1、概述n实质：高效液相色谱仪n填料：强酸型阳离子交换树脂n检测器：可见或荧光分光光度计选择性好、准确度高分析速度快，灵敏度高概述n20世纪40年代，开始探求色谱法分析氨基酸；n提高洗脱流速、改良柱直径、填料粒度，提高分析速度；n20世纪80年代，键合反相分配色谱、柱前衍生技术的发展；n目前，配合微机控制程序和处理数据，成为氨基酸最准确可靠的分离测试方法。概述n本章主要内容1、传统离子交换色谱专用氨基酸分析仪2、柱前衍生反相高效液相色谱的氨基酸分析第一节 基本原理n先将氨基酸混合物在离子交换树脂柱上进行分离，然后按照分离后的氨基酸衍生。根据衍生产物的特性，选择适当的检测器检测并进行定性与定量分析。
2、1.1 离子交换树脂1.填料：磺酸型强酸阳离子交换树脂2.苯乙烯为主体；3.离子交换的活性基团：磺酸根（连接在苯乙烯中乙烯基的对位上）；4.与二乙烯基苯交联，形成不溶的高分子骨架，易吸水溶解。5.交联剂所占比例决定网状结构的孔径大小（氨基酸：8%12%的交联度）。6.Na+型（蛋白质水解液中的氨基酸分析），Li+型（全部氨基酸的分析）7、考虑磺化程度、交联剂纯度和类型、粒度大小（510um）。1.2 氨基酸在色谱柱中的分离XO3-Na+H3N+CHRCOOHXSO3-H3N+CHRCOOH +Na+PH减小PH增大PH小于氨基酸的等电点时，氨基酸带正电荷，可被磺酸基团吸引，随着PH升高或离子强
3、度增大，氨基酸所带正电荷减少，吸引力下降乃至消失而被洗脱下来。1、不同的氨基酸，其等电点、极性及相对分子质量大小不同，其洗脱顺序不同；2、一般先后顺序：酸性和带羟基的氨基酸（最早）中性氨基酸（其次）碱性氨基酸（最后）3、同类氨基酸中，短链氨基酸先被洗脱；4、碳数相同的氨基酸，有支链的比无支链的先洗脱出来。1.2 氨基酸在色谱柱中的分离n氨基酸的分离影响因素：离子交换树脂的型号、粒度、交联度；柱长、直径、柱温；洗脱液的阳离子类型、PH值、离子强度、洗脱梯度、流速及其中有机溶剂含量。1.2 氨基酸在色谱柱中的分离1、3 衍生及检测n多数氨基酸无生色基团，在紫外可见光区无吸收（Phe、Trp、Lyr
4、例外），需要将它们衍生，成为具有紫外、可见光吸收或能产生荧光的物质才可以检测。衍生方式：衍生方式：1、柱前衍生法：、柱前衍生法：将将AA混合物先衍生后，在用反相混合物先衍生后，在用反相 分配分配色谱法分离，测定其紫外吸收或产生的色谱法分离，测定其紫外吸收或产生的荧光强度。荧光强度。1、3 衍生及检测2、柱后衍生法：、柱后衍生法：将将AA混合物用离子交换色谱法分离，在混合物用离子交换色谱法分离，在把分离后的氨基酸衍生为具有可见吸收把分离后的氨基酸衍生为具有可见吸收或产生荧光的物质，然后测定。或产生荧光的物质，然后测定。n常用的衍生方法：1、3 衍生及检测（1）茚三酮法）茚三酮法多数氨基酸与水合茚
5、三酮在弱酸条件下共多数氨基酸与水合茚三酮在弱酸条件下共热，引起热，引起AA的氧化脱氨、脱羧反应，水的氧化脱氨、脱羧反应，水合茚三酮与氨合还原茚三酮反应，生成紫合茚三酮与氨合还原茚三酮反应，生成紫色色DYDA，最大吸收，最大吸收570nm（脯氨酸与羟（脯氨酸与羟脯氨酸例外，生成黄色化合物，最大吸收脯氨酸例外，生成黄色化合物，最大吸收440nm）。）。最后根据吸光度与峰面积的关系定性定量最后根据吸光度与峰面积的关系定性定量分析。分析。1、3 衍生及检测第二节 氨基酸分析仪的结构性能 见图38-7（p181）洗脱装置色谱柱（控温）混合室反应器检测器工作站衍生液第二节 氨基酸分析仪的结构性能（1）输液
6、系统）输液系统组成：组成：泵、切换阀或梯度洗脱装置；泵、切换阀或梯度洗脱装置；作用：作用：输送缓冲液、衍生试剂、输送缓冲液、衍生试剂、再生液；再生液；要求：要求：流量恒定、流速稳定、较高的输出流量恒定、流速稳定、较高的输出压、输出流量范围大。压、输出流量范围大。第二节 氨基酸分析仪的结构性能（2）进样分离系统）进样分离系统组成：进样器、色谱柱组成：进样器、色谱柱AA最佳分离温度：最佳分离温度：3070度，度，需恒温，一般柱温升高，出峰时需恒温，一般柱温升高，出峰时间缩短。间缩短。（3）检测系统）检测系统第二节 氨基酸分析仪的结构性能取决于取决于AA衍生的方式衍生的方式:茚三酮法，柱后衍生。茚三
7、酮与分离后的茚三酮法，柱后衍生。茚三酮与分离后的AA混合并在混合并在100左右的水浴中反应左右的水浴中反应15min，最后由紫外检测仪检测。最后由紫外检测仪检测。OPA法，分离柱流出液与法，分离柱流出液与NaClO混合，再混合，再与与OPA混合，生成荧光衍生物，采用荧光混合，生成荧光衍生物，采用荧光光度计分析测定。光度计分析测定。第二节 氨基酸分析仪的结构性能常见的仪器的主要性能：见表38-4（p183）第三节 试样的前处理方法3、1 上机分析试样液的要求试液澄清透明无可见杂质，放置或离心不产生试液澄清透明无可见杂质，放置或离心不产生沉淀；沉淀；试液无色或略带浅黄色，否则需脱色处理（活试液无色
8、或略带浅黄色，否则需脱色处理（活性炭对芳香族性炭对芳香族AA有吸附，导致检测结果偏有吸附，导致检测结果偏低）；低）；含盐量要低；含盐量要低；无蛋白质或肽类物质（水解充分）；无蛋白质或肽类物质（水解充分）；以以PH2。2为宜；为宜；AA浓度以浓度以0。144mg/mL（110ng/50ul）为）为宜。宜。第三节 试样的前处理方法（1）酸水解）酸水解盐酸水解法盐酸水解法 被破坏的：被破坏的：Met、Trp；不易水解：不易水解：Ile、Leu、Val。过甲酸氧化法过甲酸氧化法（2）碱水解法第三节 试样的前处理方法（3）血清与生理体液样品的处理）血清与生理体液样品的处理方法方法血清样品：加入磺基水杨酸钠，混匀，血清样品：加入磺基水杨酸钠，混匀，超高速离心，取上清夜。超高速离心，取上清夜。生理体液样品：除去蛋白质、脱盐、脱生理体液样品：除去蛋白质、脱盐、脱色。色。
