氨基酸进行“饱饱和性和性”分析。分析。盒式突变是定点突变的一种方式。即在某一氨盒式突变是定点突变的一种方式。即在某一氨基酸位点进行基酸位点进行“饱和性饱和性”突变。系在合成寡核苷酸突变。系在合成寡核苷酸到某目的改变的氨基酸时，反应系统中同时加入到某目的改变的氨基酸时，反应系统中同时加入4种种dNTP，以期出现每一种密码。将这混合的寡核，以期出现每一种密码。将这混合的寡核苷酸引入克隆，并转化宿主，则可能获得在目的位苷酸引入克隆，并转化宿主，则可能获得在目的位点有各种氨基酸的突变株，有利于研究不同氨基酸点
16、有各种氨基酸的突变株，有利于研究不同氨基酸对蛋白质的结构和功能的影响。对蛋白质的结构和功能的影响。二、蛋白质分子的高级改造（结构域的拼接）二、蛋白质分子的高级改造（结构域的拼接）研究证明，在二级结构和三级结构之间还有一个结研究证明，在二级结构和三级结构之间还有一个结构层次，即结构域。构层次，即结构域。结构域由结构域由螺旋、螺旋、折叠等二级结构单位按一定的折叠等二级结构单位按一定的拓扑学规则构成的三维结构实体。拓扑学规则构成的三维结构实体。结构域是蛋白质分子中一种基本的结构单位，结构结构域是蛋白质分子中一种基本的结构单位，结构域拼接是通过基因操作把位于两种不同蛋白质上的几域拼接是通过基因操作把位
17、于两种不同蛋白质上的几个结构域连接在一起，形成融合蛋白，它兼有原来两个结构域连接在一起，形成融合蛋白，它兼有原来两种蛋白的性质。种蛋白的性质。三、全新蛋白质的设计与构建三、全新蛋白质的设计与构建 上述两种蛋白质改造方法，通常是从一个已知顺序、上述两种蛋白质改造方法，通常是从一个已知顺序、结构和功能的蛋白质出发，根据一定的目标和设计方结构和功能的蛋白质出发，根据一定的目标和设计方案，使用多肽合成或者基因工程的方法，改变它的结案，使用多肽合成或者基因工程的方法，改变它的结构，以期达到改变其性质的目的。构，以期达到改变其性质的目的。如果要从头设计和构建一个自然界不存在的蛋白质，如果要从头设计和构建一
18、个自然界不存在的蛋白质，则需要借助多功能模板和蛋白质二级结构元件组装成则需要借助多功能模板和蛋白质二级结构元件组装成某种具有特定功能的人工蛋白质分子。某种具有特定功能的人工蛋白质分子。蛋白质工程自问世以来，短短十几年的时间，已取得蛋白质工程自问世以来，短短十几年的时间，已取得了引人瞩目的进展，在医学和工业用酶方面也获得了了引人瞩目的进展，在医学和工业用酶方面也获得了良好的应用前景。良好的应用前景。提高蛋白的稳定性包括以下几个方面提高蛋白的稳定性包括以下几个方面：延长酶的半衰期；延长酶的半衰期；提高酶的热稳定性；提高酶的热稳定性；延长药用蛋白的保存期；延长药用蛋白的保存期；抵御由于重要氨基酸氧化
19、引起的活性丧失。抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。第三节第三节 蛋白质工程在制药方面的应用蛋白质工程在制药方面的应用一、一、消除酶的被抑制特性消除酶的被抑制特性 19851985年，美国的埃斯特尔借助寡核苷酸介导的定位年，美国的埃斯特尔借助寡核苷酸介导的定位突变技术，用突变技术，用1919种其他氨基酸分别替代枯草芽孢杆菌种其他氨基酸分别替代枯草芽孢杆菌蛋白酶分子第蛋白酶分子第222222位残基上易氧化的位残基上易氧化的MetMet，获得了一系，获得了一系列活性差异很大的突变酶。发现除了用列活性差异很大的突变酶。发现除了用CysCys代替代替MetMet的的突变体以外，其他突变体的酶活性都降
20、低了。突变体以外，其他突变体的酶活性都降低了。二、引入二硫键，改善蛋白质的热稳定性二、引入二硫键，改善蛋白质的热稳定性 在高温下在高温下AsnAsn和和GlnGln容易脱氨形成容易脱氨形成AspAsp和和GluGlu，而导，而导致蛋白质分子构象的改变，使蛋白质失去活性。致蛋白质分子构象的改变，使蛋白质失去活性。对酿酒酵母的磷酸丙糖异构酶进行诱变改造。这对酿酒酵母的磷酸丙糖异构酶进行诱变改造。这种酶有两个相同的亚基，每个亚基含有种酶有两个相同的亚基，每个亚基含有2 2个个AsnAsn，由，由于它们都位于亚基之间的界面上，可能对酶的热稳于它们都位于亚基之间的界面上，可能对酶的热稳定性起决定性作用。
21、定性起决定性作用。通过寡核苷酸介导的定向诱变技术，将第通过寡核苷酸介导的定向诱变技术，将第1414位和位和第第7878位上的位上的2 2个个AsnAsn分别转变成分别转变成Thr(Thr(苏氨酸苏氨酸)和和Ile(Ile(异亮氨酸异亮氨酸)残基，大幅度提高突变酶的热稳定残基，大幅度提高突变酶的热稳定性。性。三、转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性三、转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性 四、四、改变酶的最适改变酶的最适pH值条件值条件 葡萄糖异构酶最适葡萄糖异构酶最适pHpH为碱性，在为碱性，在8080稳定，而在碱稳定，而在碱性条件下，性条件下，8080时使高果糖浆焦化产生有害物质，时使高果糖浆焦
22、化产生有害物质，反应只能在反应只能在6060进行。进行。采用盒式突变技术将葡萄糖异构酶分子中酸性氨基采用盒式突变技术将葡萄糖异构酶分子中酸性氨基酸酸(Glu(Glu或或Asp)Asp)集中的区域置换为碱性氨基酸集中的区域置换为碱性氨基酸(Arg(Arg或或Lys)Lys)，可使葡萄糖异构酶的最适，可使葡萄糖异构酶的最适pHpH值变为酸性，即可值变为酸性，即可在高温下进行反应。在高温下进行反应。五、提高酶的催化活性五、提高酶的催化活性 酶的催化活性由酶分子上的必需基团决定酶的催化活性由酶分子上的必需基团决定如对酪氨酸如对酪氨酸-tRNA-tRNA合成酶进行定点突变合成酶进行定点突变在天然状态下，
23、酪氨酸在天然状态下，酪氨酸-tRNA-tRNA合成酶分子内第合成酶分子内第5151位苏位苏氨酸残基的羟基能与底物酪氨酰腺嘌呤核苷酸戊糖环氨酸残基的羟基能与底物酪氨酰腺嘌呤核苷酸戊糖环上的氧原子形成氢键，这个氢键的存在影响酶分子与上的氧原子形成氢键，这个氢键的存在影响酶分子与另一底物另一底物ATPATP的亲和力。因此，利用定向诱变技术将酶的亲和力。因此，利用定向诱变技术将酶分子第分子第5151位苏氨酸残基改变为脯氨酸残基，酶位苏氨酸残基改变为脯氨酸残基，酶(Pro-51)(Pro-51)与与ATPATP的亲和力被增加了，而且最大反应速度亦大幅度的亲和力被增加了，而且最大反应速度亦大幅度提高。提高
24、。六、修饰酶的催化特异性六、修饰酶的催化特异性 利用定点突变技术葡萄糖淀粉酶的催化特性。如将活性中心利用定点突变技术葡萄糖淀粉酶的催化特性。如将活性中心的的GLuGLu、AspAsp被被GlnGln、AsnAsn取代时，突变体酶分解取代时，突变体酶分解-1-1，4 4糖苷键和糖苷键和-1-1，4 4糖苷键的活性比例发生明显改变。糖苷键的活性比例发生明显改变。七、修饰七、修饰Nisin的生物防腐效应的生物防腐效应 Nisin是乳酸球菌分泌的有较强抗菌作用的小分子肽，是乳酸球菌分泌的有较强抗菌作用的小分子肽，Nisin由由34个氨基酸残基构成。个氨基酸残基构成。可用于罐头食品、乳制品、肉制品的可用
25、于罐头食品、乳制品、肉制品的保藏。保藏。是一种天然防腐剂、抑菌剂，食用后在消化道中很快被是一种天然防腐剂、抑菌剂，食用后在消化道中很快被蛋白水解酶消化成氨基酸。它不会改变肠道内的正常菌群，不蛋白水解酶消化成氨基酸。它不会改变肠道内的正常菌群，不会引起抗药性问题，亦不会与其它抗生素出现交叉抗性，各国会引起抗药性问题，亦不会与其它抗生素出现交叉抗性，各国毒理学试验证明毒理学试验证明YP-1000 Nisin是安全、无毒副作用的。是安全、无毒副作用的。改变改变NisinNisin氨基酸的序列，可增强其稳定性、溶氨基酸的序列，可增强其稳定性、溶解度和扩大抑菌谱等，扩大解度和扩大抑菌谱等，扩大Nisin
26、Nisin的应用范围。的应用范围。NisinNisin分子结构中包含分子结构中包含5 5种稀有氨基酸，即种稀有氨基酸，即ABAABA、DHADHA、DHBDHB、ALA-S-ALAALA-S-ALA和和ALA-S-ABAALA-S-ABA，它们通过硫醚键形成，它们通过硫醚键形成五个内环。五个内环。药物设计的改造 作为改变糖尿病患者命运的重要发现,胰岛素是糖尿病治疗中不可或缺的药物。传统胰岛素基本上都有见效慢、药效过长等问题。也就是说,患者需要在就餐前提早较长的时间注射胰岛素;而当其血糖降低到适度情况下之后,胰岛素的降糖效果可能会持续作用,容易导致低血糖的出现。胰岛素类似物的研发,能更好地模拟正
27、常人体生理降糖模式,使糖尿病患者最大程度获益。胰岛素类似物是采用基因工程技术,经过修饰人胰岛素分子的氨基酸序列而成的。一、速效胰岛素类似物一、速效胰岛素类似物:临床上主要的速效胰岛素类似物产品有赖脯胰岛素、门冬胰岛素。赖脯胰岛素:是胰岛素链第28位脯氨酸与29位的赖氨酸互换位置而得到的。门冬胰岛素:是将胰岛素链上28位脯氨酸替换成门冬氨酸而成。速效胰岛素的特点是:打开了常规胰岛素的六聚体形式,而成为单体结构,注射后不需要再分离成单体的过程,吸收快,起效时间短,进餐时不需提前注射,作用时间为13小时,主要用于降低餐后血糖,因而用于餐时注射时低血糖反应少见,可适用于各种类型的糖尿病治疗。二、长效胰
28、岛素类似物二、长效胰岛素类似物:临床上主要的长效胰岛素类似物产品有甘精胰岛素、地特胰岛素。长效胰岛素类似物经皮下注射后,吸收和扩散缓慢、药物吸收稳定,以极其缓慢的速度释放进入血液,具备血浆浓度平稳、峰谷曲线小,且作用持续时间长的特点。v三、预混胰岛素类似物三、预混胰岛素类似物:又叫双时相胰岛素类似物,保留了速效的特性而又兼具中长效的特点,如预混胰岛素类似物双时相门冬胰岛素30(含30%门冬胰岛素和70%精蛋白门冬胰岛素)。研究提示,与预混人胰岛素相比,双时相门冬胰岛素30的速效成分注射后达峰更快、峰值更高,中效成分则持续缓慢被吸收,提供有效的基础胰岛素水平。因此,可同时满足基础和餐时胰岛素需求,将更有利于理想血糖的控制。
