1、 第三十五章病毒感染实验诊断 病毒检验的一般原则病毒检验的一般原则 快速、简便、特异和敏感。快速、简便、特异和敏感。首先根据流行病学和临床特点，初步首先根据流行病学和临床特点，初步判断可能感染的病毒。判断可能感染的病毒。病毒检验的内容（三个方面）n测病毒体和宿主细胞的病理改变 直接查病毒和分离培养n检测病毒蛋白抗原和核酸n血清学试验，检测机体产生的抗体 第一节第一节 标本采集与运送标本采集与运送 1.1.采样时间采样时间 尽可能在发病的初期，急性尽可能在发病的初期，急性 期或患者人院的当天进行。期或患者人院的当天进行。2.2.标本种类的选择标本种类的选择 根据临床感染的症状根据临床感染的症状
2、及流行病学资料，判断可能感染病毒种及流行病学资料，判断可能感染病毒种类，选择相应部位采取标本。类，选择相应部位采取标本。一、标本的采集一、标本的采集 常见分离病毒标本的选择常见分离病毒标本的选择 病毒病毒咽拭子咽拭子粪便粪便血液血液脑脊液脑脊液 唾液唾液 组织组织 柯萨奇柯萨奇A和和B组组+心心 单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒+脑膜脑膜 腮腺炎病毒腮腺炎病毒+流感病毒流感病毒+轮状病毒轮状病毒+HAV+HIV+精液精液 3 3标本的采集方法标本的采集方法(1)(1)血液：血液：以无菌取抗凝血以无菌取抗凝血10ml10ml。抗凝选用抗凝选用100 u100 umlml肝素钠。肝素钠。用于分离用于分离C
3、MVCMV、HSVHSV，、黄病，、黄病 毒、毒、EBVEBV、HIV-1HIV-1及新生儿肠及新生儿肠 道病毒。道病毒。(2)(2)脑脊液：脑脊液：以无菌取脑脊液以无菌取脑脊液1 12ml2ml，冰浴立即送检。在冰浴立即送检。在4 4可存放可存放72h72h。用于分离柯萨奇病毒、用于分离柯萨奇病毒、ECHOECHO病毒、病毒、肠道病毒、腮腺炎病毒。肠道病毒、腮腺炎病毒。(3)(3)宫颈或阴道拭子：宫颈或阴道拭子：采取病灶部位分采取病灶部位分 泌物，或将拭子伸人宫颈约泌物，或将拭子伸人宫颈约lcmlcm停留停留 5 5秒取出，冰浴立即送检。用于分离秒取出，冰浴立即送检。用于分离 HSVHSV、
4、CMVCMV。(4)(4)粪便标本：粪便标本：取取2 24 4粪便加粪便加10ml10ml运送运送 液立即送检，用于分离腺病毒、肠道液立即送检，用于分离腺病毒、肠道 病毒和轮状病毒。病毒和轮状病毒。(5)(5)含漱液：含漱液：用无菌生理盐水让患者含漱用无菌生理盐水让患者含漱 。用于分离流感病毒、副流感病毒、。用于分离流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、鼻病毒、RSVRSV等。等。(6)(6)喉拭子：喉拭子：用压舌板避免唾液污染，用拭子用压舌板避免唾液污染，用拭子 采取咽喉部表面。用于分离腺病毒、采取咽喉部表面。用于分离腺病毒、CMVCMV、肠道病毒、肠道病毒、HSVHSV、流感病毒等。、流感病毒等。
5、(7)(7)尿道拭子及尿液标本：尿道拭子及尿液标本：尿道拭子伸人尿道尿道拭子伸人尿道 4cm4cm转动转动3 3次，以获得较多的上皮细胞，用次，以获得较多的上皮细胞，用 于分离于分离CMVCMV和和HSVHSV。(8)(8)尸检标本：尸检标本：死亡后尽早采集各种器官，分死亡后尽早采集各种器官，分 别使用器械和容器。别使用器械和容器。病毒抵抗力弱，室温中容易灭活，病毒抵抗力弱，室温中容易灭活，用于分离培养的标本要尽快送检，用于分离培养的标本要尽快送检，44下数或下数或-70-70。冻存液中加入甘油或二甲基亚砜冻存液中加入甘油或二甲基亚砜(DMSO)(DMSO)等作保护。等作保护。二、标本的运送和
6、保存病毒运送培养基病毒运送培养基以以HanksHanks液为基础加液为基础加灭活的小牛血清。为抑制细菌生长加灭活的小牛血清。为抑制细菌生长加青霉素青霉素100U100Umlml和链霉素和链霉素100g100gmlml，为了抑制真菌的生长加入为了抑制真菌的生长加入2 25g5gmlml二性霉素二性霉素B B或或40g40gmlml制霉菌素。制霉菌素。第二节 病毒分离与鉴定n 组织细胞培养n 鸡胚培养n 动物接种一、病毒的分离方法一、病毒的分离方法 1.1.组织细胞培养组织细胞培养 根据细胞的来源、特性和传代次数分为：(1)原代细胞培养：将离体的新鲜组织器官经机械或胰蛋白酶处理，制成单个细胞悬液，
7、加营养液在细胞培养皿中培养。活细胞贴壁生长形成的单层细胞，称之为原原代细胞代细胞。原代细胞再用胰蛋白酶或EDTA等消化后加营养液继续培养，称次代细胞次代细胞。(2)(2)二倍体细胞株：二倍体细胞株：仍保持二倍体特性。仍保持二倍体特性。寿命一般为寿命一般为40405050代，如人胚肺细胞代，如人胚肺细胞 广泛用于病毒分离和疫苗制备。广泛用于病毒分离和疫苗制备。(3)(3)传代细胞系：传代细胞系：来于肿瘤细胞，染色体来于肿瘤细胞，染色体 特征类似肿瘤细胞。常用的有人宫颈特征类似肿瘤细胞。常用的有人宫颈 癌细胞癌细胞(Hela(Hela)、人喉上皮癌细胞、人喉上皮癌细胞 (Hep-2)(Hep-2)
8、。繁殖快，易于传代保存。只能繁殖快，易于传代保存。只能用于病毒病毒分离，不能用于疫苗制备用于病毒病毒分离，不能用于疫苗制备。常用于病毒分离的细胞常用于病毒分离的细胞 细胞种类细胞种类可分离的病毒可分离的病毒 原代细胞原代细胞 非洲绿猴肾细胞非洲绿猴肾细胞 人单核细胞人单核细胞 人胚肾、肺细胞人胚肾、肺细胞 恒河猴猕猴肾细胞恒河猴猕猴肾细胞HSV、RSV、VZV、腮腺炎病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒 HIV、HTLV、HHV-6腮腺炎病毒腮腺炎病毒、腺、腺病毒病毒ECHO、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A、B组、组、RSV 二倍体细胞株二倍体细胞株 人胚肺成纤维细胞株人胚肺
9、成纤维细胞株 WI-38、MRC5 CMV、VZV、鼻、鼻病毒病毒腮腺炎病毒腮腺炎病毒、腺、腺病毒病毒 传代细胞系传代细胞系 Hela Hep-2 Vero 柯萨奇柯萨奇A、B组、组、RSV腺腺病毒、病毒、RSVHSV、RSV、风疹病毒、风疹病毒、轮状、轮状病毒、麻疹病毒病毒、麻疹病毒 鸡胚是用于分离粘病毒科、疱疹病毒、痘鸡胚是用于分离粘病毒科、疱疹病毒、痘类病毒的较为理想的材料。类病毒的较为理想的材料。优点优点 有不同部位可以接种，易于病毒繁殖；有不同部位可以接种，易于病毒繁殖；来源充足，操作简便；通常是无菌的；对接来源充足，操作简便；通常是无菌的；对接种病毒种病毒不产生抗体。不产生抗体。缺
10、点缺点 卵黄中含有抗家禽病原的抗体；可带卵黄中含有抗家禽病原的抗体；可带有某些病毒如鸡白血病病毒；饲料中的抗生有某些病毒如鸡白血病病毒；饲料中的抗生素也能传递给鸡胚。素也能传递给鸡胚。2 2鸡胚接种鸡胚接种 鸡胚的接种方法n 卵黄囊接种n 羊膜腔接种n 尿囊腔接种n 绒毛尿囊膜接种n 脑内接种n 胚体接种 常用动物 动物十分重要。小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等常用于分离病毒。接种部位 静脉、鼻咽腔、腹腔、脑内、皮内、皮下等。发病情况观察 食欲、活动及粪便情况；局部和全身变化 神经系统感染可出现震颤、松毛，软弱、不安、弓背、抽死亡；呼吸系统病毒可出现咳嗽、呼吸加快、少食等。不死，解剖后查病毒抗原，
11、死亡，取病变组织传代和鉴定。3 3动物接种动物接种 三、病毒的鉴定 1.1.根据临床特点，流行病学资料，标根据临床特点，流行病学资料，标 本来源，大致了解病毒的一些特本来源，大致了解病毒的一些特 性，有助于确认病毒的种类。性，有助于确认病毒的种类。2.2.动物感染范围及特点动物感染范围及特点 病毒感染动病毒感染动 物的范围、发病的潜伏期。物的范围、发病的潜伏期。3.3.细胞培养特点。综合上述资料作出细胞培养特点。综合上述资料作出 鉴定。鉴定。病毒鉴定的方法1.细胞培养的结果观察 病毒增殖后导致细胞发生病毒增殖后导致细胞发生:细胞病变效应细胞病变效应(CPE)(CPE)：细胞细胞肿大，变圆堆积肿
12、大，变圆堆积成葡萄状，细胞成葡萄状，细胞溶解溶解出现空斑出现空斑，细胞，细胞融合形成多核巨细胞融合形成多核巨细胞，胞，胞 浆内或核出现嗜酸性或嗜碱性浆内或核出现嗜酸性或嗜碱性包涵体包涵体等；等；不出现细胞病变现象。不出现细胞病变现象。细胞培养液细胞培养液pHpH的变化。的变化。2.2.中和试验中和试验原理原理 病毒加上特异性抗体使病毒失去病毒加上特异性抗体使病毒失去感染性，再经细胞培养和动物接种不出感染性，再经细胞培养和动物接种不出现病变。现病变。常用细胞培养进行中和试验。如果特异常用细胞培养进行中和试验。如果特异性抗体能中和病毒，使之失去感染性，性抗体能中和病毒，使之失去感染性，则不出现细胞
13、病变效应，则该病毒为特则不出现细胞病变效应，则该病毒为特异性抗体的同型病毒。异性抗体的同型病毒。应用应用 用于病毒的分型诊断最具敏用于病毒的分型诊断最具敏感和准确性。也可用于检查患者病感和准确性。也可用于检查患者病后或人工免疫后，机体血清中抗体后或人工免疫后，机体血清中抗体增加情况。增加情况。3.3.空斑或蚀斑形成试验空斑或蚀斑形成试验 空斑空斑是指在单层细胞中被病毒感染引是指在单层细胞中被病毒感染引 起死亡的细胞区域，起死亡的细胞区域，周围被活细胞包周围被活细胞包 围。一般而言，围。一般而言，一个空斑是由一个感染一个空斑是由一个感染 性病毒颗粒感染所引起的性病毒颗粒感染所引起的。不同的病毒不
14、同的病毒 引起的空斑形态和大小不同。引起的空斑形态和大小不同。可进行病可进行病 毒颗粒的计数、纯化，结合中和试验可毒颗粒的计数、纯化，结合中和试验可 进行病毒的鉴定。进行病毒的鉴定。4.4.干扰现象干扰现象 某些病毒间存在着干扰现象，某些病毒间存在着干扰现象，如某些型别的鼻病毒能干扰以如某些型别的鼻病毒能干扰以 后进入的副流感病毒的增殖，从后进入的副流感病毒的增殖，从 而阻抑后者的红细胞吸附作用。而阻抑后者的红细胞吸附作用。5.5.红细胞吸附及吸附抑制试验红细胞吸附及吸附抑制试验正粘病毒，副粘病毒感染的宿主细胞，病毒正粘病毒，副粘病毒感染的宿主细胞，病毒增殖后产生细胞病变，但在细胞表面含有病增
15、殖后产生细胞病变，但在细胞表面含有病毒某些抗原成分毒某些抗原成分(血凝素血凝素)，能吸附鸡、豚鼠，能吸附鸡、豚鼠或猴红细胞。或猴红细胞。可作初步鉴定。如果在培养瓶中加入相应可作初步鉴定。如果在培养瓶中加入相应的血凝素抗血清后，不出现红细胞吸附现的血凝素抗血清后，不出现红细胞吸附现象，即为红细胞吸附抑制试验阳性，可作为象，即为红细胞吸附抑制试验阳性，可作为病毒鉴定的依据。病毒鉴定的依据。4 4血凝试验及血凝抑制试验血凝试验及血凝抑制试验 某些病毒可与某些哺乳动物或禽某些病毒可与某些哺乳动物或禽类的红细胞产生血凝现象。类的红细胞产生血凝现象。加入相应的血凝素抗体可抑制血加入相应的血凝素抗体可抑制血
16、 凝现象的发生，是为血凝抑制试凝现象的发生，是为血凝抑制试验。可作为病毒型鉴别确定的依验。可作为病毒型鉴别确定的依据。据。5病毒的大小及形态 可用电子显微镜观察病毒的大小可用电子显微镜观察病毒的大小及形态。及形态。6耐酸试验 肠道病毒对酸有耐受力，而鼻肠道病毒对酸有耐受力，而鼻病毒在酸性环境下易被灭活。病毒在酸性环境下易被灭活。7.乙醚敏感试验 病毒外围如有类脂病毒外围如有类脂包膜包膜，则易，则易 被乙醚破坏，而失去感染性，不被乙醚破坏，而失去感染性，不 能感染细胞。可作为病毒是否具能感染细胞。可作为病毒是否具 有类脂包膜的依据，也可用氯仿有类脂包膜的依据，也可用氯仿 或去胆酸钠代替乙醚进行试
17、验。或去胆酸钠代替乙醚进行试验。8 8核酸类型鉴别及序列测定核酸类型鉴别及序列测定 利用5溴-2-脱氧尿苷(BUDR)抑制DNA复制的特性，在细胞培养液中加入该物质，可抑制DNA病毒的复制和增殖，抑制细胞病变的出现，但对RNA病毒无抑制作用，以此判断病毒核酸类型。对病毒核酸特异序列或全序列的碱基排列测定对病毒核酸特异序列或全序列的碱基排列测定或或 DNADNA杂交、杂交、DNA-RNADNA-RNA杂交来鉴定病毒。杂交来鉴定病毒。9 9免疫荧光抗体染色免疫荧光抗体染色 将感染细胞固定，用特异抗血将感染细胞固定，用特异抗血 清荧光标记染色，在荧光显微镜清荧光标记染色，在荧光显微镜 下，可见细胞内
18、荧光，即可确定下，可见细胞内荧光，即可确定 型别。型别。第三节病毒感染快速诊断通过测定病毒的特异标志成分，如通过测定病毒的特异标志成分，如特殊形态特殊形态、特异的抗原特异的抗原成分及成分及病毒病毒的核酸的核酸，早期确认病毒的感染，是，早期确认病毒的感染，是病毒学诊断的重大发展。病毒学诊断的重大发展。一、形态学检查1 1光学显微镜光学显微镜 查包涵体。查包涵体。狂犬病病毒狂犬病病毒在脑细胞出现嗜酸性的圆在脑细胞出现嗜酸性的圆 形或椭圆形包涵体，称为形或椭圆形包涵体，称为内基小体内基小体。巨细胞病毒巨细胞病毒在上皮细胞的细胞核内出在上皮细胞的细胞核内出 现周围绕有一轮晕似现周围绕有一轮晕似“猫头鹰
19、眼猫头鹰眼”样样 大型嗜酸性包涵体大型嗜酸性包涵体。Negri body in a neuron 2 2电子显微镜检查电子显微镜检查 (1)(1)电镜直接检查：早期病毒感染标电镜直接检查：早期病毒感染标 本的病毒颗粒。如本的病毒颗粒。如“秋季泻秋季泻”患儿患儿 粪便中的粪便中的轮状病毒轮状病毒、甲肝患者粪、甲肝患者粪 便中的便中的HAVHAV，疱疹病毒疱疹病毒的疱疹液，的疱疹液，HBVHBV患者血清，均可观察到特征性患者血清，均可观察到特征性 病毒颗粒。病毒颗粒。(2)(2)免疫电镜检查：在标本中加入免疫电镜检查：在标本中加入 抗体。使病毒聚集成块负染观抗体。使病毒聚集成块负染观 察，更易发现
20、病毒体，灵敏度察，更易发现病毒体，灵敏度 可提高可提高100100倍。倍。二、病毒抗原检测 病毒抗原是病毒特异性的标志，病毒抗原是病毒特异性的标志，通过免疫学技术检测标本中特通过免疫学技术检测标本中特 异性抗原存在，可以早期诊断异性抗原存在，可以早期诊断 病毒感染。病毒感染。1 1免疫荧光技术免疫荧光技术 适合于型别少，适合于型别少，细胞培养难以成功的病毒，如流细胞培养难以成功的病毒，如流 感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒等。肝活检巨细胞病毒、腺病毒等。肝活检 组织中的肝炎病毒、神经组织中组织中的肝炎病毒、神经组织中 的单纯疱疹病毒、脑组织中的狂的
21、单纯疱疹病毒、脑组织中的狂 犬病毒或其他脱落细胞和活检组犬病毒或其他脱落细胞和活检组 织中的病毒抗原检测。织中的病毒抗原检测。2 2酶免疫技术酶免疫技术 有酶免疫组化和有酶免疫组化和 酶免疫吸附酶免疫吸附(ELlSA(ELlSA)试验法。测试验法。测 定标本中游离的抗原或抗体。定标本中游离的抗原或抗体。如检测如检测乙型肝炎病毒的表面抗乙型肝炎病毒的表面抗 原原(HBsAg(HBsAg)，HIVHIV感染病人的感染病人的P24P24 抗体等抗体等。3.3.其他技术其他技术 如固相放射免疫技术、如固相放射免疫技术、发光免疫分析技术、胶体金标记发光免疫分析技术、胶体金标记 的免疫层析技术等。的免疫层
22、析技术等。三、早期抗体检测 检测病毒感染机体后产生的早期检测病毒感染机体后产生的早期特异性抗体，如测定特异性抗体，如测定特异性特异性IgMIgM可以可以快速明确诊断快速明确诊断各种病毒引起的新生各种病毒引起的新生儿先天性感染儿先天性感染，测定，测定HAVHAV感染后抗感染后抗HAVHAV的的IgMIgM抗体可以明确诊断抗体可以明确诊断HAHA等。等。四、病毒核酸检测 只要有完整的特异基因片段存在，只要有完整的特异基因片段存在，就可进行诊断。就可进行诊断。1 1斑点杂交法斑点杂交法 将待测的将待测的DNADNA或或RNARNA直接点在杂交滤膜上，直接点在杂交滤膜上，变性后，用标记的核酸探针进行杂
23、交。变性后，用标记的核酸探针进行杂交。用用3232p p或或131131I I同位素标记的探针通过放射白同位素标记的探针通过放射白显影，可直接观察。现用地高辛、生物显影，可直接观察。现用地高辛、生物素等非同位素物质标记，然后采用酶反素等非同位素物质标记，然后采用酶反应或酶免疫技术进行检测，已被越来越应或酶免疫技术进行检测，已被越来越多的实验室广泛使用。多的实验室广泛使用。2 2固相杂交技术固相杂交技术 将核酸探针包被聚苯乙烯微孔将核酸探针包被聚苯乙烯微孔 板中，加人待测的核酸序列和板中，加人待测的核酸序列和 标记的指示探针标记的指示探针杂交液中进行杂交液中进行 杂交，洗涤后，用酶免疫技术杂交，
24、洗涤后，用酶免疫技术 进行检测。进行检测。3.3.原位分子杂交技术原位分子杂交技术 在细胞原位暴露在细胞原位暴露DNADNA或或RNARNA，加入标，加入标记特异核酸探针进行杂交。通过显记特异核酸探针进行杂交。通过显色技术可显示特定杂交探针在细胞色技术可显示特定杂交探针在细胞内的位置和核酸的数量。内的位置和核酸的数量。4.Southern印迹和Northern印迹法 SouthernSouthern印迹法用于印迹法用于DNADNA的杂交。提取的杂交。提取 DNA,DNA,用内切酶切割后，进行琼脂糖电泳用内切酶切割后，进行琼脂糖电泳 按分子量使按分子量使DNADNA分开，将分开，将DNADNA移
25、至硝酸纤移至硝酸纤 维膜上，用标记探针进行杂交。可以检维膜上，用标记探针进行杂交。可以检 测病毒测病毒DNADNA特异序列。特异序列。NorthernNorthern印迹法用于印迹法用于RNARNA杂交分析。将杂交分析。将 琼脂糖电泳后的琼脂糖电泳后的RNARNA移至移至DBMDBM膜上，用标膜上，用标 记探针进行杂交。用于检测记探针进行杂交。用于检测RNARNA或或mRNAmRNA。5 5聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)(PCR)选择病毒的选择病毒的特异保守片段特异保守片段作为靶基因，进行引作为靶基因，进行引物设计和扩增可诊断病毒性感染。物设计和扩增可诊断病毒性感染。(1)DNA病毒：可直
26、接进行病毒：可直接进行PCR扩增其特异扩增其特异 片段。片段。(2)RNA病毒：可通过病毒：可通过RT-PCR技术，技术，将将RNA 逆转录为逆转录为cDNA，再进行，再进行PCR扩增。扩增。(3)(3)定量定量PCRPCR技术：对扩增的产物进技术：对扩增的产物进 行原始标本定量，对病毒感染的行原始标本定量，对病毒感染的 诊断起到了量化的作用。同时，诊断起到了量化的作用。同时，对研究病毒和机体之间的关系提对研究病毒和机体之间的关系提 供了参考。供了参考。有些病毒如轮状病毒的核酸具有典有些病毒如轮状病毒的核酸具有典型的分节段特点。可以从标本中直型的分节段特点。可以从标本中直接提取轮状病毒的核酸。通过聚丙接提取轮状病毒的核酸。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(PAGE)，观察其特，观察其特有的有的1111个核酸节段的条带排列情况，个核酸节段的条带排列情况，进行诊断。进行诊断。6 6病毒核酸的直接检测病毒核酸的直接检测
