1、1泛素融合对泛素融合对EB病毒核抗原病毒核抗原1DNA免疫效果的影免疫效果的影响响硕士生：王卫东硕士生：王卫东 导导 师：桑建利师：桑建利 教教 授授 谷淑燕谷淑燕 研究员研究员北京师范大学生命科学学院中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所2004年6月2 研究背景研究背景 选题目的、意义选题目的、意义（Why）（How）课题设计课题设计（What）实验结果实验结果 结论结论3 EB病毒概述病毒概述 EBNA1 蛋白的结构与功能蛋白的结构与功能 泛素蛋白酶体通路与泛素蛋白酶体通路与MHC-I类抗原递呈类抗原递呈 CTL在机体抗病毒免疫反应中的作用在机体抗病毒免疫反应中的作用 DNA疫苗的优化策略
2、疫苗的优化策略456疾病种类疾病种类 疾病说明疾病说明1.原发感染(a)急性IM (b)慢性IM (c)致死性IM2.免疫抑制 患者的B淋 (a)器官移植患者 巴细胞瘤 (b)AIDS患者 3.Burkitts 淋巴瘤(BL)4.鼻咽癌(NPC)5.何杰金病(HD)6.胃癌通常无疾病症状免疫功能失调后的延续性疾病Ducan 综合症-X连锁的淋巴细胞增生性紊乱免疫系统抑制后的易发肿瘤流行于非洲的赤道附近流行于中国南方及东南亚，80,000例/年50%的病例中有EBV参与7%的病例中有EBV参与7预防性疫苗，阻断其原发感染来预防相关疾病预防性疫苗，阻断其原发感染来预防相关疾病 以EBV的MA（gp
3、350/220）为免疫原（其主要依据是gp350/220能够诱导机体产生高滴度的中和抗体）治疗性疫苗，清除体内治疗性疫苗，清除体内EBV感染的细胞感染的细胞 以EBV的潜伏膜蛋白LMP1和LMP2为免疫原，进行多肽、重组活疫苗、DNA疫苗及免疫细胞疫苗等多种尝试 8 EB病毒及其相关疾病病毒及其相关疾病 EBNA1 蛋白的结构与功能蛋白的结构与功能 泛素蛋白酶体通路与泛素蛋白酶体通路与MHC-I类抗原递呈类抗原递呈 CTL在机体抗病毒免疫反应中的作用在机体抗病毒免疫反应中的作用 DNA疫苗的优化策略疫苗的优化策略9EBNA1是唯一一种在不同潜伏感染状态下均有表达的病毒蛋白是唯一一种在不同潜伏感
4、染状态下均有表达的病毒蛋白 EBNA1蛋白的结构与功能蛋白的结构与功能11 EB病毒及其相关疾病病毒及其相关疾病 EBNA1 蛋白的结构与功能蛋白的结构与功能 泛素蛋白酶体通路与泛素蛋白酶体通路与MHC-I类抗原递呈类抗原递呈 CTL在机体抗病毒免疫反应中的作用在机体抗病毒免疫反应中的作用 DNA疫苗的优化策略疫苗的优化策略泛素蛋白酶体通路泛素蛋白酶体通路 蛋白质抗原加工递呈的两条基本途径蛋白质抗原加工递呈的两条基本途径 14 EB病毒及其相关疾病病毒及其相关疾病 EBNA1 蛋白的结构与功能蛋白的结构与功能 泛素蛋白酶体通路与泛素蛋白酶体通路与MHC-I类抗原递呈类抗原递呈 CTL在机体抗病
5、毒免疫反在机体抗病毒免疫反应中的作用应中的作用 DNA疫苗的优化策略疫苗的优化策略15161718 EB病毒及其相关疾病病毒及其相关疾病 EBNA1 蛋白的结构与功能蛋白的结构与功能 泛素蛋白酶体通路与泛素蛋白酶体通路与MHC-I类抗原递呈类抗原递呈 CTL在机体抗病毒免疫反应中的作用在机体抗病毒免疫反应中的作用 DNA疫苗的优化策略疫苗的优化策略DNA疫苗及其免疫机理疫苗及其免疫机理DNA疫苗优化策略疫苗优化策略（高导入、高表达、高递呈）（高导入、高表达、高递呈）21泛素融合能增强泛素融合能增强DNADNA疫苗的免疫效果疫苗的免疫效果 文献报道文献报道 Influenza virus(NP)
6、LCMV(NP)HIV(Ref)EBV(LMP1)可能机理可能机理 在细胞内表达的泛素化靶抗原经蛋白酶体降解 后，迅速被加工、处理和递呈，刺激机体MHC-I类分子限制的特异 性CD8+T淋巴细胞的增殖、分化。22 通过比较通过比较Ubiquitin融合前后融合前后EBNA1基因所诱发的基因所诱发的特特 异异 性体液免疫反应和性体液免疫反应和CTL反应的变化，分析反应的变化，分析Ubiquitin的融合对的融合对EBNA1的的DNA免疫效果的影响。免疫效果的影响。探索探索EBNA1作为作为EBV相关肿瘤的免疫治疗靶抗原的相关肿瘤的免疫治疗靶抗原的可能性，为可能性，为EBV相关肿瘤治疗性疫苗的研究
7、提供新相关肿瘤治疗性疫苗的研究提供新的思路。的思路。进一步证实进一步证实Ubiquitin的融合对的融合对DNA疫苗免疫效果的疫苗免疫效果的增强效应。增强效应。选题的目的和意义选题的目的和意义 EBNA1EBNA1基因扩增基因扩增课课 题题 设设 计计ubiquitinubiquitin基因扩增基因扩增ub-EBNA1ub-EBNA1基因融合基因融合原核表达及纯化原核表达及纯化真核表达质粒构建及表达分析真核表达质粒构建及表达分析DNADNA免疫免疫Balb/CBalb/C小鼠小鼠免疫效果评价免疫效果评价特异性特异性CTLCTL检测检测EBNA1EBNA1特异性抗体检测特异性抗体检测抗体制备抗体
8、制备检测检测抗抗原原包包被被ABCD24第一部分第一部分EBNA1与与Ub基因的扩增、融合基因的扩增、融合及序列测定及序列测定Balb/CBalb/C小鼠肝细胞小鼠肝细胞UbUb 基因基因pBR322-KpBR322-K质粒质粒Ub-EBNA1 Ub-EBNA1 融合基因（测序）融合基因（测序）总总RNARNAEBNA1EBNA1基因基因下游引物中引入了下游引物中引入了Bgl II酶切位点，并将其酶切位点，并将其羧基端的第羧基端的第76位氨基位氨基酸由酸由Gly(GGC)突变突变为为Ala(GCT)根据根据N末端法则将末端法则将N末端第一个氨基酸由末端第一个氨基酸由Met（ATG）突变为）突变
9、为Arg（AGA），且引），且引入了入了Bgl II酶切位点酶切位点PCRRT-PCR连接T载体pMD18-EBNA1 pMD18-Ub 拼接实实 验验 设设 计计26pMD18-Ub-EBNA1质粒的构建质粒的构建27Ub基因的扩增基因的扩增28Ub基因的克隆及及鉴定基因的克隆及及鉴定EBNA1基因的扩增、克隆及鉴定基因的扩增、克隆及鉴定30pMD18-Ub-EBNA1质粒鉴定质粒鉴定 31 分别扩增了突变的Ub和EBNA1基因。两者融合后（Ub-Ala/Arg-EBNA1）的基因测序分析表明：序列与预期结果一致。32第二部分第二部分EBNA1 的原核表达、蛋白纯化及抗体制备的原核表达、蛋白
10、纯化及抗体制备实实 验验 设设 计计构建原核表达质粒pET30a-EBNA1和和pET30a-SS580酶切鉴定转化 BL21(DE3)细菌诱导表达分析镍离子亲和柱纯化免疫小鼠采集血清ELISA测定抗体滴度Western blot检测3625-kDa EBNA1蛋白的表达与纯化蛋白的表达与纯化 38 镍离子亲和柱纯化的25-kDa EBNA1免疫Balb/C小鼠后，制备了鼠抗25-kDa EBNA1血清，抗体滴度大于1:6400。图图 25-kDa EBNA1蛋白的蛋白的western blot鉴定鉴定A.SDS-PAGE分析 B.鼠抗25-kDa EBNA1血清 C.鼻咽癌病人血清1.蛋白质
11、分子量标准 2.未诱导对照 3.诱导后的表达 4.纯化后的蛋白 1 2 3 4BA1 2 3 4 1 2 3 4CkDa97.466.243.031.020.1kDa97.466.243.031.020.1kDa97.466.243.031.020.140 诱导表达和纯化了Mr 2.5104左右的融合蛋白（25-kDa EBNA1）。制备了鼠抗25-kDa EBNA1血清。免疫印迹显示，该蛋白能被鼻咽癌（NPC）病人血清和鼠抗25-kDa EBNA1血清特异性识别。41第三部分第三部分EBNA1和和Ub-EBNA1真核表达质粒的真核表达质粒的构建及表达构建及表达 分析分析实实 验验 设设 计计
12、构建pCI-EBNA1和pCI-Ub-EBNA1真核表达质粒酶切鉴定瞬时转染HeLa细胞表达分析间接免疫荧光检测Western blot检测4344 M 1 2 3 4bp20001000750500250100Lane M.DL2000 1.pCI-EBNA1/Sma 2.pCI-EBNA1/Xba3.pCI-EBNA1/EcoR 4.pCI/EcoR图 pCI-EBNA1质粒酶切鉴定Fig.Restriction endonuclease digestion map of plasmid pCI-EBNA1 M 1 2 3 4 5bp20001000750500250Lane M.DL20
13、00 1.pCI-Ub-EBNA1/Sma 2.pCI-Ub-EBNA1/EcoR+Sal 3.pCI-Ub-EBNA1/Bgl 4.pCI-Ub-EBNA1/EcoR 5.pCI/EcoR图 pCI-Ub-EBNA1质粒酶切鉴定Fig.Restriction endonuclease digestion map of plasmid pCI-Ub-EBNA147B 1 2 3 4kDa97.466.243.031.0AA图 为EBV阳性鼻咽癌病人血清免疫印迹结果 B图 为重组蛋白免疫小鼠之血清免疫印迹结果1.pCI转染之HeLa细胞 2.pCI-EBNA1转染之HeLa细胞 3.pCI-Ub
14、-EBNA1转染之HeLa细胞 4.蛋白质分子量标准图 真核表达蛋白的Western印迹分析kDa97.466.243.031.0 1 2 3 448成功地构建了单基因和融合基因的真核表达质粒。均能有效表达目的蛋白。鼠抗25-kDa EBNA1血清能够识别HeLa细胞中瞬时表达的全长EBNA1蛋白。49第四部分第四部分pCI-EBNA1和和pCI-Ub-EBNA1真核表达真核表达载体的免疫效果评价载体的免疫效果评价特异性抗体特异性抗体水平测定水平测定免疫动物免疫动物特异性特异性CTL活性检测活性检测体液免疫水平检测体液免疫水平检测细胞免疫水平检测细胞免疫水平检测实实 验验 设设 计计5152图
15、 DNA免疫小鼠的血清EBNA1抗体滴度Fig.Anti-EBNA1 antibody induced by DNA immunization in mice53CTL活性测定活性测定免疫的小鼠免疫的小鼠取脾，制备脾淋巴细胞取脾，制备脾淋巴细胞体外刺激体外刺激多肽负载的多肽负载的P815细胞细胞丝裂霉素丝裂霉素C处理处理刺激细胞刺激细胞靶细胞靶细胞效应细胞效应细胞CTL测定测定增增殖殖杀伤杀伤55图 DNA免疫小鼠产生的EBNA1特异性CTL活性Fig.EBNA1-specific CTL responses induced by DNA immunization in mice56n单基因和
16、融合基因免疫Balb/C小鼠后能够诱生针对EBNA1 特异性的抗体和CTL反应。二者诱生抗体的效率无明显差别，但泛素的融合使得针对EBNA1的特异性CTL反应明显增强。57结结 论（论（1 1）RT-PCR方法获得羧基端第76位氨基酸由Gly（GGC）突变为Ala（GCT）的Balb/C小鼠的Ub基因，PCR 方法获得N末端第一个氨基酸由Met（ATG）突变为Arg（AGA）的EBNA1基因。两者融合后（Ub-Ala/Arg-EBNA1）的基因测序分析表明：序列与预期结果一致。将EBNA1基因和Ub-Ala/Arg-EBNA1融合基因分别克隆入pCI表达载体，成功地构建了真核表达质粒pCI-E
17、BNA1 和pCI-Ub-EBNA1。瞬时转染HeLa细胞后的结果显示，两种质粒均能有效表达目的蛋白。58结结 论（论（2 2）质粒pCI-EBNA1 和pCI-Ub-EBNA1 免疫Balb/C小鼠后能够诱生针对EBNA1 特异性的抗体和特异性的CTL反应。二者诱生抗体的效率无明显差别，但泛素的融合使得针对EBNA1的特异性CTL反应明显增强。构建了表达EBNA1羧基端190个氨基酸的原核表达质粒pET30a-SS580，转化大肠杆菌BL21（DE3）后，诱导表达了Mr 2.5104左右的融合蛋白（25-kDa EBNA1），免疫印迹显示，该蛋白能被鼻咽癌（NPC）病人血清特异性识别。镍离子
18、亲和柱纯化的25-kDa EBNA1免疫Balb/C小鼠后，制备了鼠抗25-kDa EBNA1血清，该血清能够识别HeLa细胞中瞬时表达的全长EBNA1蛋白。59致致 谢谢感谢我的导师桑建利教授和谷淑燕教授！感谢我的导师桑建利教授和谷淑燕教授！感谢齐建国博士的具体指导！感谢齐建国博士的具体指导！感谢细胞所和病毒病所的老师、同学！感谢细胞所和病毒病所的老师、同学！感谢家人的理解和支持！感谢家人的理解和支持！61展展 望望62讨讨 论（论（1 1）63讨讨 论（论（2 2）64A图.不同浓度IPTG诱导表达的SDS-PAGE分析 B图.相同浓度IPTG（0.4mmol/L）诱导不同时间表达的SDS
19、-PAGE分析A1,B1为未诱导对照 A10,B10 为蛋白质分子量标准A29泳道IPTG浓度分别为0.05,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mmol/LB29泳道诱导时间分别为1,2,3,4,5,6,7,8 h图 重组质粒pET30a-SS580在BL21(DE3)中表达的SDS-PAGE分析kDa97.466.243.031.020.11 2 3 4 5 6 7 8 9 10kDa97.466.243.031.020.11 2 3 4 5 6 7 8 9 10BA661.诱导后的表达 2.菌体破碎后上清 3.穿柱液 4.50mM咪唑洗脱5.100mM咪唑洗脱 6.1
20、50mM咪唑洗脱 7.200mM咪唑洗脱 8.300mM咪唑洗脱 9.移除Ni离子 10.蛋白质分子量标准图图 菌体破碎后上清纯化的菌体破碎后上清纯化的SDS-PAGESDS-PAGE分析分析kDa97.466.243.031.020.114.41 2 3 4 5 6 7 8 9 10671.未诱导对照 2.诱导后的表达 3.菌体破碎后沉淀 4.2M尿素溶解5.4M尿素溶解 6.6M尿素溶解 7.8M尿素溶解 8.未溶解沉淀 9.蛋白质分子量标准图图 重组蛋白包涵体溶解的重组蛋白包涵体溶解的SDS-PAGE分析分析kDa97.466.243.031.01 2 3 4 5 6 7 8 9 20.
21、168kDa97.466.243.031.01 2 3 4 5 6 20.114.469707172Epstein-Barr virus(EBV),which may have co-evolved with Homo sapiens over millions of years,thus achieving a balance between viral persistence and immune control.Epstein和和Barr等于等于1964年首先在非洲年首先在非洲Burkitt淋巴瘤淋巴瘤（Burkitts lymphoma,BL）培养细胞中发现）培养细胞中发现 人类是人类是EBV唯一的天然宿主唯一的天然宿主 73747576
