1、 细菌的培养与 分离技术 第一节 培 养 基 一、培养基的主要成分及其作用 培养基（culture media）的概念 (一)营养物质：氮源、碳源、无机盐、水、生长因子 蛋白胨:是眎、胨和氨基酸组成的水溶性混合物,用以供给细菌的氮源,以合成蛋白质、酶类等。可分植物胨(大豆类蛋白的水解产物)和动物胨(牛肉、鱼粉、禽蛋或动物的心、肝、脑等组织).两者长混合使用。特点:经喷雾干燥成粉末,吸水性强,易溶于水,也易潮解结块,保存需要干燥,密封;高温下不凝固;遇酸不沉淀;含多种游离氨基酸,容易被细菌吸收利用;是两性电解质,具缓冲作用。2.肉浸液及牛肉膏 提供氮源和碳源 肉浸液 去出筋膜的新鲜牛肉加定量水浸
2、泡过夜,浸泡液再煮沸而成。其蛋白质大多已凝固,只含少量氨基酸和其他含氮物质,以及一些非氮类浸出物和少量生长因子。牛肉膏 为肉浸液加热浓缩制成(膏状),糖类等不耐热的物质已被破坏,营养价值不及前者.但因其无糖,常作肠道杆菌的鉴别培养基。因两者的营养成分有限,不能满足细菌生长的需要,故制备培养基时,还需要加入蛋白胨。3.糖(醇)类:给细菌提供碳源,更多的是用来鉴别细菌，常用的糖：单糖:葡萄糖、阿拉伯胶糖 双糖:乳糖、蔗糖 多糖:菊糖、淀粉 醇类:甘露醇、卫矛醇、侧金盏花醇 特点:不耐热,长时间的高温、或碱性可破坏糖的成分,故制备这类培养基时,通常不用高温,并与其他成分分开灭菌。4.无机盐 常量元素
3、：磷、硫、钾、钠、镁、钙、铁等。微量元素：钴、锌、锰、铜、钼等。作用 构成菌体成分；为酶的组成部分，维持酶的活性；参与能量的储存和转运；调节菌体内外的渗透压；部分与细菌的生长繁殖和致病有关（白喉杆菌在0.14mg/L时产毒量最高，在0.6mg/L时不产毒），如铜含量过多，对细菌有害，故培养基不宜用铜锅配制。自来水中一般都含上述元素。5.血液 可以增加培养基中的蛋白质、多种氨基酸、糖类和无机盐等营养成分 提供V因子(一些辅酶)、X因子（血红蛋白）等。还可测定细菌的溶血作用。6.鸡蛋、动物血清 为营养要求高的细菌（如结核分支杆菌、白喉棒状杆菌等）所必需。此外，鸡蛋和血清也可把培养基做成固体的赋形剂
4、。7.生长因子 （二）水分 作用 制备培养基常用不含杂质的蒸馏水或离子交换水。也可用自来水、井水、河水等，但常含钙、磷、镁，可与蛋白胨或肉浸液中的磷酸盐生成不溶性磷酸钙或磷酸镁，高压灭菌后可出现沉淀。所以用此类水时，最好先煮沸然后再经过滤方可。（三）赋形剂（凝固剂）要求：本身不被细菌利用；37时应保持凝固状态；不因消毒灭菌所破坏，粘着力强，透明度好。琼脂（agar）海生植物中提取的一种多糖，在100为液体，45以下时为固体，无营养作用。明胶（gelatin）即动物的胶原组织（皮、肌腱等）煮沸溶解熬制而成。主要为蛋白质。因缺乏必需的氨基酸，故营养价值不大。24以上溶解，20以下凝固（不能放37）
5、，用于鉴别细菌。（四）抑制剂 加在选择培养基中用于抑制非检出菌的生长，利于目的菌的分离的 化学药物。如抑制革兰阴性杆菌的：胆盐、煌绿、玫瑰红酸、亚硫酸钠。抑制革兰阳性菌的：亚碲酸盐、四硫磺酸盐、叠氮钠及一些抗生素等。（五）指示剂 观察细菌分解糖、蛋白质产酸、碱，鉴定细菌用。酸碱指示剂：酚红、溴甲酚紫、溴麝香草酚兰、中性红、中国蓝、甲基红、酸性复红。氧化还原指示剂：美兰、刃天青、四氮唑等。二、培养基的分类1.按其性状分：液体培养基 多用于增菌 固体培养基 分纯、鉴定、药敏 半固体培养基 用动力观察，保存菌种 肉汤配方:蛋白胨 1 克 牛肉膏 0.5克 （或肉浸液 100ml）NaCL 0.5克
6、蒸馏水 100ml 琼脂粉 2-3克 0.3-0.5克 2.按用途分基础培养基（basic media）营养培养基（nutrient media）加血液、血清生长因 子等，如血、巧克力平板选择培养基（selective media）加抑菌剂，如SS、中国蓝、伊红美兰、麦康凯等 鉴别培养基（differential media）加糖、醇、蛋白 质、氨基酸和指示剂等，如生化反应管增菌培养基（enrichment media）如葡萄糖肉汤、NG 肉汤特殊培养基（special media）如厌氧培养基、高渗等三、培养基的制备1.玻璃器皿的准备（实验课讲授）2.培养基制备的一般程序调配 溶化 矫正pH
7、 过滤澄清 分装 灭菌 鉴定 保存（三）培养基制备的注意事项 1.最好用中性硬质的玻力器皿 若含铜量为0.3mg/L时细菌不长；铁超过0.11mg/L，会影响其毒素的产生。2.化学药品等级应在化学纯以上。3.称量要准。干燥商品培养基要按说明书称量，并先在容器中加部分水。可不加热溶解。4.pH值要准：冷和热时的酸碱度有差别，故须在冷却后测定。5.分装不宜超过容器的2/3，以免溢出。6.高压灭菌时，要注意先排除冷空气；时间不宜过长（时间长了会增加酸性反应）；如含糖、明胶、血清等应采用低温或间歇灭菌法。第二节 细菌的人工培养 一、接种的工具和条件（一）接种针和接种环 针长约50-80mm；环的直径2
8、-4mm；使用前均需要在火焰上烧灼灭菌。（二）酒精灯（三）生物安全柜：结构、工作原理（四）无菌室（五）培养箱 超净工作台 生物安全柜A：前开口；B：窗口；C：排风HEPA 过滤器；D：后面的压力排系统；E：供风HEPA 过滤器；F：风机 二级生物安全柜工作原理二、无菌技术 1.无菌室使用前的消毒：打开紫外灯照射30min-1小时，或用5%的石炭酸喷雾消毒。2.所用物品均应在使用前严格灭菌。使用时不得触摸、碰撞未经灭菌的物品。3.无菌的试管、瓶子打开后应在火焰上通过 2-3次，尽快盖好，或尽量靠近火焰；管、瓶口切忌朝上暴露于空气下。4.接种环、针，每次使用前、后都要在火焰上烧灼灭菌。5.进行培养
9、基的分装、细菌接种都要在生物安全柜中进行，注意生物安全，防止污染。6.无菌吸管头上应塞有棉花，不用口吹或吸液体。7.实验室的所有感染性物品未经消毒灭菌不能拿出实验室，应经消毒处理。8.操作者要注意个人防护，穿好工作服，必要时戴好帽子、口罩、手套等，离开时要更衣、消毒、洗手。9.桌面、操作台需及时用消毒液擦干净。三、细菌的接种与分离技术1.液体培养基的接种法2.半固体培养基的接种法3.琼脂斜面接种法4.固体培养基的接种法(平板划线分离法)连续划线法 分区划线法5.倾注平板法6.涂布接种法 四、细菌的培养方法 1.普通培养 2.二氧化碳培养法：二氧化碳培养箱法、烛缸法、重碳酸盐-盐酸法（两者之比为0.4g：0.35ml）。3.微需氧培养法：微需氧环境为 5-6%氧气、5-10%二氧化碳、85%氮气。4.厌氧培养法 厌氧手套箱法、厌氧罐法、气袋法等。5.高渗培养法 厌氧手套箱 厌氧罐 厌氧袋五、细菌的生长现象（一）在液体培养基中的生长现象 浑浊生长、菌膜生长、沉淀生长（二）在固体培养基中的生长现象 长出菌落：光滑型、粗糙型，粘液型 菌苔生长（三）在半固体培养基上的生长现象 沿穿刺线生长 沿穿刺线扩散生长细菌在液体培基中的生长现象在半固体中的生长现象 Smooth colonyRough colony
