1、细胞死亡判定提 纲 细胞死亡判定意义 细胞死亡定义及判定方法 细胞死亡判定方法中存在的问题 细胞死亡判定方法使用兼谈人体死亡判定一 细胞死亡判定意义种子筛选发 酵长序列监测技术比短序列监测更能反映生命力问：凋亡细胞是活细胞还是死细胞？Monocytes：单核细胞膜完整性测试：染上颜色的细胞一定是死亡细胞？克隆形成实验clonogenic assay细胞死亡判定方法中存在的问题60(5)1467-1472全脑死亡：循环和呼吸功能的不可逆终止，或包括脑干在内的全脑功能不可逆终止敏感性高：可检测最少20个细胞Four months after he was declared brain dead a
2、nd doctors were about to remove his organs for transplant,Zach Dunlap is on the road to recovery长序列监测技术比短序列监测更能反映生命力抗癌药物筛选Energy-dependent,Carrier-Mediated extrusionCaron et al.缓冲液等对荧光强度的影响Keer&Birch,2003常见膜完整性检测用染料PI&Annexin V-FITC分析细胞凋亡高级脑死亡：把意识功能的丧失作为诊断的关键敏感性高：可检测最少20个细胞正电荷：Rhodamine 123、Carbocya
3、nines，DiOC6(3)，DiOC2(3)，DiSC3(5)常见膜完整性检测用染料具有神奇抗癌效能的白藜芦醇全脑死亡：循环和呼吸功能的不可逆终止，或包括脑干在内的全脑功能不可逆终止问题2：活性染料越深生命力越强？Monocytes：单核细胞克隆形成实验clonogenic assay负电荷：DiBAC(3)二二 细胞死亡定义及判定方细胞死亡定义及判定方法法细胞死亡的定义 细胞因受严重损伤而累及胞核时，呈现代谢停止、结构破坏和功能丧失等不可逆性变化，此即细胞死亡 呼吸-代谢-繁殖平板计数法平板计数法 1.繁殖力繁殖力克隆形成实验clonogenic assayMPN most probabl
4、e number 屏障作用n膜不对称性破坏2 细胞膜2.1 细胞膜完整性 显微镜观察？电子显微镜？染料类别n膜通透性染料n非膜通透性染料常见膜完整性检测用染料 传统可见染料：甲基蓝、传统可见染料：甲基蓝、Evans Blue、Neutral Red传统可见染料的不足n 荧光染料荧光染料：PI、SYTOX、SYBREB&FDA流式细胞仪应用流式细胞仪应用流式细胞仪的优点 准确准确 快速：快速：一般分选速度1000个/秒 大量大量 多参数同时分析（形状，尺寸大小，荧光颜色及强度）多参数同时分析（形状，尺寸大小，荧光颜色及强度）Lymphocytes:淋巴细胞Monocytes：单核细胞Granul
5、ocytes：粒细胞PI&Annexin V-FITC分析细胞凋亡问：凋亡细胞是活细胞还是死细胞？2.2 细胞膜电位测定细胞膜电位染料正电荷正电荷：Rhodamine 123、Carbocyanines，DiOC6(3)，DiOC2(3)，DiSC3(5)负电荷负电荷：DiBAC(3)3.能量相关3.1 ATPATP测定方法ATPADP荧光素加氧荧光素荧光素酶活细胞比率处理组含量对照组含量=100%ATP法特点 敏感性高：可检测最少20个细胞 适用范围较广：可对实体瘤、胸腹水、血液等多种肿瘤标本进行体外药敏检测 时间短：30-60分钟内Tetrazolium 家族家族 四氮唑化合物3.2 氧化
6、还原脱氢酶MTS 还原产物具溶解性还原产物具溶解性3.33.3 pH 梯度梯度检测染料carboxyfluorescein(cF),BCECF,pyraninecSNARF-1pH and Health 荧光素二乙酯（Fluorescein Diacetate，FDA）4.酯酶酯酶5.分子生物学技术 DNA等分子在死亡细胞中比活细胞中更快降解 长序列监测技术比短序列监测更能反映生命力检测对象 DNA rRNA mRNA检测方法：DNA probe检测方法：PCRPCR扩增方法 RT-PCR NASBA(nucleic acid sequence-based amplification,依赖性核
7、酸序列的扩增 )RT-SDA(reverse transcriptase-strand displacement Amplification,链替代扩增)细胞死亡判定方法总结细胞死亡判定方法总结Keer&Birch,2003三 细胞死亡判定方法中存在的问题现有方法存在的相关问题1 膜完整性测试：染上颜色的细胞一定是死亡细胞？MTT,FDA：没有染上颜色的细胞一定是死细胞？膜完整性测试活性染料阴性细胞能否再存活？Caron et al.,1998 问题2：活性染料越深生命力越强？Resveratrol 白藜芦醇蒽醌萜类化合物蓼科植物虎杖 白藜芦醇的功效天然的抗氧化剂葡萄酒中的抗癌明星 法兰西奇迹
8、 具有神奇抗癌效能的白藜芦醇 白藜芦醇的抗白血病作用白藜芦醇处理细胞MTT还原活性白藜芦醇处理细胞MTT还原活性生长抑制细胞MTT还原活性上升原因探讨Breeuwer et al.,1994.AEM.60(5)1467-1472Jochem,1999.Marine Biology.135:721-7281.酯酶活性的存在酯酶活性的存在 2.完整的细胞膜完整的细胞膜问题3：FDA 染色中存在的问题0 C0 C30 C DES DCCD noneEnergy-dependent,Carrier-Mediated extrusionTPP none缓冲液等对荧光强度的影响培养基组成对荧光强度的影响荧
9、光影响因子四 细胞死亡判定方法使用兼谈人体死亡判定以后的科研工作中该如何使用？心肺死亡概念脑死亡判定 全脑死亡：循环和呼吸功能的不可逆终止，或包括脑干在内的全脑功能不可逆终止 脑干死亡：为意识和认知功能的丧失是脑干上行网状结构受到破坏，必将导致患者全脑功能的丧失而死亡。高级脑死亡：把意识功能的丧失作为诊断的关键脑死亡男子器官即将移植时苏醒 Four months after he was declared brain dead and doctors were about to remove his organs for transplant,Zach Dunlap is on the road to recovery离奇！脑死亡与器官移植患者获得器官移植尿毒症150万0.5万白血病400万3万肝移植100万1万谢谢！谢谢 谢谢一 细胞死亡判定意义抗癌药物筛选流式细胞仪的优点 准确准确 快速：快速：一般分选速度1000个/秒 大量大量 多参数同时分析（形状，尺寸大小，荧光颜色及强度）多参数同时分析（形状，尺寸大小，荧光颜色及强度）3.33.3 pH 梯度梯度检测染料carboxyfluorescein(cF),BCECF,pyraninecSNARF-1活性染料阴性细胞能否再存活？培养基组成对荧光强度的影响
