1、第二节第二节 细胞周期调控细胞周期调控一、一、MPF的发现及其作用的发现及其作用 MPF（卵细胞促成熟因子，（卵细胞促成熟因子，matuation-promoting factor；细胞促分裂因子，细胞促分裂因子，mitosis-promoting factor；M期促进因子，期促进因子，M-phase-promoting factor）。）。Johnson和和 Rao(1970)将将Hela细胞同步于不同阶段，然后细胞同步于不同阶段，然后与与M期细胞混合，在灭活仙台病毒介导下，诱导细胞融合，期细胞混合，在灭活仙台病毒介导下，诱导细胞融合，发现与发现与M期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的期细
2、胞融合的间期细胞产生了形态各异的早熟凝集早熟凝集染色体染色体(prematurely condensed chromosome，PCC)。G1期期PCC为单线状，因为单线状，因DNA未复制；未复制；S期期PCC为粉末状，为粉末状，因因DNA由多个部位开始复制；由多个部位开始复制；G2期期PCC为双线染色体，说明为双线染色体，说明DNA复制已完成。复制已完成。不同形态的不同形态的PCC 不仅同类不仅同类M期细胞可以诱导期细胞可以诱导PCC，不同类的，不同类的M期细胞也可期细胞也可以诱导以诱导PCC产生，如人和蟾蜍的细胞融合时同样有这种效果，产生，如人和蟾蜍的细胞融合时同样有这种效果，这就意味着这
3、就意味着M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，即成熟促进因子即成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)。早在早在1960s，Yoshio Masui发现成熟蛙卵的提取物能促发现成熟蛙卵的提取物能促进未成熟卵的胚胞破裂进未成熟卵的胚胞破裂(Germinal Vesicle Breakdown，GVBD)，后来，后来Sunkara将不同时期将不同时期Hela细胞的提取液注射到细胞的提取液注射到蛙卵母细胞中，发现蛙卵母细胞中，发现G1和和S期的抽取物不能诱导期的抽取物不能诱导GVBD，而，而G2和和M期的则具有促进
4、胚胞破裂的功能，它将这种诱导物质期的则具有促进胚胞破裂的功能，它将这种诱导物质称为有丝分裂因子称为有丝分裂因子(MF)。后来在。后来在CHO细胞，酵母和粘菌中也细胞，酵母和粘菌中也提取出相同性质的提取出相同性质的MF。这类物质被统称为。这类物质被统称为MPF。1988年年Maller实验室从非洲爪蟾卵中纯化出实验室从非洲爪蟾卵中纯化出MPF，证明，证明主要含主要含p32和和p45两种蛋白，表现出激酶活性。两种蛋白，表现出激酶活性。二、二、P34cdc2激酶的发现及其与激酶的发现及其与MPF的关系的关系 1960s L.Hartwell以芽殖酵母为实验材料，利用阻断在以芽殖酵母为实验材料，利用阻
5、断在不同细胞周期阶段的温度敏感突变株（在适宜的温度下和野不同细胞周期阶段的温度敏感突变株（在适宜的温度下和野生型一样），分离出了几十个与细胞分裂有关的基因生型一样），分离出了几十个与细胞分裂有关的基因(cell division cycle gene，CDC)，如芽殖酵母的，如芽殖酵母的cdc28基因，基因，在在G2/M转换点发挥重要的功能。转换点发挥重要的功能。Hartwell还通过研究酵母还通过研究酵母菌细胞对放射线的感受性，提出了菌细胞对放射线的感受性，提出了checkpoint（细胞周期（细胞周期检验点）的概念，意指当检验点）的概念，意指当DNA受到损伤时，细胞周期会停受到损伤时，细胞
6、周期会停下来。下来。以以P.Nurse为代表的另一批酵母生物学家研究不同温度为代表的另一批酵母生物学家研究不同温度下培养的裂殖酵母细胞，也分离出数十种温度敏感的突变体。下培养的裂殖酵母细胞，也分离出数十种温度敏感的突变体。这些不同的突变体在限定温度下，会滞留在细胞周期的某个这些不同的突变体在限定温度下，会滞留在细胞周期的某个阶段。这些与细胞分裂和周期调控有关的基因被称为阶段。这些与细胞分裂和周期调控有关的基因被称为cdc(cell division cycle)基因，根据被发现的先后顺序被命名。基因，根据被发现的先后顺序被命名。cdc2是第一个被分离出来的是第一个被分离出来的cdc基因，表达基
7、因，表达34kDa的蛋白，的蛋白，称称p34cdc2。进一步研究发现其具有激酶活性，可以使许多蛋。进一步研究发现其具有激酶活性，可以使许多蛋白磷酸化，在裂殖酵母的周期调控中起重要作用。芽殖酵母白磷酸化，在裂殖酵母的周期调控中起重要作用。芽殖酵母中的一个关键中的一个关键cdc基因是基因是cdc28，是第二个被分离出来的，是第二个被分离出来的cdc基基因，编码因，编码34kDa的蛋白，具有激酶活性。的蛋白，具有激酶活性。p34cdc28是是 p34cdc2的的同原物同原物，调控细胞周期，特别是，调控细胞周期，特别是G2/M期转变。但研究者很快期转变。但研究者很快发现，发现，p34cdc28 或或p
8、34cdc2单独并不具有激酶活性，需要同相关单独并不具有激酶活性，需要同相关蛋白结合后才具有活性（如蛋白结合后才具有活性（如p34cdc2和蛋白和蛋白p56cdc13结合）。结合）。之后，之后，J.Maller和和P.Nurse实验室立即合作，很快证明爪蟾实验室立即合作，很快证明爪蟾卵中的卵中的p32与与p34cdc2是同原物。与此同时，是同原物。与此同时，T.Hunt实验室等以实验室等以海胆卵为材料研究细胞周期调控，发现一类与细胞分裂有关海胆卵为材料研究细胞周期调控，发现一类与细胞分裂有关的蛋白，称为周期蛋白的蛋白，称为周期蛋白(cyclin)。然后。然后J.Maller和和T.Hunt实验
9、实验室合作，发现周期蛋白室合作，发现周期蛋白B，证明与，证明与p45和和p56cdc13为同原物。为同原物。2001年年10月月8日日,L.Hartwell、P.Nurse、T.Hunt因对细胞周期调控机理的研究而荣因对细胞周期调控机理的研究而荣获诺贝尔生理医学奖。获诺贝尔生理医学奖。三、周期蛋白三、周期蛋白 自发现周期蛋白后，在不长的时间里有数十种周期蛋白被自发现周期蛋白后，在不长的时间里有数十种周期蛋白被克隆和分离。如酵母的克隆和分离。如酵母的Cln1,Cln2,Clin3,Clb1-Clb6Cln1,Cln2,Clin3,Clb1-Clb6，在脊，在脊椎动物的椎动物的A1-2、B1-3、
10、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。各类周等。各类周期蛋白均含有一段约期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导周期蛋白与白框，介导周期蛋白与CDK结合，不同的周期蛋白框识别不结合，不同的周期蛋白框识别不同的同的CDK,CDK,组成不同的周期蛋白复合体，表现不同的组成不同的周期蛋白复合体，表现不同的CDKCDK激酶活激酶活性。性。M M期周期蛋白分子的近期周期蛋白分子的近N N端含有一段端含有一段9 9个氨基酸组成的破坏个氨基酸组成的破坏框，参与泛素介导的周期蛋白框，参与泛素介导的周期蛋白A A和和B B的降解。的降解。G1G1期周期蛋白分
11、期周期蛋白分子的子的C C端含有一段特殊的端含有一段特殊的PESTPEST序列，可能与序列，可能与G1G1期周期蛋白的更期周期蛋白的更新有关。新有关。周期蛋白分子结构特征周期蛋白分子结构特征 不同周期蛋白的不同周期蛋白的表达时期不同，与表达时期不同，与不同的不同的CDK结合，结合，调节不同调节不同CDK激激酶的活性。酶的活性。部分哺乳动物和部分哺乳动物和酵母细胞周期蛋白酵母细胞周期蛋白在细胞周期中的积在细胞周期中的积累及其与累及其与CDK激激酶活性的关系。酶活性的关系。四、四、CDK激酶和激酶和CDK激酶抑制物激酶抑制物 在酵母在酵母cdc2和和cdc28基因被分离后，几个实验室同时工基因被分
12、离后，几个实验室同时工作构建了人类、爪蟾和果蝇的作构建了人类、爪蟾和果蝇的cDNA文库，得到了一系列文库，得到了一系列与与cdc2相关的基因。他们有两个共同的特点，一是含有一相关的基因。他们有两个共同的特点，一是含有一段类似的氨基酸序列，二是都可以同周期蛋白结合。统称段类似的氨基酸序列，二是都可以同周期蛋白结合。统称为周期蛋白依赖性蛋白激酶，为周期蛋白依赖性蛋白激酶，CDK激酶。激酶。已经命名的已经命名的CDK激酶包括：激酶包括：CDK1-8。cdc2最早被发现，最早被发现，被命名为被命名为CDK1。各种。各种CDK分子都含有一段类似的分子都含有一段类似的CDK激激酶结构域，其中一段酶结构域，
13、其中一段PSTAIRE的序列相当保守，与周期蛋的序列相当保守，与周期蛋白的结合有关。另外，一些位点的磷酸化与激酶的活性有白的结合有关。另外，一些位点的磷酸化与激酶的活性有关。关。CDKCDK激酶的效应是多方面的，如将核纤层蛋白磷酸化导激酶的效应是多方面的，如将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层解体、核膜消失，将致核纤层解体、核膜消失，将H1磷酸化导致染色体的凝缩磷酸化导致染色体的凝缩等等。等等。与与cdc2类似的类似的CDK蛋白分子图解蛋白分子图解 细胞中还具有细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子细胞中还具有细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CDK inhibitor，CDKI）对细胞周期起负调控作用，目前）
14、对细胞周期起负调控作用，目前发现的发现的CDKI分为两大家族：分为两大家族：Ink4(Inhibitor of cdk 4)，如，如:P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，特异性抑制，特异性抑制cdk4cyclin D1、cdk6cyclin D1复合物。复合物。CIP/Kip(Kinase inhibition protein)：包括：包括P21cip/waf1(cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)、P57kip2等，能抑制大多数等，能抑制大多数CDK的激酶活性，的
15、激酶活性，P21cip/waf1还能与还能与DNA聚合酶聚合酶的辅助因子的辅助因子PCNA（proliferating cell nuclear antigen）结合，直接抑制）结合，直接抑制DNA的合成。的合成。周期蛋白激酶周期蛋白激酶五、细胞周期转运调控五、细胞周期转运调控周期蛋白激酶的活性周期蛋白激酶的活性细胞周期调控示意图细胞周期调控示意图裂殖酵母细胞周期的调控裂殖酵母细胞周期的调控人细胞周期的调控人细胞周期的调控（一）（一）G2/M期转化与期转化与CDK1激酶的调控作用激酶的调控作用 CDK1激酶（激酶（p34cdc2激酶），由激酶），由p34cdc2蛋白（或蛋白（或p34cdc28
16、蛋蛋白）与周期蛋白白）与周期蛋白B组成。组成。CDK1激酶催化不同的底物（主要是磷酸化丝氨酸和苏氨激酶催化不同的底物（主要是磷酸化丝氨酸和苏氨酸），参与细胞的多种功能。酸），参与细胞的多种功能。细胞中细胞中CDK激酶的活性受到多种因素的调控激酶的活性受到多种因素的调控CDK1的激活需要的激活需要Thr14和和Tyr15的去磷酸化的去磷酸化Tyr161的磷酸化的磷酸化Weel1可以促进可以促进Thr14和和Tyr15的磷酸化的磷酸化Cdc25可以促进可以促进Thr14和和Tyr15的去磷酸化的去磷酸化CDK1的调节与活化的调节与活化;CAK=CDK1-Activiting KinaseM-Cdk激酶的活性激酶的活性
