液体活检技术及其在肿瘤无创诊断和个体化用药中的应用研究课件.pptx

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1、肿肿瘤细胞瘤细胞与肿瘤与肿瘤DNADNA会进会进入到血液入到血液循环系统循环系统中,反映中,反映肿瘤的特肿瘤的特征。征。液体活检的基础液体活检的基础循循环肿瘤细胞环肿瘤细胞(CTCCTC)与循环肿瘤)与循环肿瘤DNADNA(ctDNActDNA)Nat Rev Clin Oncol,2013,10(8):472-4845液体活检比液体活检比影像学影像学更能反应肿瘤分子特征更能反应肿瘤分子特征2014,20:548肿瘤大小ctDNA优于影像学结果ctDNA含量肿瘤大小ctDNA含量肿瘤大小ctDNA含量2013,368:1199液体活检比液体活检比血清学血清学指标具有更高的敏感性指标具有更高的敏

2、感性ctDNACA 15-3CTCctDNACA 15-3CTC液体活检是精准治疗的重要途径之一液体活检是精准治疗的重要途径之一2013,497:103监测疗效监测疗效监测监测进展进展评估预后评估预后2013,368:11992013,341:61518液体活检液体活检实时动态监测肿瘤实时动态监测肿瘤循环肿瘤细胞(CTC)循环肿瘤DNA(ctDNA)肿瘤“未来200年的听诊器”组织活检组织活检液体活检液体活检检测组织检测血液单一时间点检测实时动态监测 外周血中的CTC与肿瘤具有极高的一致性,可以提供肿瘤进展和治疗效果的临床数据。可以反复取样、几乎无创,对治疗干预特别重要。对分离得到的CTCs可

3、以用于下游的进一步分子分析。最大的问题是如何捕获单个CTC细胞?如何分析仅有单个细胞的基因组?Annu.Rev.Med.2012.63:199215Hepatology,2013,57(4):1458-1468Annu.Rev.Med.2012.63:199215利用肿瘤组织筛选标志物(肿瘤特异性的基因突变)提取血浆游离DNA 根据标志物检测ctDNA肿肿瘤瘤复复发发的的早早期期诊诊断断肿肿瘤瘤耐耐药药的的实实时时监监测测利用利用ctDNActDNA对肺癌患者对肺癌患者进行病程监测进行病程监测Nature Medicine,2014,20:548利用利用ctDNActDNA对肺癌患者进行病程监

4、测对肺癌患者进行病程监测Nature Medicine,2014,20:548目前液体活检技术存在的问题目前液体活检技术存在的问题1.从从组织中筛组织中筛选的选的ctDNA检测靶检测靶标标因肿瘤变化而因肿瘤变化而失效失效2.临床临床缺乏高灵敏、高特异、低成本缺乏高灵敏、高特异、低成本的的ctDNA检测方法检测方法3.无法无法同同时测定时测定单个单个CTC的基因组与转录组的基因组与转录组原发灶基因突变1转移灶基因突变2仪器150万试剂1万元/次高通量测序数字化PCR仪器120万试剂500元/次全血样本全血样本CTC捕获分离捕获分离突变靶标筛选突变靶标筛选ctDNA检测检测针对问题1:靶标失效,无

5、法反复多次 获取组织解决方案:以CTC代替组织筛选靶标 CTC能态反映肿瘤变化 可以反复多次获取CTC研究内容研究内容1:从:从CTC中筛选检中筛选检测测靶标的方法靶标的方法2022-8-4相关基相关基础础:初步建:初步建立了立了CTC捕获与鉴定方法捕获与鉴定方法CTCCTC磁性纳米粒捕获磁性纳米粒捕获CTC免疫荧光染色鉴免疫荧光染色鉴定定CTC灵敏度:灵敏度:1.5mL血中血中2-5个个CTC研究内研究内容容2:高灵敏、高特:高灵敏、高特异和低成本的异和低成本的ctDNA检测新方法检测新方法 针对问题2:现有方法灵敏度低、特异性差、成本高 解决方案:建立PNA钳制核酸侵入qPCR新方法,可准

6、确检测低至0.01%ctDNA常规荧光定量PCR仪50万,试剂50元/次相关基础:建立了基于信号扩增的基因突变相关基础:建立了基于信号扩增的基因突变检测方检测方法法信号放大:无交叉污染低成本:采用通用的检测探针低成本:采用通用的检测探针高特异性:单碱基区分高特异性:单碱基区分高灵敏度:0.1-1%体细胞突变实现了信号扩增检测体细胞突变实现了信号扩增检测体细胞突变Angew Chem Int Ed 2011;50(32):7395-8.IF=13.45 Biosens Bioelectron 2015;66:50-4.IF=6.45Chem Commun 2014;50(89):13722-4.

7、IF=6.72建立了高灵敏的基因突变建立了高灵敏的基因突变可视化检测方法可视化检测方法 可对0.1%的基因突变进行可视化检测 灵敏度为2.5 aMIF=45.67该方法获得了同行的高度评价该方法获得了同行的高度评价作为高灵敏核酸信号扩增检测方法的代表,对方法的原理进行了详细的描述。IF=11.44IF=6.72IF=5.82被JACS等化学权威刊物引用50余次。研究内研究内容容3:单个单个CTC中基中基因因组与转录组组与转录组同时测定同时测定的新的新方法方法针对问题3:单个CTC无法同时测定基因组与转录组解决方案:建立固相cDNA文库制备新方法,可同时分析单细胞基因组与转录组相关基础:初步建相

8、关基础:初步建立立了单了单细细胞分离与固相胞分离与固相反转录反转录cDNA文库构建方法文库构建方法手工吸取单细胞Beads反转录构建cDNA文库细胞细胞毛细管毛细管高通量测序分析基因表达谱1.E+001.E+011.E+021.E+031.E+041.E+051.E+061.E+071.E+08EEF1GB2MSDHATBPCopiesRT2nd1stPCRqPCR初步验证了单细胞cDNA文库构建成功。建立建立了了“液体活检液体活检”平台平台高通量测序仪及相关相关生物信息处理技术生物信息处理技术。CTC捕获仪,并建立了单细胞分单细胞分析技术。析技术。应用:乳腺癌应用:乳腺癌 肺癌肺癌35基于粪便中脱落细胞和基于粪便中脱落细胞和DNA检检测的大肠癌早期无创筛查新测的大肠癌早期无创筛查新方法及方法及其其临床临床应用评价应用评价基于羊水中胎儿脱落细胞和母基于羊水中胎儿脱落细胞和母血中胎儿游离血中胎儿游离DNADNA的无创产前诊断的无创产前诊断“液体活检液体活检”的拓展的拓展

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