1、细胞培养基本技术细胞培养基本技术Bin Lu,Ph.D.http:/www.nobelprize.org/Thomas C.SdhofRandy W.SchekmanJames E.RothmanBorn:3 November 1950,Haverhill,MA,USABorn:30 December 1948,St.Paul,MN,USABorn:22 December 1955,Goettingen,GermanyStanford University,Stanford,CA,USA University of California,Berkeley,CA,USAYale Universi
2、ty,New Haven,CT,USAPrize motivation:for their discoveries of machinery regulating vesicle traffic,a major transport system in our cellsn1665年英国学者年英国学者Robert Hooke，用自制的显微镜，用自制的显微镜观察软木的薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首观察软木的薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次借用拉丁文次借用拉丁文Cella（小室）词（小室）词.n1983-39德国植物学家施莱登和动物学家施旺德国植物学家施莱登和动物学家施旺确立了确立了“细
3、胞学说细胞学说”的基本原则。的基本原则。n（）细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的；（）细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的；n（）每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己（）每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己 的的“生命生命”。n（）新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。（）新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。n进化论，遗传学和进化论，遗传学和细胞学说细胞学说定为现代生物学的三大基定为现代生物学的三大基 石，而细胞学说又是前二者的石，而细胞学说又是前二者的基石基石。The cell is the basic structural and functional unit of all kn
4、own living organisms.It is the smallest unit of life that is classified as a living thing,and is often called the building block of life.Organisms can be classified as unicellular(consisting of a single cell;including most bacteria)or multicellular(including plants and animals).Humans contain about
5、10 trillion(10 )cells.Most plant and animal cells are between 1 and 100 m and therefore are visible only under the microscope.13 主要内容一、细胞培养的基本概念二、细胞培养的基本条件三、细胞培养用液的配制四、细胞培养的基本方法五、培养细胞活力测定六、细胞冻存和复苏七、细胞培养的污染和检测是指从体内取出组织，分离细胞；或使用细胞系，在体外是指从体内取出组织，分离细胞；或使用细胞系，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，模拟体内生理环境，在无菌、适当
6、温度和一定的营养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能特性。使之生存和生长，并维持其结构和功能特性。一、细胞培养的基本概念一、细胞培养的基本概念细胞培养细胞培养(cell culture)：把活体的一小片组织（把活体的一小片组织（O.51立方毫米）置于底物上孵立方毫米）置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长。育，细胞自其周围移出并生长。组织培养组织培养(Tissue culture)：器官培养器官培养(Organ culture)：将活体中整个器官或一部分器官取出，置于生长并同时保将活体中整个器官或一部分器官取出，置于生长并同时保持其一定的结构和功能特征。持其一定的结构和功能特征。细胞培养
7、的基本概念细胞培养的基本概念原代培养原代培养取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。之前称为原代培养。优点优点组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。在一定程度上能够反映体内的状态。传代传代原代培养的细胞或细胞系，在生长、繁殖一定时间后，原代培养的细胞或细胞系，在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大，导致营养枯竭，会影响由于空间不足或细胞密度过大，导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传细胞的生长，
8、因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。代培养。细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。培养器皿中。Surface Area(mm2)Seeding DensityCells at Confluency1Versene(ml of 0.05%EDTA)Trypsin(ml of 0.05%tryspin,EDTA)Growth Medium(ml)Dishes35mm9620.3x1061.2x10611260mm2,8270.8x1063.2x106323100mm7,8542.2x1068.8x1065310150mm
9、17,6715.0 x10620.0 x10610820Culture Plates6-well9620.3x1061.2x106223-512-well4010.1x1060.4x106111-224-well2000.05x1060.2x1060.50.50.5-1.0FlasksT-252,5000.7x1062.8x106333-5T-757,5002.1x1068.4x106558-15T-16016,0004.6x10618.4x106101015-30Useful Numbers for Cell CultureThere are various sizes of dishes
10、and flasks used for cell culture.Some useful numbers such as surface area and volumes of dissociation solutions are given below for various size culture vessels.1The number of cells on a confluent plate,dish,or flask will vary with cell type.For this table,HeLa cells were used.MammalianCellsplatingC
11、orning tech(800)492-1110 X22696 well plate 2.6 x 105 cells/well24 well plate5.4 x 104 cell/well100 mm dish 1.5 x 106 cells/dish150 mm dish4.5 x 106 cells/dish150 cm2 flask8x 106 cells=80-90%confluent传代注意事项传代注意事项 接种数量为510 810 个/ml。传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达 到增长前有较长的滞留期。培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达 到最大密度需要换液或进行传
12、代培养。如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即 可进行传代。45原代培养细胞的生命归宿原代培养细胞的生命归宿1.原代培养期2.传代期3.衰退期细胞系细胞系（cell line）：传代培养的细胞是细胞系(原代培养物经首次传代成功后即成细胞系)。有限细胞系有限细胞系（finite cell line)，无限细胞系无限细胞系(infinite cell line)细胞系（细胞系（cell linecell line）肿瘤细胞系多由瘤建成，多呈类上皮型细胞，具有不死性和异体接种致瘤性。细胞株（细胞株（cell strain cell strain）由具有某些特性与标志的细胞，经选择或克隆化而派生的
13、亚系，这些特性或标志在后续的培养中一直保持下去的细胞群。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株。细胞系或细胞株的命名细胞系或细胞株的命名 以供体患者的姓名命名：以供体患者的姓名命名：HeLa（来源于宫颈癌）（来源于宫颈癌）以时间地点来命名：以时间地点来命名：CHO 中国仓鼠卵巢细胞中国仓鼠卵巢细胞（ChineseHamsterOvary）宫宫-743：宫颈癌上皮细胞，宫颈癌上皮细胞，1974年年3月建立月建立NIH3T3：美国国立卫生研究院（：美国国立卫生研究院（NationalInstituteofHealth）建立，）建立，每每3天传代，每次接种天传代，每次接种
14、3105细胞细胞ml以组织来源命名：以组织来源命名：如如BHK(幼地鼠肾细胞幼地鼠肾细胞)以临床疾病类型命名：以临床疾病类型命名：如如BALL-1细胞系细胞系(来自来自B淋巴细胞急性白血病人白细胞淋巴细胞急性白血病人白细胞)二、细胞培养的基本条件二、细胞培养的基本条件n无菌条件无菌条件n细胞生长条件细胞生长条件n细胞检测条件细胞检测条件n细胞保存条件细胞保存条件n实验室安全实验室安全细胞培养的无菌环境细胞培养的无菌环境 n无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。n（使用前）紫外照射（15-30分钟）n每周甲醛熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面一次的方式进行消毒 超净工作台超净工
15、作台 超净工作台的工作原理是超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。工作台内构成无菌环境。超净工作台的使用超净工作台的使用n使用前 开启柜内紫外灯照射1030分钟；预工作1015分钟，以除去臭氧和使工作台面、空间呈净化状态。n使用完毕后 要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。火焰消毒火焰消毒n在无菌环境进行培养时，首先要点燃酒精灯。在无菌环境进行培养时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如打开或封闭瓶
16、口等，都需以后一切操作，如打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。在火焰近处并经过烧灼进行。n培养瓶培养瓶n滴管、试管、吸管滴管、试管、吸管常用培养器皿的清洗及消毒常用培养器皿的清洗及消毒 n玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、和清洗（流水冲洗和蒸溜水冲洗）四个步骤，然后50烘干。n新的橡胶制品洗涤方法 0.5M NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5M HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50烤干备用。*清洁液的配制清洁液的配制 消毒消毒n压力蒸汽消毒器：湿热消毒，15磅，维持20-30分钟。消毒前常用的包装材料：牛
17、皮纸、棉布、铝饭盒n电热干燥箱：干热消毒，160180，维持2小时。主要用于玻璃器皿消毒。细胞培养的实验用品细胞培养的实验用品 n细胞培养瓶细胞培养瓶 (Flask)n25平方厘米（T25)n75平方厘米(T75)n150平方厘米(T150)n细胞培养板细胞培养板(Plate)n 6孔n12孔n24孔n48孔n96孔n细胞培养皿细胞培养皿(Dish)n 35mmn60mmn100mmn150mmn冻存管冻存管Cryo Vial n1.2mln2mln5mln离心管离心管n 15mln50mln细胞刮细胞刮滤滤 器器大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、
18、酶液等均采用滤过法除菌。酶液等均采用滤过法除菌。安装滤膜时注意：滤膜光滑一面是正面，要朝安装滤膜时注意：滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。上，否则起不到过滤的作用。CO2培养箱n CO2培养箱设定的条件为37 ，5 CO2。n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微 松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒。箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。培养细胞的观察培养细胞的观察液氮罐何处购买细胞何处购买细胞nATCC 细胞库细胞库(www.atcc.org).美国菌种保藏中心又称美国模式菌种收集中心。美国菌种保藏中
19、心又称美国模式菌种收集中心。n目前它可以提供以下物品目前它可以提供以下物品 细胞系细胞系3000种种 细菌和噬菌体细菌和噬菌体 15000种种 动植物病毒动植物病毒 2500种种 原生动物原生动物 1200种以及重组物品种以及重组物品 n欧洲动物细胞库欧洲动物细胞库(ECACC)和日本细胞库和日本细胞库(RCB)国内细胞库n中国科学院细胞库 中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心n中国典型培养物保藏中心 也称武汉大学保藏中心，是国家知识产权局指定的专利培养物/生物材料菌种保藏机构。http:/ 细胞的营养需要n2 细胞的生存环境 温度:37 O2 CO2:5%CO2+H2O H2CO3 H+
20、HCO3-pH:7.2-7.4 渗透压n 3 无污染n 4 无毒细胞的营养细胞的营养n碳水化合物、氨基酸和脂类三大类n也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素细胞培养的常用液体细胞培养的常用液体 n水水n平衡盐溶液平衡盐溶液 npH调节液调节液n消化液消化液n抗生素溶液抗生素溶液n培养基培养基 三、细胞培养用液的配制三、细胞培养用液的配制n水：新鲜的三蒸水或去离子水n平衡盐溶液 主要由无机盐和葡萄糖配制而成 作用：维持渗透压、缓冲和调节酸碱度 常用的缓冲液：生理盐水 PBS Hanks液 （D-Hanks常用于配制胰酶溶液）平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g
21、KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml D-Hanks液pH调节液n碳酸氢钠液 nHEPES缓冲液 是一种氢离子缓冲剂，能在细胞培养过程中较长时间保持恒定的pH范围。通常使用浓度为1015mM，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。消化液n胰蛋白酶溶液nEDTA溶液 n胶原酶溶液胰蛋白酶溶液n主要作用：水解与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离。n常用浓度：0.25%用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hanks配制，用滤器过滤除菌。n消化时间：2-10
22、分钟（显微镜下观察）用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。EDTA溶液n作用机制：通过结合（螯合）细胞间质中的二价阳离子，从而破坏细胞间的连接。n使用浓度：0.02%，配制时应加碱助溶。nEDTA不能被血清中和，终止消化后，需用培养液或PBS彻底冲洗培养瓶。胶原酶溶液n主要作用 水解结缔组织中胶原蛋白成分，而对上皮细胞影响不大。n常用剂量：最终浓度200U/ml（约为1mg/mL）或0.03%0.3%，可用 D-hanks、PBS或含血清的培养液配制。n分型：分、型以及肝细胞专用胶原酶，根据 所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型（价格贵）。胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别 项目 胰蛋白酶 胶原酶
23、 消化特性 消化软组织 消化纤维多的组织 用量 0.01%0.5%0.10.3 mg/mL（200 U/mL）消化时间 0.5 2h 1 12h pH 89 6.57.0 作用强度 强烈 缓和 细胞影响 时间过长有影响 无大影响 血清抑活 有 无 Ca2+和Mg2+有影响 无影响 抗生素溶液n通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。n配制 具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万U/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万U/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万U。n使用时溶入培养液中，使青、链霉素的浓度最终为100U/ml。n庆大霉素：使用终浓度为100U/ml，广谱、
24、稳定。培养基培养基n培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。n天然培养基天然培养基：n天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。n优点：优点：营养成分丰富，培养效果好n缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染 合成培养基合成培养基 n根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。n包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物n目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、TC199、M199、MEMn另有无血清培养基、无蛋白培养基n人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，
25、还需补充一定量的天然培养基（如血清）。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。RPMI1640n最初是由G.E，Moore为培养小鼠白血病细胞而设计的。n开始的配方特别适合于悬浮细胞生长，主要针对淋巴细胞，后经过改良，从RPMI1630、RPMI1634、直至RPMI1640。n其组分较为简单，适合许多种细胞，如肿瘤细胞、正常细胞、原代培养、传代培养等。n尤其适合人白细胞，如H9、T-15、HL-60、IM-9和K-562 等细胞系的培养。RPMI16401640种类种类nRPMI1640（A）（不含谷氨酰胺、可高压灭菌）nRPMI164
26、0 （含谷氨酰胺、过滤灭菌）DMEM细胞培养基细胞培养基n是在MEM培养基的基础上研制的n与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（4500g/L）和低糖型(1000g/L)。n高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难的肿瘤细胞等。n DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高压灭菌】DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌过滤灭菌】DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌过滤灭菌】血清的使用n血清质量好坏是实验成败的关键n常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，胎牛血清是品质最高的。n优质血清的标准 透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。n
27、血清的灭活（消除补体活性）56，30 分钟。n血清的消毒：过滤除菌牛血清牛血清n胎牛血清应取自剖腹产的胎牛n新生牛血清取自出生24小时之内的新生牛n小牛血清取自出生1030天的小牛n使用浓度：一般为520，最常用是10。何谓FBS、FCS、CS、HS?nFBS(fetal bovine serum)和FCS(fetal calf serum)是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。nCS(calf serum)是指小牛血清nHS(horse serum)是指马血清胎牛血清（胎牛血清（Fetal Bovine Serum,FBS）:屠宰怀孕母牛的时候,通过心脏穿刺
28、采血获取的胎牛的血清，新生牛（小牛）血清（Calf serum,CS）则采自出生10至14 天的小牛。两者所含的促细胞生长因子、促贴附因子、激素及其他活性物质等组份与比例不同。用途与用法也有所区别，比如某些细胞必需胎牛血清才能生长，而有些细胞只需小牛血清即可。一般来说，胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最好。除了用于细胞培养外，这些牛血清还可用于封闭液、保护液和缓冲液等。血清解冻步骤n逐步解冻法 30 或80至4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般用50 ml无菌离心管可分装4045 ml。n勿直接勿直接由30至37解冻，因温度改变太大，容
29、易造成蛋白质凝结而发生沉淀。无机盐nCaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4n对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的。谷氨酰胺谷氨酰胺n细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。n一般培养液中谷氨酰胺的含量为14mmol/L。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4放置1周可分解50，故应单独配制，置于-20保存，临用前加入培养液。n配制方法：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。n谷氨酰胺双
30、肽，如甘氨酰基谷氨酰胺。这种谷氨酰胺在溶液中稳定，并可与谷氨酰胺一样有效地被细胞利用。水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加新鲜配置的三蒸水或去离子水加新鲜配置的三蒸水或去离子水 至至1000 ml 细胞培养用液的配制n人工合成培养基只能维持细胞生存，人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。一定量的天然培养基（如血清）。n血清中含有：血清中含有：n多种蛋白质（白蛋白、
31、球蛋白、铁蛋白等）n多种金属离子；n激素；n促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。n各种生长因子n转移蛋白n不明成分(like UFO)完全培养基的组成完全培养基的组成n基础培养基基础培养基 80一一95n血清血清 5一一20n碳酸氢钠碳酸氢钠 2.0 g/Ln青、链霉素青、链霉素 各各100卑位毫升卑位毫升n一般说来含一般说来含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加维持细胞不死但支持细胞生长一般需加 10血清血清n对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至
32、今尚未完全清楚对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚n血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。综合反应。n在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞迫切需要用无血清培养基培养细胞培养细胞的生长方式及类型n 贴附生长型贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体
33、分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。n 悬浮生长型悬浮生长型细胞 不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。见于各种造血系统肿瘤细胞四、细胞培养的基本方法四、细胞培养的基本方法细胞的贴附过程 贴附生长型细胞+贴附物质带正电荷细胞带负电荷上皮样细胞上皮样细胞 来源：来源：来源于外胚层来源于外胚层，内胚层细胞，内胚层细胞 如：皮肤及其衍生物如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤上皮性肿瘤形态：形态：类似类似体内的体内的上皮细胞上皮细胞 扁平扁平，不规则多角形不规则多角形，中有圆形核，中有圆形核 生长特点生长特点 易相连易相连成片成片 相靠相靠
34、紧密相连紧密相连成薄层成薄层铺石状铺石状 生长生长时呈时呈膜状膜状移动移动 很少很少脱离细胞群而脱离细胞群而单个活动单个活动 上皮型细胞上皮型细胞 SKOv3（卵巢癌细胞）1.细胞种类：SKOv3（卵巢癌细胞）2.培养的天数：传代后3d；3.放大倍速：倒置显微镜X10；4.培养基种类：DMEM+5%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞贴壁生长，生长速度较快。CCL-1491.细胞种类：大鼠肺泡上皮细胞；2.培养的天数：1d（种在48孔板中）；3.放大倍速：倒置显微镜X20；4.培养基种类：F12K+10%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭形，透亮贴壁生长，34天传代一次，Giemsa
35、染色。成纤维细胞样细胞成纤维细胞样细胞 来源：由来源：由中胚层间充质组织起源中胚层间充质组织起源的组织的组织 如：真正的成纤维细胞如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，内皮细胞心肌，平滑肌，成骨细胞，内皮细胞形态：形态：似体内成纤维细胞似体内成纤维细胞的形态的形态 胞体梭形胞体梭形或不规则三角形或不规则三角形 胞质向外伸出胞质向外伸出23个个长短不等的突起长短不等的突起 中有卵圆形核中有卵圆形核 生长特点生长特点 排列成排列成放射状放射状，漩涡状，漩涡状 并不紧靠连成片并不紧靠连成片，细胞细胞细胞接触易断开而细胞接触易断开而 单独行动单独行动 游离的游离的单独的单独的成纤维样细胞，成纤
36、维样细胞，常有几个常有几个伸长的细胞突起伸长的细胞突起 HUVECs人脐静脉内皮细胞人脐静脉内皮细胞1.细胞种类：人脐静脉内皮细胞；细胞种类：人脐静脉内皮细胞；2.培养的天数：培养的天数：4d；原代培养；原代培养；3.放大倍速：倒置显微镜放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：培养基种类：M199+15胎牛胎牛 血清；血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭细胞状态与特征简述：细胞呈梭 形，扁平形或多角形，贴壁生长。形，扁平形或多角形，贴壁生长。骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞1.细胞种类：人骨髓间充质干细胞原代；细胞种类：人骨髓间充质干细胞原代；2.培养天数：培养天数：7天；天；3.放大
37、倍数：放大倍数：200倍，倒置显微镜；倍，倒置显微镜；4.培养基种类：培养基种类：DF12+10FBS；5.细胞状态与特征简述：使用细胞状态与特征简述：使用percoll密度密度梯度离心法分离人骨髓细胞。首次换液梯度离心法分离人骨髓细胞。首次换液48h，这是这是7天后的骨髓间充质干细胞扩增情况。天后的骨髓间充质干细胞扩增情况。每代贴壁细胞的生长过程每代贴壁细胞的生长过程n游离期游离期n贴壁期贴壁期n潜伏期潜伏期n对数生长期对数生长期n停止期（平台期）停止期（平台期）n游离期游离期n细胞接种后在培养液中呈悬浮细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此时细状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈
38、圆球形。胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一分钟一4小时小时n悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。n吸附期吸附期n 贴附底物，一般24小时内贴壁。n潜伏期潜伏期n 此时细胞有生长活动，基本无增殖。n 细胞株潜伏期一般为624小时。n对数生长期对数生长期n 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。合进行实验研究。n停止期（平台期）停止期（平台期）n 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。n 机制：接触抑制、密度依赖性密度抑制（密度抑制（Density inhibition）或接触）或接触抑制（抑制（Ccontact inhibition）n
39、1958年Abercrombie 等学者提出的一种现象，培养细胞再生长过程中多发生分裂增殖，细胞移动而相互靠近，这时某些细胞可移向其他方向，保证细胞不会重叠，一但接触，这种活动即可停止。n所谓接触抑制实际使细胞汇合形成单层时，细胞变得拥挤，与培养液接触的表面区域也相应减少，营养成分消耗，其分裂也将停止。悬浮生长型细胞悬浮生长型细胞来源：来源：血，脾或骨髓，尤以血中白细胞肿瘤细胞特点：特点：在悬浮中生长良好的细胞，圆形优点：优点：生存空间大，提供数量大，传代方便，易于收获，可获 得稳定状态缺点：缺点：观察不方便，很多细胞不能 悬浮生长(尤以正常细胞)KU8121.细胞种类：人嗜碱细胞性白血病细胞
40、系；细胞种类：人嗜碱细胞性白血病细胞系；2.培养的天数：培养的天数：5d；3.放大倍速：倒置显微镜放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：培养基种类：RPMI1640+10%新生牛血清；新生牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，悬浮生长。细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，悬浮生长。K562细胞细胞1.细胞种类：细胞种类：K562（人慢性红白血病细胞株）；（人慢性红白血病细胞株）；2.培养的天数：传代后培养的天数：传代后2天；天；3.放大倍数：倒置显微镜放大倍数：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清，胎牛血清，4mM Glutamine；5.
41、细胞状态与特征简介：悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮。细胞状态与特征简介：悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮。1悬浮生长细胞传代 细胞传代方法细胞传代方法n直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清洗掉将上清洗掉1/2 1/3，然后用吸管吹打形，然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。成细胞悬液后，再传代。n离心法：离心离心法：离心800 1000rpm，5min，除，除上清，加新的培养液，然后传代接种。上清，加新的培养液，然后传代接种。n部分贴壁生长细胞直接吹打传代或需消化后部分贴壁生长细胞直接吹打传代或需消化后传代传代n直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底
42、直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清洗掉后，将上清洗掉1/2 1/3，然后用吸，然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。管吹打形成细胞悬液后，再传代。n离心法：离心离心法：离心800 1000rpm，5min，除上清，加新的培养液，然后传代接种。除上清，加新的培养液，然后传代接种。n部分贴壁生长细胞直接吹打传代或需消部分贴壁生长细胞直接吹打传代或需消化后传代化后传代n吸除瓶内旧培养液；加入吸除瓶内旧培养液；加入1ml消化液；消化液；37C或室温或室温25 C消化消化2 5分钟分钟n显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大后；隙增大后；n直接加少许
43、含血清的培养液，终止消化；直接加少许含血清的培养液，终止消化；n细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液计数，分别接细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液计数，分别接种在新的培养瓶内。种在新的培养瓶内。2贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液是0.25的胰蛋白酶液。首次传代注意事项首次传代注意事项 n细胞生长密度不高时，不能急于传代细胞生长密度不高时，不能急于传代 n原代培养的贴壁细胞需控制消化时间原代培养的贴壁细胞需控制消化时间 n吹打已消化的细胞应减少机械损伤吹打已消化的细胞应减少机械损伤 n首次传代时细胞接种数量要多一些首次传代时细胞接种数量要多一些 n首次传代培养的首次传代培养的pHpH应偏低些应偏低
44、些 n小牛血清浓度可加大至小牛血清浓度可加大至15%15%20%20%左右左右 细胞计数细胞计数n计数结果以每毫升细胞数表示n细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同n血细胞计数器：手工计数细胞nCoulter计数仪：人工计数细胞计数步骤细胞计数步骤n1 1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。板上。n2 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。满盖片和计数板之间。n3 3、静置、静置3 3分钟。分钟。n4 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数。、镜下观察，计算计
45、数板四大格细胞总数。细胞数细胞数/ml/ml4 4大格细胞总数大格细胞总数/4/410104 4注意注意：压线细胞只计：压线细胞只计左侧左侧和和上方上方的。的。镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占若细胞团占10%10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。五、培养细胞活力测定五、培养细胞活力测定n细胞活力：细胞活力：总细胞中活细胞所占的百分比。n由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。n复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。测定方
46、法测定方法n台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色。n流式细胞仪 细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。n四唑盐（四唑盐（MTTMTT）比色法）比色法MTT比色法的原理：活细胞中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臢（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。甲臢染料在A570nm处产生吸收值，用酶标仪测定A值。六、细胞冻存和复苏六、细胞冻存和复苏n细胞深低温保存的基本原理是：在80以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故
47、可以长期保存。n细胞低温保存的关键：在于通过0-20阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。冻存和复苏的原则：慢冻快融冻存和复苏的原则：慢冻快融n当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。n如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。n慢冻程序慢冻程序 4 4 10 10 分钟分钟 20 20 30 30 分钟分钟 80 80 16-18 16-18 小时小时(或隔夜或隔夜)液氮罐长期储存
48、。液氮罐长期储存。细胞复苏方法细胞复苏方法（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37 38水浴中，使其融化（1分钟左右）；（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；（3）低速离心10分钟；（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。低温保护剂的应用低温保护剂的应用n在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。n常用的低温保护剂是常用的低温保护剂是DMSODMSO，它是一种渗透性保护剂。，它是一种渗透性保护剂。n冻存液：冻存液：含含20%20%血清培养基和血清培养基和10%DMSO10%DMSO（或（或1010甘油）甘油）DMSODMSO液用
49、培养液配好，避免因临时配制液用培养液配好，避免因临时配制产热产热而伤害细而伤害细 胞。胞。细胞欲冷冻保存时，细胞浓度应该多少？细胞欲冷冻保存时，细胞浓度应该多少？n冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml n融合瘤细胞则以5x106 cells/ml 为宜。七、细胞培养的污染和检测七、细胞培养的污染和检测n细胞污染的种类 细菌、真菌、酵母菌、霉菌和病毒n污染源 无菌操作技术不当 操作室环境不佳 污染之血清 污染之细胞 细菌污染细菌污染 n细胞培养常见的污染n最常见的有：大肠杆菌、枯草杆菌、假单胞菌、白色葡萄球菌。n培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。n污染后细胞发生病
50、理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。真菌污染真菌污染n真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。细胞营养液仍清亮但变黄，细胞生长变缓，部分细细胞营养液仍清亮但变黄，细胞生长变缓，部分细胞发生脱落，细胞间隙可见铺满细沙样小点。胞发生脱落，细胞间隙可见铺满细沙样小点。支原体污染表现支原体污染表现支原体污染电镜照片支原体污染电镜照片,煎蛋状和其他形状煎蛋状和其他形状 白色念珠菌污染白色念珠菌污染Concentrating CellsProtocolToconcentratecellsfromasuspensionculture(orresuspendedcel
