1、 蛋白质的研究方法蛋白质的研究方法 第一节第一节 蛋白质提取蛋白质提取目的蛋白研究基本流程目的蛋白研究基本流程 分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质 测定蛋白质分子质量测定蛋白质分子质量蛋白质结构分析蛋白质结构分析蛋白质生物学活性分析蛋白质生物学活性分析探索结构与功能的关系探索结构与功能的关系一、蛋白质样品的提取一、蛋白质样品的提取目的蛋白的获取目的蛋白的获取直接从生物直接从生物体内获取体内获取基因工程表基因工程表达重组蛋白达重组蛋白采用免疫学方法获取相关抗体采用免疫学方法获取相关抗体获取蛋白质的编获取蛋白质的编码序列码序列(cDNA)基因组测序基因组测序基因组测序进行推导基因组测序进行推导获取部分肽
2、段氨基酸序列获取部分肽段氨基酸序列捕获相应蛋白质捕获相应蛋白质二、经典的细胞蛋白质分离纯化流程二、经典的细胞蛋白质分离纯化流程：清洗组织或细胞清洗组织或细胞裂解细胞裂解细胞离心除去膜组分等获得可溶性蛋白质离心除去膜组分等获得可溶性蛋白质离心、层析、电泳等进一步纯化离心、层析、电泳等进一步纯化获取产物蛋白获取产物蛋白1.细胞的破碎细胞的破碎各种组织和细胞的常用破碎方法各种组织和细胞的常用破碎方法细胞破碎方法细胞破碎方法 组织种类组织种类 旋刀式匀浆旋刀式匀浆 大多数动、植物组织大多数动、植物组织手动式匀浆手动式匀浆 柔软的动物组织柔软的动物组织高压匀浆高压匀浆 细菌、酵母、植物细胞细菌、酵母、植
3、物细胞研磨研磨 细菌、植物细胞细菌、植物细胞高速珠磨高速珠磨 细胞混悬液细胞混悬液酶溶酶溶 细菌、酵母细菌、酵母去垢剂渗透去垢剂渗透 组织培养细胞组织培养细胞有机溶剂渗透有机溶剂渗透 细菌、酵母细菌、酵母超声破碎超声破碎 细胞混悬液细胞混悬液低渗裂解低渗裂解 红细胞、细菌红细胞、细菌冻融裂解冻融裂解 培养细胞培养细胞 2.去污剂处理溶解去污剂处理溶解膜蛋白膜蛋白 去污剂为去污剂为双极性双极性(amphipathic)脂类分子，脂类分子，可在水中溶解。通常由线性或带有分枝的碳氢可在水中溶解。通常由线性或带有分枝的碳氢化合物尾部和结构各不相同的亲水性头部组成化合物尾部和结构各不相同的亲水性头部组成
4、SDSTriton X-100NP-40Tween-203.蛋白质分子的稳定蛋白质分子的稳定 在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑 制剂以防止蛋白水解制剂以防止蛋白水解PMSF(35 ug/ml)EDTA(0.3 mg/ml)Pepstatin(0.7 ug/ml)Leupeptin(0.5 ug/ml)Aprotinin(5 00unit/ml)目的：目的：保证蛋白质的生物活性保证蛋白质的生物活性 细胞内有许多种还原成分，一旦细胞破碎细胞内有许多种还原成分，一旦细胞破碎 由于和氧的接触以及稀释作用而使抗氧化由于和氧的接触以及稀释作用而使抗氧化 成分减少，导
5、致许多蛋白质被氧化而失去活成分减少，导致许多蛋白质被氧化而失去活 性，如巯基蛋白性，如巯基蛋白 常用的还原剂常用的还原剂 抗坏血酸抗坏血酸 巯基乙醇巯基乙醇(mercaptoethanol)二硫苏糖醇二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)蛋白质的环境因素蛋白质的环境因素 表面效应表面效应温度温度储存储存4.离心去除细胞碎片离心去除细胞碎片5.目标蛋白的纯化目标蛋白的纯化 1.盐析盐析(salting out)2.离子交换层析离子交换层析3.凝胶过滤层析凝胶过滤层析4.亲和亲和层析层析层析的基本理论层析的基本理论1906年年 M.Tswett Adsorption Chromatog
6、raphy1941年年 Martin and Synge Partition Chromatography Plate theory Rate theory 假设有两种互不混溶的溶剂假设有两种互不混溶的溶剂S和和M，将，将A物质溶于一物质溶于一 定量的定量的S溶剂中，再加入一定量的溶剂中，再加入一定量的M溶剂溶剂 A物质在两相中相互扩散物质在两相中相互扩散 A物质在两相中达到了平衡物质在两相中达到了平衡(在同一时间内，进出两在同一时间内，进出两 相的相的A物质的分子数完全相等物质的分子数完全相等)时，其分配系数为常数时，其分配系数为常数 一、分配定律一、分配定律CAS 分配定律表明：分配定律表
7、明：v 一定的条件下，一定的物质其一定的条件下，一定的物质其K值值不变不变v 条件改变其条件改变其K值随之改变值随之改变v K值大于值大于1，物质在，物质在S相中的浓度大于其在相中的浓度大于其在M相中相中浓度浓度CAM=K二、分配层析的机理二、分配层析的机理 假设有两种物质，在一定的条件下，它们的分配假设有两种物质，在一定的条件下，它们的分配系数系数K不同，则通过一根分配层析柱可以将它们分离。不同，则通过一根分配层析柱可以将它们分离。为了便于讨论，我们做如下几个假设：为了便于讨论，我们做如下几个假设：（1）层析柱可分成许多层，）层析柱可分成许多层，M是流动相，是流动相，S是固定是固定相，相，M
8、和和S是互不混溶是互不混溶 （2）分配层析柱中，每一层左右相通，层与层之间）分配层析柱中，每一层左右相通，层与层之间互不相通，也就是说在层析柱中只有横向扩散而无纵互不相通，也就是说在层析柱中只有横向扩散而无纵向扩散向扩散 分配层析柱理论塔板示意图分配层析柱理论塔板示意图（3）在分配层析柱中，溶质在两相中达到分配平）在分配层析柱中，溶质在两相中达到分配平衡的速度很快，并且衡的速度很快，并且A物质的存在不影响物质的存在不影响B物质的物质的分配性质，反之亦然分配性质，反之亦然 （4）在该溶剂系统中，）在该溶剂系统中，A和和B两物质的分配系数两物质的分配系数分别设为：分别设为：KA=CASCAM=1K
9、B=CBSCBM=1/3 如果在层析开始时，在第一层的如果在层析开始时，在第一层的S相中同时加相中同时加入入A和和B两种物质，加入的量均为两种物质，加入的量均为1。根据分配。根据分配定律，定律，M加入后，在两相中立刻进行分配，并加入后，在两相中立刻进行分配，并且很快达到分配平衡。第一次分配前后且很快达到分配平衡。第一次分配前后A和和B物物质在质在S和和M相中的量为：相中的量为：A和和B物质在层析柱中物质在层析柱中1.分配分配10次；次；2.分配分配20次；次；3.分配分配30次次二者之间总是存在着一定的偏差，这是因为：二者之间总是存在着一定的偏差，这是因为：层析柱中总是或多或少地存在着纵向扩散
10、层析柱中总是或多或少地存在着纵向扩散 层析过程不可能在绝对分配平衡的情况下进行层析过程不可能在绝对分配平衡的情况下进行 理论曲线和实际洗脱曲线是否相符？理论曲线和实际洗脱曲线是否相符？因此，通常实际的洗脱曲线都比理论曲线低而宽因此，通常实际的洗脱曲线都比理论曲线低而宽 Martin和和Synge计算了硅胶柱的理论塔板数，计算了硅胶柱的理论塔板数，求得一个理论塔板的高度为求得一个理论塔板的高度为0.002厘米厘米 Verzele计算为计算为0.02厘米厘米 1厘米的层析柱最少有厘米的层析柱最少有50个理论塔板，那么，个理论塔板，那么，在一根在一根20厘米的层析柱上最少可以进行厘米的层析柱上最少可
11、以进行1000 次分配。次分配。一根分配层析柱上到底能进行多少次分配？一根分配层析柱上到底能进行多少次分配？塔板理论的要点：塔板理论的要点：分配层析柱象分馏柱一样可以分成很多层，每层为分配层析柱象分馏柱一样可以分成很多层，每层为 一理论塔板，其高度为理论塔板高度。在一定的一理论塔板，其高度为理论塔板高度。在一定的 条件下，一根分配层析柱的理论塔板数是一定的条件下，一根分配层析柱的理论塔板数是一定的 在分配层析柱中，物质只有横向扩散，没有纵向扩在分配层析柱中，物质只有横向扩散，没有纵向扩 散，而且在两相间达到分配平衡的速度很快散，而且在两相间达到分配平衡的速度很快 体系中其他物质的存在不影响待分
12、离物质的分配。体系中其他物质的存在不影响待分离物质的分配。待分离物质的存在也不影响其他物质的分配待分离物质的存在也不影响其他物质的分配 在分配层析柱上，物质在各个理论塔板中的含量可在分配层析柱上，物质在各个理论塔板中的含量可 通过计算求得通过计算求得三、三、塔板理论塔板理论6.蛋白质的检测和鉴定蛋白质的检测和鉴定光谱学特性光谱学特性190200 nm230300 nm电泳检测电泳检测SDS-PAGEIEF分子量测定分子量测定凝胶过滤层析凝胶过滤层析 沉降平衡超速离心沉降平衡超速离心动态弹性光散射动态弹性光散射 孔径梯度电泳孔径梯度电泳质谱质谱氨基酸序列测定氨基酸序列测定用抗体检测蛋白质用抗体检
13、测蛋白质蛋白质免疫印迹蛋白质免疫印迹免疫共沉淀免疫共沉淀 第二节第二节 蛋白质的定性定量分析蛋白质的定性定量分析 蛋白质定性分析蛋白质定性分析(qualitative analysis)确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质的是何种蛋白质 蛋白质定量分析蛋白质定量分析(quantitative analysis)确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成分的含量白成分的含量一、蛋白质的含量测定一、蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定基于蛋白质的基于蛋白质的元素组成特点元素组成特点基于蛋白质的基于蛋白质
14、的化学显色反应化学显色反应基于蛋白质的基于蛋白质的光吸收特性光吸收特性 蛋白质元素组成的特点蛋白质元素组成的特点各种蛋白质的含氮量很接近，平均为各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16 由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数每克样品含氮克数 6.251001/16%1.紫外光谱紫外光谱(A280)吸收法吸收法 这一方法可用来快速检测溶液中是否含有这一方法可
15、用来快速检测溶液中是否含有蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋白质的洗脱峰白质的洗脱峰原原 理理 色氨酸、酪氨酸的最色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在大吸收峰在280 nm附近附近 大多数蛋白质含有这两大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液蛋白质溶液280 nm的光吸的光吸收值是分析溶液中蛋白质收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法含量的快速简便的方法芳香族氨基酸的紫外吸收芳香族氨基酸的紫外吸收优优 点点 快速快速缺缺 点点 核酸可引起强干扰作用核酸可引起强干扰作用芳香族氨基酸含量差异可以芳香族氨基酸含量差异可以起误差起
16、误差 对蛋白质无破坏性对蛋白质无破坏性 不是严格的定量，适用于测定蛋不是严格的定量，适用于测定蛋 白质粗提液白质粗提液 计算方法计算方法 标准曲线法标准曲线法 蛋白质浓度蛋白质浓度(mg/ml)=1.45A280-0.74A260注意事项注意事项 石英比色杯石英比色杯 调零所用溶液调零所用溶液 配制标准蛋白所用溶液配制标准蛋白所用溶液 光密度范围光密度范围2.考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250检测法检测法 这是一种迅速、可靠的通过染色法测定这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质含量的方法溶液中蛋白质含量的方法原原 理理 该法是基于考马斯亮蓝该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种有红、蓝
17、两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物在在595 mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测中蛋白质浓度成正比，因此可检测595 mn的光的光吸收值大小计算蛋白的含量吸收值大小计算蛋白的含量所需时间所需时间 10 min优优 点点 快速（反应时间仅需快速（反应时间仅需2 min）敏感，几乎没有蛋白质损失敏感，几乎没有蛋白质损失缺缺
18、点点 用这种测定方法对蛋白质引起不用这种测定方法对蛋白质引起不 可逆的变性可逆的变性 对各种纯化蛋白质反应不同对各种纯化蛋白质反应不同计算方法计算方法 标准曲线法标准曲线法注意事项注意事项 反应反应1015 min后开始出现沉淀，后开始出现沉淀，尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条 件下易发生沉淀件下易发生沉淀 若选用目的蛋白来做标准曲线或用若选用目的蛋白来做标准曲线或用 另一种方法来校正，所测蛋白浓度另一种方法来校正，所测蛋白浓度 较准确较准确3.Lowry检测法检测法 这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得到广泛应用得到广泛应用.
19、原原 理理 首先在碱性溶液中形成铜首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂磷钨酸试剂(Folin-酚试剂酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在这种深蓝色的复合物在745 750 nm处有最大处有最大的吸收峰，颜色的深浅的吸收峰，颜色的深浅(吸收值吸收值)与蛋白质浓度与蛋白质浓度成正比，可根据成正比，可根据750 nm的光吸收值大小计算的光吸收值大小计算蛋白质的含量蛋白质的含量优优 点点 一种可靠的蛋白质定量方法一种可靠的蛋白质定量方法 不同蛋白质之间差别很小不同蛋白质之间差别
20、很小缺缺 点点 某些试剂不稳定某些试剂不稳定 干扰物质多干扰物质多 使蛋白质发生不可逆变性使蛋白质发生不可逆变性计算方法计算方法 标准曲线法标准曲线法注意事项注意事项 在加入试剂在加入试剂30 min后呈色达到饱后呈色达到饱 和，时间延长颜色信号减弱和，时间延长颜色信号减弱 许多干扰物质降低颜色反应许多干扰物质降低颜色反应 高盐浓度可引起沉淀高盐浓度可引起沉淀4.BCA(二喹啉甲酸二喹啉甲酸)检测法检测法 这是近年来新研制的一种改进的这是近年来新研制的一种改进的Lowry测定法测定法原原 理理 在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2生成络合物，同时将生成络合
21、物，同时将Cu2还原成还原成Cu。而而BCA试剂可敏感特异地与试剂可敏感特异地与Cu结合，形成结合，形成稳定的有颜色的复合物，在稳定的有颜色的复合物，在562 nm处有高的处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量优优 点点 检测敏感性高检测敏感性高缺缺 点点 蛋白质发生不可逆的变性蛋白质发生不可逆的变性 终产物稳定终产物稳定巯基试剂和去垢剂干扰巯基试剂和去垢剂干扰第三节第三节 蛋白质相对分子量测定蛋白质相对分子量测定分子量测定分子量测定(molecular weight,MW
22、)凝胶层析凝胶层析沉降平衡超速离心沉降平衡超速离心动态弹性光散射动态弹性光散射孔径梯度电泳孔径梯度电泳（SDS-PAGE）质谱质谱(ESI-MS)一、一、SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量测定蛋白质的相对分子量1.不连续系统原理不连续系统原理2.SDS-PAGE凝胶的制备凝胶的制备制备分离胶制备分离胶制备浓缩胶制备浓缩胶加样加样装板装板电泳电泳卸板并进行凝胶染色卸板并进行凝胶染色3.SDS-PAGE基本原理基本原理 SDS 影响迁移率的因素影响迁移率的因素l 十二烷基十二烷基硫硫酸钠酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate)l 十二烷基十二烷基磺磺酸钠酸钠(Sodium Dode
23、cyl Sulfonate)SDS作用：作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大与蛋白牢固结合，当其浓度大于于1 mmol/L 时，时，SDS与蛋白质的结合比例为与蛋白质的结合比例为 1.4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成形成的的SDS-蛋白质复合物都带有蛋白质复合物都带有相同密度的负电相同密度的负电荷荷，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异 SDS-蛋白质复合物蛋白质复合物分子构型分子构型也几乎相同也几乎相同(雪茄雪茄烟形的长椭圆棒状的复合物烟形的长椭圆棒状的复
24、合物)，而且具有相同的，而且具有相同的荷质比荷质比，因此在，因此在SDS-PAGE中，中，SDS-蛋白质复蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关，而不再合物的电泳迁移率只与其分子量有关，而不再受所带电荷及分子形状的影响，且在一定条件受所带电荷及分子形状的影响，且在一定条件下，迁移率与分子量呈对数线性关系下，迁移率与分子量呈对数线性关系 在不连续电泳系统中，含有在不连续电泳系统中，含有三种三种离子，离子，两两种种不同孔径的凝胶，不同孔径的凝胶，两种或两种以上两种或两种以上不同不同pH的缓冲溶液的缓冲溶液 所谓不连续就是指所谓不连续就是指凝胶浓度凝胶浓度不一样，不一样，缓冲缓冲液离子成分液离子成
25、分及及pH不一样不一样 4.不连续系统原理概要不连续系统原理概要 在不连续电泳系统中，有三种物理效应，即在不连续电泳系统中，有三种物理效应，即样品的浓缩样品的浓缩效应、效应、分子筛分子筛效应及效应及电荷电荷效应效应 由于这三种物理效应，使样品分离效果好，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高分辨率高 凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性：浓缩胶浓缩胶 (stacking gel)分离胶分离胶 (separating gel)缓冲液离子成分的不连续性：缓冲液离子成分的不连续性：快离子快离子(前导离子前导离子,leading ion)慢离子慢离子(尾随离子尾随离子,trailing ion)
26、缓冲配对离子缓冲配对离子(缓冲抗衡离子缓冲抗衡离子,the buffer counter ion)电位梯度的不连续性：电位梯度的不连续性：在不连续系统中，电位梯度的差异是自动形成的在不连续系统中，电位梯度的差异是自动形成的 pH的不连续性：的不连续性：在浓缩胶与分离在浓缩胶与分离胶之间有胶之间有pH的不连续性，是为了的不连续性，是为了 控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率 浓缩胶浓缩胶pH：6.7 分离胶分离胶pH：8.9 缓冲液缓冲液pH：8.3 由于电泳基质的上述四个不连续性，使样品由于电泳基质的上述四个不连续性，使样品在电泳开始时得以浓缩，然后
27、再被分离在电泳开始时得以浓缩，然后再被分离5.SDS-PAGE测定分子量的操作测定分子量的操作 标准品的选择及处理标准品的选择及处理 待测样品的制备待测样品的制备 电泳分离及染色电泳分离及染色 相对迁移率的计算相对迁移率的计算Analysis for SDS-PAGE electrophoresis6.注意事项注意事项 选择合适的胶浓度选择合适的胶浓度 样品中高浓度的阳离子可能会导致样品中高浓度的阳离子可能会导致SDS的沉的沉 淀，应在加入样品缓冲液之前将其除去淀，应在加入样品缓冲液之前将其除去 SDS与蛋白质之间的结合程度与蛋白质之间的结合程度 蛋白质的分子量范围蛋白质的分子量范围 1520
28、0 KD之间之间v 二硫键是否完全被还原二硫键是否完全被还原v 溶液中溶液中SDS的浓度的浓度v 溶液的离子强度溶液的离子强度第四节第四节 测定蛋白质的等电点测定蛋白质的等电点等电点等电点(isoelectric point,pI)两性电解质性质两性电解质性质支持介质支持介质(supporting media)+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10Isoelectric FocusingReadyStripTM IPG Strips310473658710310NL3.95.14.75.95.5-6.76
29、.3-8.3High-purity monomersNarrow ranges for resolution of low-abundance proteinsOverlapping gradients for“cyber gels”Three lengths -7 cm,11 cm and 17 cm -0.5 mm x 3.3 mm第五节第五节 蛋白质的免疫印迹分析蛋白质的免疫印迹分析 印迹技术印迹技术(blotting)是指将存在于凝胶中是指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于或直接放在的生物大分子转移（印迹）于或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术固定化介质上并加以检测分析的技
30、术 1975年，年，Edwen Southern提出了提出了分子印分子印迹迹(渍渍)的概念的概念 目前这种技术已被广泛用于目前这种技术已被广泛用于DNA、RNA和蛋白质的检测和蛋白质的检测印迹技术的类别及应用印迹技术的类别及应用 DNA印迹技术印迹技术(Southern blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析、重组质粒和噬菌体的分析 RNA印迹技术印迹技术(Northern blotting)用于用于RNA的定性定量分析的定性定量分析 蛋白质的印迹分析蛋白质的印迹分析(Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究用于蛋白质定性定量及相互作用研
31、究 由于蛋白质常用抗体来检测，因此也被称为由于蛋白质常用抗体来检测，因此也被称为 免疫印迹技术免疫印迹技术(immunoblotting)一、免疫印迹分析的应用一、免疫印迹分析的应用 对蛋白质进行定性分析对蛋白质进行定性分析 对蛋白质进行半定量分析对蛋白质进行半定量分析 信号转导分析信号转导分析生物大分子相互作用分析生物大分子相互作用分析二、免疫印迹分析的基本流程二、免疫印迹分析的基本流程 电泳分离蛋白电泳分离蛋白 转移至固相膜转移至固相膜 封闭非特异结合位点封闭非特异结合位点 与第一抗体温育反应与第一抗体温育反应 与第二抗体交联物温育反应与第二抗体交联物温育反应 显色显色制备蛋白样品制备蛋白
32、样品蛋白质转移蛋白质转移抗体检测抗体检测1.样品的制备样品的制备 组织或细胞中提取组织或细胞中提取v 裂解裂解v 去污剂去污剂(SDS、Triton X-100、NP-40、Tween-20)v 蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂(PMSF、EDTA、Pepstatin、Leupeptin、Aprotinin)v 蛋白质的定量蛋白质的定量(Bradford、BCA、Lowry)基因工程表达重组产物基因工程表达重组产物2.电泳分离电泳分离 SDS-PAGE 非变性非变性PAGE EIF3.蛋白质的电转移蛋白质的电转移方法：半干法、方法：半干法、湿法湿法 作用：将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维作用：将凝胶上的
33、蛋白质转移到硝酸纤维素膜上素膜上 注意：注意：在叠放硝酸纤维素膜、聚丙烯酰胺在叠放硝酸纤维素膜、聚丙烯酰胺凝胶时，膜与胶之间要紧密贴在一起，中间凝胶时，膜与胶之间要紧密贴在一起，中间不能有任何气泡不能有任何气泡 ！？！？常用的蛋白质转移膜常用的蛋白质转移膜种类种类 微孔大小微孔大小 结合能力结合能力 特点特点NC膜膜0.45 um80-100 ug/cm2应用广泛应用广泛 20kD易丢失易丢失PVDF膜膜0.22 um0.45 um80-100 ug/cm2170-200 ug/cm2 20kD不易丢失不易丢失容量大、强度高容量大、强度高尼龙膜尼龙膜480 ug/cm2用于核酸用于核酸电转移示
34、意图电转移示意图电转移装置电转移装置4.靶蛋白的免疫学检测靶蛋白的免疫学检测 封闭封闭 对转移膜上的潜在结合位点进行封对转移膜上的潜在结合位点进行封闭闭，防止抗体非特异性结合在膜上，防止抗体非特异性结合在膜上，降低背景颜色降低背景颜色BSA、脱脂奶粉、脱脂奶粉 与第二抗体反应与第二抗体反应 第二抗体一般是针对第一抗体的免疫球蛋第二抗体一般是针对第一抗体的免疫球蛋白，可用同位素或非同位素物质进行标记白，可用同位素或非同位素物质进行标记 酶标抗体常用酶：酶标抗体常用酶：碱性磷酸酶碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(horseradish pe
35、roxidase，HRP)胶体金标记、胶体金标记、125I标记标记标记标记 显色显色 AKP可催化底物可催化底物5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚磷酸吲哚磷酸(bromochloroindolyl phosphate，BCIP)与氮蓝四唑与氮蓝四唑(niro-blue tetrazolium，NBT)发生反应，产生深蓝发生反应，产生深蓝色化合物，显示出蛋白质所在的位置。色化合物，显示出蛋白质所在的位置。Watch procedure HRP可催化底物显色生成棕色化合物，显可催化底物显色生成棕色化合物，显示出蛋白质所在的位置示出蛋白质所在的位置 HRP可催化底物发出荧光，显示出蛋白质可催化底物发出荧光
36、，显示出蛋白质所在的位置所在的位置 四、免疫印迹注意事项四、免疫印迹注意事项 SDS-PAGE凝胶的浓度凝胶的浓度 膜的选择膜的选择 电转移（电转移（方向方向、电流电流、转移效率转移效率）充分封闭和洗膜充分封闭和洗膜 抗体的使用（抗体的使用（稀释比例稀释比例、分装分装）免疫检测（免疫检测（显色显色）免疫共沉淀免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细原理：当细胞在非变性条件下
37、被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用保留了下来。如果用A蛋白质的抗体免疫沉淀，蛋白质的抗体免疫沉淀，那么与那么与A在体内结合的在体内结合的B蛋白质也能沉淀下来。蛋白质也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用靶蛋白。靶蛋白。原理原理优点优点1.相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；处于天然状态；2.蛋白的相互作用是在自然状态下进行的
38、，蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；可以避免人为的影响；3.可以分离得到天然状态的相互作用蛋白可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。复合物。缺点缺点1.可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用蛋白质相互作用2.两种蛋白质的结合可能不是直接结合，两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；而可能有第三者在中间起桥梁作用；3.如用如用western blot检验，必须在实验前检验，必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到的抗体，若预测不
39、正确，实验就得不到结果。结果。实验的关键实验的关键1.抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明反应。建议仔细检查抗体的说明书，特别是多抗的特异性是问题。书，特别是多抗的特异性是问题。2.为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。3.考虑抗体考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在过多则就不能沉降在beads上
40、，残存在上清。缓冲剂上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。1.收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解冰上裂解30min,12000 rpm离心离心30 min后取上清；后取上清；2.取少量裂解液以备取少量裂解液以备western blot分析，剩余裂解液加分析，剩余裂解液加1g相相应的抗体加入到细胞裂解液，应的抗体加入到细胞裂解液，4c缓慢摇晃孵育过夜；缓慢摇晃孵育过夜；3.取取10l protein a 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗
41、3 次，每次，每次次3,000 rpm离心离心3 min；4.将预处理过的将预处理过的10l protein a 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中夜的细胞裂解液中4c缓慢摇晃孵育缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与，使抗体与protein a琼脂糖珠偶连；琼脂糖珠偶连；5.免疫沉淀反应后，在免疫沉淀反应后，在4c 以以3,000 rpm 速度离心速度离心3 min，将，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂裂解缓冲液洗解缓冲液洗34次；最后加入次；最后加入15l的的2SDS上样缓冲液，上样缓冲液，沸水
42、煮沸水煮5分钟；分钟；6.SDS-PAGE,western blotting或质谱仪分析。或质谱仪分析。实验步骤实验步骤Co-IP工作示意图工作示意图Co-immunoprecipitationbindingwashelutionYYYYY利用western blot 确定捕获蛋白通过质谱确定捕获的蛋白通过质谱确定捕获的蛋白实验注意事项实验注意事项 （1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（有蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP-40或或Triton x-100)。每种细胞的
43、裂解条件是不一样的，通过经验确定。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商不能用高浓度的变性剂，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的品化的cocktailer。（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用 （3）使用对照抗体：）使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗或另一类单抗 兔多克隆抗体：正常兔兔多克隆抗体：正常兔IgG (4)确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆
44、抗体的使用有助于避免污染的发生；源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；(5)要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；抗体后不会引起共沉淀；(6)确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。一类是测定一类是测定溶液中蛋白质分子的结构溶液中蛋白质分子的结构 如核磁共振如核磁共振(NMR)、圆二色谱法、激、圆二色谱法、激光拉曼光谱法、荧光光谱法、紫外差光谱
45、光拉曼光谱法、荧光光谱法、紫外差光谱法以及氢同位素交换法法以及氢同位素交换法 另一类是测定另一类是测定晶体蛋白质的分子结构晶体蛋白质的分子结构 如如X射线衍射射线衍射分析法、小角中子衍射法分析法、小角中子衍射法 蛋白质空间结构分析蛋白质空间结构分析蛋白质分子的生物学功能研究蛋白质分子的生物学功能研究 基因敲除技术基因敲除技术 细胞转染技术细胞转染技术 酵母双杂交系统酵母双杂交系统蛋白质研究的发展趋势蛋白质研究的发展趋势 一、单个蛋白质到所有蛋白质一、单个蛋白质到所有蛋白质 全方位生物学，高通量研究全方位生物学，高通量研究1.蛋白质组学蛋白质组学一种细胞或一种组织在某种状态条件下所一种细胞或一种组织在某种状态条件下所有蛋白质的定性和定量分析的研究思路。有蛋白质的定性和定量分析的研究思路。2.蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术 二、从统计行为到单个分子行为二、从统计行为到单个分子行为 三、从体外活性到体内功能三、从体外活性到体内功能
