1、荧光定量PCR基础纲纲要要定定量量 PCR 介绍介绍荧光定荧光定量量PCR化学原理化学原理 仪器仪器的的校正校正定量定量PCR实实验验要素要素数据分析数据分析定量定量PCR常常见见故障故障排排查查常见应用常见应用定定量量 PCR 介绍介绍什么什么是荧光定是荧光定量量PCR指在指在PCR反应体系中加反应体系中加入入荧光基团荧光基团，利利用荧光信号用荧光信号积积累实时监测累实时监测整整个个 PCR进进程，使每一个循程，使每一个循环环变得变得“可见可见”，最后通最后通过过Ct值值和和标准曲标准曲线线对样对样 品中品中的的DNA(or cDNA)的起始浓度进行的起始浓度进行定定量的方法。量的方法。定定
2、量量PCR体系体系 普通的PCR体系 模板,引物,dNTPs,buffer,Taq酶 加入各种类型的荧光染料定定量量PCR原理原理 与传统PCR一样,反应在温度模块里循环进行 理论上每经过一个循环目的基因的数量都会增加一倍 每个循环结束后,定量PCR仪器通过不同的滤光片记录荧光信号 在扩增过程中,荧光信号随着PCR产物的增加而增强光学结构简图典型的PCR四阶段平台期线性增长期指数增长期基线期PCR理论方程 N=N0 x(1+e)nN=产物分子数N0=起始分子数 E=扩增效率 n=循环次数PCR方程只在指数期成立荧荧光光PCR信信号号方程方程什么是阈值阈值 高于背景荧光强度的值被确定为阈值 控制
3、在扩增曲线的指数增长阶段范围之内。阈值线与扩增曲线的交叉 点确定CT 值。线性图谱半对数图谱CT值由阈值确定Threshold（阈值）CTCT值值：C代表Cycle，T代表阈值(threshold)，CT值的含义是：每个反应 管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。数学数学关系关系 Log浓浓度度与与Ct呈线性关系，呈线性关系，根根据样品扩增据样品扩增达达到阈值的循到阈值的循环环数就可计算出数就可计算出 样品样品中所含的模板中所含的模板量量。定定量量PCR的的优优点点1.敏感度:可以检测低拷贝的目的基因。典型的单拷贝检测(如果有足 够的 重复运行,泊松分布显示63%有扩增)2.高分辨率:
4、1倍分辨率3.动力学范围宽:约9个数量级.4.快:节省时间和劳力(不需要跑胶).5.安全:不用EB或放射性物质荧光荧光定量定量PCR化学原理化学原理两种化学方法探针法探针法染料法染料法Taqman探探针法原理针法原理完整的探针：5端荧光基团吸 收能量后将能量转移给临近的3 端荧光淬灭基团（发生荧光共振 能量转移，FRET）退火，探针与模板结合，引物 在聚合酶作用下进行延伸反应，遇到探针时发挥3-5外切酶活性 将探针切碎到反应体系中报告基团与淬灭基团距离变大，在激发光的作用下发荧光TaqMan探探针针设计要点设计要点TaqMan ProbePrimer尽可能地靠近上游引物（一般10个以内），最好
5、是 探针的5端离上游引物的3 有1个碱基。PCR产物大小建议50-150bpGC含量30-80%，避免发卡结构和二聚体Tm值:68-70Tm值:58-60Probe长度：13-25bp(TaqMan MGB Probe)13-30bp（TaqMan Probe）Primer长度：20bp终浓度：0.20.25uM终浓度：0.2uM0.5uM3端的前4个碱基不能有3个以上的G3端的前5个碱基不能超过2个C/G避免重复序列：避免序列中4个以上的G或连续6个A选择C比G多的链当探针5端第一个碱基不能为G，如为FAM，则第二个碱基 也不能是G。5 端染料最好连接在T或C碱基上。MGB探针探针R：荧光报
6、荧光报告基团告基团 NFQ：非荧：非荧光淬光淬灭灭基团基团MGB：小沟结：小沟结合物合物（增加增加探探针针Tm值）值）MGB探针的优势 提高信噪比没有背景荧光 更高的淬灭效率 提高TmTm值15 mer 提高18探针更短只要13-19个碱基 更多一重PCR（淬灭基团不占通道）需要与模板序列完全匹配才可以结合（适合检测SNP）兼并、探针量高的情况也可结合染料染料法原理法原理 SYBR Green I是一种DNA小沟 结合染料 游离时不发光 与DNA结合时发光 每一轮反映结束后收集荧光，检 测体系中双链产物的量。溶解溶解曲线曲线：derivative view反映结束后，温度逐步提升，双链产物在某
7、一温度区域变性为单链，双链结合 染料脱离出来，成为不发荧光的游离态。这一过程检测到的荧光值迅速降低，其 监测值曲线即溶解曲线，不同产物的因其不同Tm值，会产生不同的溶解曲线峰。两种两种方法的比较方法的比较 优势更特异不需要考虑二聚体可以进行多重反应不需要优化拥有已开发的试剂盒 不足比较昂贵 优势比较便宜 不足特异性差需要做融解曲线不能进行多重反应需要进行优化须根据自行设计实验TaqManSybr Green I淬灭基团淬灭基团种类种类荧光报告荧光报告基团种类基团种类DABCYL6-FAM，TET，JOE，HEX，Cy3等等TAMRA6-FAM，TET，JOE，HEX等等BHQ16-FAM，TE
8、T，Cy3，JOE，HEX等等BHQ2Cy3，Texas Red，Cy5，TAMRA，ROX等等BHQ3Cy5，Cy5.5等等报告报告集团及淬灭基集团及淬灭基团团的选的选择择vic不同不同滤光片对应的滤光片对应的发发光集团光集团 滤光片 7000和7300荧光定量PCR系统 7500荧光定量PCR系统 ASYBRGreen I,FAM dyesSYBRGreen I,FAM dyes B VIC,JOE dyes VIC,JOE dyes C NED,TAMRA,NED,TAMRA dyes CY3 dyes D ROX dye ROX,Texas Red dyes E CY5 dye仪器仪器
9、的校正的校正5 仪器的维仪器的维护护和和校正校正误误差差 来来源源定义定义 纯荧纯荧光光谱：光光谱：标准荧光的光谱组分是用于荧光定量分析。ROX,SYBR,FAM，VIC，这些信息存储于计算机中，在数据分析的时候使用。荧光 基团在PCR反应中与纯荧光比较得到准确的荧光计量。原始光谱视图（Raw Date）:显示PCR反应中荧光信号的软件视图 背景组分:仪器基座的背景“噪音”。背景噪音影响反应的灵敏度。背景读数存储于计算机并被反应的荧光信号扣除纯荧光校正 纯荧光校正根据一系列荧光标准品收集荧光数据 软件将不同纯荧光标准品的荧光信息分析并存储到程序中 每次实验运行中，SDS 软件接收原始光谱信号。
10、软件将原始光谱与纯荧 光文件中包含的纯荧光标准进行比较，以确定样本中使用的每一种荧光 的光谱表现纯染纯染料光谱料光谱FAMTAMRAVICROXNEDSYBR GreenROI校正 ROI(Regions of Interest)校正用于生成目标区数据。由于定量PCR仪使用一组滤光片分离检测运行期间生成的荧光能量，所以必 须为每个滤光片生成校正图像，以修正光学系统中的微小差异。校正期间生成的数据，允许SDS 软件映射样本块（Block)上反应孔的位置，从而在仪器操作期间，使软件可判断出反应板上特定反应孔中荧光强度的增量。背景背景校正校正 背景校正程序测量定量PCR仪的环境荧光强度 在运行校正程
11、序期间，定量PCR 仪在 10 分钟内 连续地读取背景校正 反应板的荧光强度，运行温度为 60 随后，SDS 软件计算运行期间所收集到的荧光强度的平均值，提取出 结果并保存到校正文件中 软件在今后的分析中将自动调用此校正文件，从实验数据中减去背景信 号加热槽荧光污染的判断 执行背景校正，当背景荧光信号异常（强度超过72000或7500的滤 光片E超过90000）时 实验中，连续出现不正常的偏高信号，并表明可能存在荧光物质污染时，需要清除热槽中的污染清除热槽中的污染 清洁样本块中污染的反应孔a.用移液器吸取少量水或乙醇并滴入 每个污染的反应孔中。b.吹打数次。c.将废液吸入废液杯中。重复以上步骤
12、：乙醇三次，去离子 水三次 确认反应孔中的残留液体蒸发完确认已除去热槽中的荧光污染物 运行背景校正板，确认污染已除去。如未除去，重新清洁，使用最新的背景校正定定量量PCR实实验验要素要素1.目标基因 样品2.标准曲线 标准品3.监控污染 阴性对照4.监控系统故障 阳性对照5.校准物理误差 参比荧光1 目标基目标基因因 样品样品 细胞死亡时RNA迅速被RNases酶降解 另外，样本（组织，血液等）一旦离开机体后，基因表达谱 会发生改变可能的解决方案：将样本迅速完全融解在有机溶剂中液氮冻存将组织/细胞存放在稳定的溶液中加入无毒的组织防腐剂和RNA稳定剂选择样本的提取方法有机溶剂法提取的样本纯度高劳
13、动强度大过柱法(玻璃纤维过滤)简单，各种样本类型都能提取到纯RNA磁珠法产量高，洗脱体积小不需要离心，适合高通量提取选择RT-PCR方法 将未知RNA直接加入到实时定量PCR反应管中 接着，加入含逆转录酶和Taq酶 的反应液 RT反应完成后，立即进行PCR优势：节省加样步骤注意点:样品反复冻融会造成RNA降解（小量等份分装）先将RNA逆转录成cDNAs 将cDNAs 1:2 1:10 稀释 加入反应板中，实时扩增 cDNA，或-20 C储存（稳定保 存数周）优势：cDNA远比RNA稳定，可以反复冻融多次不足：和一步法相比，需要更 多的加样步骤一步法一步法两步法两步法预扩增传统的基因表达分析包含
14、预扩增的 基因表达分析1:5 or 1:20 稀释10-14 PCR 循环预防 PCR 过程中的污染进行新的扩增反应时，很容易被前一次扩增产物污染（比如：通过气溶胶污染，被污染的移液器等）污染的模板被扩增会影响实验的结果体系中掺入尿嘧啶的扩增产物会被UDG酶降解作用于含有dU掺入的DNA模板50 激活UDG.残留污染被降解(因此不会被扩增).95 灭活UDG目标样品用量 DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6-2.0之间 DNA用量：0.1ng-100ng RNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：10-100ng2 标准曲标准曲线线 标准品标准品 定量实验中，单独
15、的Ct值本身是没有意义的，需要通过标准曲线，将 其转化成有意义的数值。标准品（浓度/拷贝数）目的目的：生成标准曲线，建立CT值与浓度之间的数学关系 不要不要求：求：数学关系是抽象的，不要求标准品与目标基因使用相同的DNA 可以使用相同的DNA也可以使用不同的：PCR产物、质质粒粒、病毒、人工合成片段 要求：要求：浓度已知，Ct值在18-30之间，覆盖全部样品浓度区间 制备至少5个点的10倍标准曲线(4 logs）PCR效率一致，且接近100%与未知样本实验条件平行 每个点至少3次重复制作标准曲线选择目标提取/PCR纯化测定浓度调整浓度梯度稀检查相关系数 R2 0.99 Eff%=90%-110
16、%Slope=-3.58-3.10 理想的斜理想的斜率率=-3.32（对应对应 100%扩增效率扩增效率）；效率效率在在90%-110%（斜率斜率为为 -3.58到到-3.10 之间）都表之间）都表示扩示扩 增较好增较好去除离散值的点选择离散的孔，右 键 点 击“去除”3 监控污监控污染染-阴性对照阴性对照 实验效果验证种类No Template ControlNo RT ControlNo Probe Control如何分析电泳融解曲线测序No RT Control探针可能检测到基因组DNA1.用DNase酶处理样本2.检测no-RT对照（不进行逆转录的样本）+RT 和和RT 应该至少应该至
17、少 相相差差6-7 Cts(大约大约1%信号信号由由DNA产生产生).+RT-RT4 阳性对阳性对照照-监控监控系系统故障统故障 内内参参(管家基因)标准品线性范围灵敏度扩增效率 外源阳性内对照来源PCR产物质粒阳性样本内参-校准生物学误差 内参用于校准实验过程对定量结果的影响核酸提取时通常以重量或体积 为单位取样，再加上提取效率和操作误差，造成等量提取物不一定来源 于等量细胞（或基因组）将定量结果校正为以细胞（或基因组）为单位，不同样品之间才具有可比性校准方法：目的基因/内参=均一化的目的基因表达量 内参可以起到阳性对照的作用，以监控反应系统是否正常，试剂、PCR 程序、荧光采集、是否存在抑
18、制物 内参常选用管家基因，如18S rRNA、-actin、GAPDH等5 ROX 参比荧参比荧光光-校准物理误差 Master Mix中Rox浓度固定 ROX不参与PCR扩增，信号强度只与Master Mix用量有关 ROX的功能：耗材质量（如管盖厚度、透光性能）、仪器稳定性（如孔 间、批间波动）等的误差，反应体系监控(蒸发)校正方式：Rn=RReporter/RROX提高复孔间的精确度进行ROX 参比荧 光校 准后后36个复 孔分析结 果.未进行ROX 参比 染料 校准的36个复 孔分析结果.数据数据分析分析绝对定量与相对定量 绝对定量：优点:给出目标基因的绝对数量，数据 容易处理缺点：必
19、须有标准品，做标准曲线，难 以制备和质控 相对定量优点：可以不做标准品；相对标准曲线 法的标准品容易制备；使用广泛缺点：数据理解困难绝对定量举例绝对绝对定量数据处理定量数据处理 如果需要对不同样本的绝对定量数据进行比较，则需 内参校准相对定量：相对标准曲线法标准品只标准品只知道知道 稀释倍数稀释倍数相对定量：CT法依据：平均相对含量%=2 平均CT好处：不做标准曲线CT=（CT未知样品-CT未知样品内参）-（CT基准样品-CT基准内参）CT法计算示例比较Ct值的数学关系Ct为1=2倍差异Ct为2=4倍差异 Ct为3=8倍差异 Ct为3.3=10倍差异形成这种数学关系的前提：每经过1个循环，产物
20、的量会加倍在这种情况下，反应的扩增效率为100%如果扩增效率下降这种数学关系不再成立PCR效率对定量结果的影响导致扩增效率达不到 100%的原因1.实验组分的浓度及质量。如果样品包含PCR抑制剂，反应会减慢，甚至不反应。这种情况常见于来自生物制品样本的核酸。cDNA作为起始模板时很少见。2.扩增产物太长实时定量PCR检测建议扩增产物序列长度为50-150 碱基3.没有选择合适的引物退火温度4.设计的引物有错配5.模板序列特殊（比如：GC含量高）6.二级结构的影响（引物、探针、扩增产物）定定量量PCR常常见见故障排查故障排查无扩无扩增曲线增曲线1.通过电泳检测无条带，也无扩增曲线a.引物设计问题
21、 b.引物质量问题 c.扩增体系问题 d.退火温度问题2.电泳检测有条带，但无扩增曲线 a.程序设定问题或仪器出现故障 b.探针合成问题c.探针淬灭阴性阴性对照起飞对照起飞1.无模板阴性对照起飞 a.探针污染b.引物污染 c.体系污染建议：做无探针对照，无引物探针对照，电泳查看有无条带，确认污染源后重 合引物或探针或更换试验体系。2.no-RT对照阴性对照起飞基因组DNA污染，+RT 和RT 应该至少相差6-7 Cts(大约1%信号由DNA产生).建议：设计引物时至少有一个跨内含子3.Sybergreen法在35个循环之后阴性对照起飞体系中组份的非特异扩增，引物二聚体的自我延伸4.如果使用了R
22、OX校正，则可能是ROX的降解所造成。扩增扩增曲线不平滑曲线不平滑1.探针与模板结合不稳定（曲线不平且荧光值低）a.原始序列不准确或有SNP，导致探针不宜结合b.将文献中的MGB探针序列直接合成taqman探针，退火温度过低 2.仪器或试剂问题参考平行内参阳性对照扩增曲线3.罗氏lightcycler1.0或2.0要在体系中加BSA封闭 4.调整探针或染料浓度斜线斜线型曲线型曲线1.探针降解（本底荧光值高）可以使用变性PAGE胶检测是否降解2.体系中含有抑制成分异常异常曲线曲线 某一条曲线与其他不平行 体系中含有抑制成分 不能用于分析溶解溶解曲线出现多个峰曲线出现多个峰1.引物非特异扩增2.引
23、物二聚体3.基因组DNA污染：在检测cDNA的时候，同时扩增出含有内含子的较 长的基因组上的片段。解决方法：设计引物时，至少有一条跨过两个外显子的接合处，使其无法与 含有内含子的基因组DNA结合生物信息学分析不完全导致的风险 实验设计.包含SNP 位点引物/探针和靶序列无效结合错误序列无效结合，甚至根本未结合转录组中序列并不单一 非特异性扩增序列包含重复片段大量非特异性扩增注意事项 实验室分区：样品处理区、PCR反应制备区、扩增区 标准品的稀释最好使用独立的一套移液器 标准品的稀释液中最好含有Carrier RNA 移液器使用带滤芯的吸头 先阴性对照样，后加样品，再加低浓度标准品，最后加阳性对
24、照 PCR管上不可用记号笔标记 PCR管使用平盖或光膜，不要裸手触摸光盖或光膜表面 PCR管或8联排管要对称放置 反应后的PCR管应当直接废弃，切不可在实验区域内开启 采用UNG防污染系统，消除前次扩增产物的污染影响常见常见应用应用1 SNP分析 TaqMan-MGB基因分型针对等位基因设计引物对，实现PCR扩增针对SNP位点设计探针，分别标记不同的荧光基团，如等位基因I型探 针标记VIC，等位基因II型探针标记FAM通过散点图显示结果 平台期终点信号散点图 VIC(allele 1)on X-axis FAM(allele 2)on Y-axis 每个数据集代表一种基因 型：每种纯合子、杂合
25、子 和无模板对照（NTC）1:1 in VIC cluster 1:2 in VIC+FAM cluster 2:2 in FAM cluster2 miRNA 检测 成熟的MicroRNA(miRNA)是一种22个nt 左右的内源性单链小分子RNA 由带茎环结构的双链RNA前体剪切而成 具有高度保守性、时序性和组织特异性 通过与特异mRNA结合，抑制目标基因表达或降解mRNA 调节人类三分之一的基因TaqMan MicroRNA Assays成分：1.RT primer2.Forward primer3.Reverse primer4.TaqMan probe优点1.高特异性:能区分前体和成熟miRNA。2.高灵敏度:1-10ng样本。3.精确度高，动态范围宽，不同 拷贝都能检测。4.高效：3小时同时检测多达365个miRNA。3 蛋白表达定量基于双抗体的同源检测试剂,每个抗体上绑定了一段Oligo(通过生物素-链霉亲和 素偶联)当2个偶联了Oligo的抗体结合了靶蛋白时，2段Oligo空间位置接近，从而可以被 连接酶连接，即可构成定量PCR扩增模板广泛使用 拷贝数多拷贝数多态性（态性（CNV）食品安全食品安全检测检测 转基因样转基因样品拷贝数检测品拷贝数检测 疾病检测疾病检测
