1、北科大微生物培养基的配制及灭菌 肉膏蛋白胨培养基肉膏蛋白胨培养基是一种广泛用于培养是一种广泛用于培养细菌细菌的的培养基，培养基，属于天然培养基属于天然培养基（complex media,undefined media）。其主要成分是牛肉膏、蛋）。其主要成分是牛肉膏、蛋白胨和白胨和NaCl。它们分别提供微生物生长繁殖所。它们分别提供微生物生长繁殖所需要的碳源、氮源、能源、生长因子和无机盐需要的碳源、氮源、能源、生长因子和无机盐等。等。配天然培养基时可配天然培养基时可以以用自来水，但自来水中常用自来水，但自来水中常含含Ca2，Mg2离子，可与其他成分形成沉淀离子，可与其他成分形成沉淀。肉膏蛋白胨培
2、养基肉膏蛋白胨培养基 高氏合成一号培养基高氏合成一号培养基是一种用于培养是一种用于培养放线放线菌菌的的合成培养基合成培养基(defined media)。培养基。培养基中的可溶性淀粉作为碳源和能源，中的可溶性淀粉作为碳源和能源，KNO3作为氮源，作为氮源，K2HPO4、MgSO4和和FeSO4作作为无机盐（为无机盐（高价阳离子盐需单独灭菌后临高价阳离子盐需单独灭菌后临用前与含磷酸盐的培养基混匀用前与含磷酸盐的培养基混匀）。）。合成培养基必须用蒸馏水合成培养基必须用蒸馏水高氏合成一号培养基高氏合成一号培养基 豆芽汁葡萄糖培养基豆芽汁葡萄糖培养基是培养是培养酵母菌酵母菌及及霉霉菌菌的一种优良培养基
3、，为的一种优良培养基，为半合成培养基半合成培养基(semi-defined media)。培养基配方出现。培养基配方出现的自然的自然pH系指培养基不经酸、碱调节而系指培养基不经酸、碱调节而自然呈现的自然呈现的pH。豆芽汁葡萄糖培养基豆芽汁葡萄糖培养基 马丁培养基马丁培养基是选择培养基，属于是选择培养基，属于半合成培养基半合成培养基，常用于从自然环境中分离，常用于从自然环境中分离真菌真菌，其中的其中的孟孟加加拉红拉红能抑制细菌和放线菌的生长，而对于真菌能抑制细菌和放线菌的生长，而对于真菌的生长则没有影响，的生长则没有影响，另外，在使用前，向另外，在使用前，向培养基中培养基中加入加入去氧胆酸钠去氧
4、胆酸钠和链霉素和链霉素(30u/ml)。去氧胆酸钠为表面活性剂，去氧胆酸钠为表面活性剂，防止霉菌菌丝蔓延，还可抑制防止霉菌菌丝蔓延，还可抑制G+细菌生长细菌生长；链链霉素对多数霉素对多数G 细菌具抑制生长作用。从而达到细菌具抑制生长作用。从而达到分离真菌的目的。分离真菌的目的。马丁培养基马丁培养基产葡萄糖氧化酶菌株的筛选培养基产葡萄糖氧化酶菌株的筛选培养基 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，E.C.1.1.3.4，简称，简称GOD）O2+C6H12O6+H2O C6H12O7+H2O2 GOD葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶在生化检测在生化检测（葡萄糖）
5、、（葡萄糖）、面粉处理（过面粉处理（过氧化氢对半胱氧化氢对半胱氨酸的作用形氨酸的作用形成二硫键）、成二硫键）、食品保鲜（去食品保鲜（去除氧气）等领除氧气）等领域具有广泛应域具有广泛应用用。培养基培养基葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 平板筛选培养基平板筛选培养基(gL-1)：葡萄糖葡萄糖80，蛋白胨，蛋白胨3，(NH4)2HPO4 0.39，KH2PO4 0.19，MgSO47H2O 0.16，CaCO3 3.5，可溶性淀粉可溶性淀粉10，KI 1.7，脱氧胆酸钠脱氧胆酸钠0.2，琼，琼脂脂20，硫酸链霉素硫酸链霉素25000U。葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶产葡萄糖氧化酶的微生物大多为霉菌。产葡萄糖氧化酶
6、的微生物大多为霉菌。加入脱氧胆酸钠是为了抑制菌丝的形加入脱氧胆酸钠是为了抑制菌丝的形成以获得不互相粘连的霉菌菌落。加成以获得不互相粘连的霉菌菌落。加入硫酸链霉素是为了抑制细菌的生长。入硫酸链霉素是为了抑制细菌的生长。葡萄糖氧化酶催化葡萄糖会生成葡萄葡萄糖氧化酶催化葡萄糖会生成葡萄糖酸，糖酸，pH下降，可以通过下降，可以通过CaCO3控控制培养基的制培养基的pH，并形成透明圈。葡萄，并形成透明圈。葡萄糖氧化酶催化葡萄糖会生成过氧化氢，糖氧化酶催化葡萄糖会生成过氧化氢，可以氧化可以氧化KI生成生成I，使淀粉变色，从菌，使淀粉变色，从菌落周围是否出现特异的淀粉蓝色圈可落周围是否出现特异的淀粉蓝色圈可
7、以判断出该菌是否产酶。以判断出该菌是否产酶。培养方法培养方法葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 土壤霉菌分离：取土壤样品土壤霉菌分离：取土壤样品5g，加入，加入95mL的无菌水中的无菌水中，200rmin-1摇床振荡摇床振荡 1h。平板筛选培养：采用平板筛选培养：采用Fiedure.K.J显色法。将富集培养显色法。将富集培养后的土壤悬液，按不同稀释度（后的土壤悬液，按不同稀释度（10-2、10-3、10-4）接种）接种于平板筛选培养基，于平板筛选培养基，28培养培养3d。斜面培养：挑取平板培养基中蓝色圈较大的菌株接种至斜面斜面培养：挑取平板培养基中蓝色圈较大的菌株接种至斜面培养基，培养基，28恒温，培养
8、恒温，培养4d后置于后置于4冰箱保存备用。冰箱保存备用。摇床培养：接种斜面保存的菌种于发酵培养基，摇床培养：接种斜面保存的菌种于发酵培养基，250mL摇瓶摇瓶50mL装液量，装液量，28恒温，恒温，200rmin-1旋转摇床，培养旋转摇床，培养2d。葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶实验材料实验材料 药品：牛肉膏、蛋白胨、药品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、马铃薯、蔗糖、马铃薯、蔗糖、KNO3、K2HPO4、MgSO47H2O、FeSO47H2O、可溶性淀粉、可溶性淀粉、葡葡萄糖，萄糖，(NH4)2HPO4、KH2PO4、CaCO3、KI、脱氧胆酸、脱氧胆酸钠、硫酸链霉素、钠、硫酸链霉素、(NH4)2SO4
9、、K2HPO4、KCl、琼脂等各琼脂等各种培养基的组成成分、种培养基的组成成分、0.1孟加拉红溶液，孟加拉红溶液，l mol/L HCl、l mol/L NaOH。高压蒸汽灭菌器、电热恒温干燥箱、紫外线杀菌灯高压蒸汽灭菌器、电热恒温干燥箱、紫外线杀菌灯、电炉、电炉、天平天平 其它：其它：酒精灯酒精灯、试管、试管、称量纸、牛角匙、烧杯、量筒、玻、称量纸、牛角匙、烧杯、量筒、玻棒、棒、pH试纸、玻璃珠试纸、玻璃珠、三角瓶三角瓶、封口膜、封口膜、无棉塞的空试管、无棉塞的空试管、培养皿、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、记号笔、培养皿、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、记号笔、标签等。标签等。准备无菌水，
10、去离子水装于准备无菌水，去离子水装于250ml三角瓶中，每瓶三角瓶中，每瓶95ml，放置放置3-5颗玻璃珠，颗玻璃珠，121灭菌灭菌30min。（6）高压蒸汽灭菌121灭菌20min。5，可溶性淀粉10，KI 1.其它：酒精灯、试管、称量纸、牛角匙、烧杯、量筒、玻棒、pH试纸、玻璃珠、三角瓶、封口膜、无棉塞的空试管、培养皿、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、记号笔、标签等。每2人准备：带棉塞空试管5个、培养皿10-12个、相应的固体培养基100ml平板筛选培养：采用Fiedure.产葡萄糖氧化酶的微生物大多为霉菌。（6）高压蒸汽灭菌121灭菌20min。（4）将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积
11、。药品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、马铃薯、蔗糖、KNO3、K2HPO4、MgSO47H2O、FeSO47H2O、可溶性淀粉、葡萄糖，(NH4)2HPO4、KH2PO4、CaCO3、KI、脱氧胆酸钠、硫酸链霉素、(NH4)2SO4、K2HPO4、KCl、琼脂等各种培养基的组成成分、0.压力表的指针上升时，锅内温度也逐渐升高，当压力表指针升至15磅（0.配天然培养基时可以用自来水，但自来水中常含Ca2，Mg2离子，可与其他成分形成沉淀。土壤霉菌分离：取土壤样品5g，加入95mL的无菌水中，200rmin-1摇床振荡 1h。抗生素等不耐热物质需要进行过滤除菌。实验内容（玻璃器皿的洗涤和包装）葡萄糖8
12、0，蛋白胨3，(NH4)2HPO4 0.肉膏蛋白胨培养基是一种广泛用于培养细菌的培养基，属于天然培养基（complex media,undefined media）。抗生素等不耐热物质需要进行过滤除菌。实验内容实验内容（玻璃器皿的洗涤和包装）（玻璃器皿的洗涤和包装）1玻璃器皿的洗涤玻璃器皿的洗涤2灭菌前玻璃器皿的包装灭菌前玻璃器皿的包装(1)培养皿的包装培养皿的包装(2)三角瓶的包装三角瓶的包装 过滤除菌过滤除菌 抗生素等不耐热物质需要进行过滤除菌。抗生素等不耐热物质需要进行过滤除菌。滤器和容器等一般需要进行高温灭菌。滤器和容器等一般需要进行高温灭菌。实验内容实验内容（液体及固体培养基的配制过
13、程）（液体及固体培养基的配制过程）称量：按照配方正确称取各种原料（除琼脂外）放于有称量：按照配方正确称取各种原料（除琼脂外）放于有刻度的烧杯中。刻度的烧杯中。溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅拌，加热溶解。溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅拌，加热溶解。定容：定容：倒入一量筒中，补水至所需体积倒入一量筒中，补水至所需体积。调调pH值：滴加值：滴加1mol/L NaOH或或1mol/L HCl调至所需调至所需pH，用，用pH试纸对照试纸对照。液体培养基配制完成！液体培养基配制完成！加琼脂混匀：趁热加入加琼脂混匀：趁热加入1.5的琼脂搅匀。的琼脂搅匀。固体培固体培养基配制完成！养基配制完成！如果培
14、养基中某种药品用量太少，如果培养基中某种药品用量太少，可以将其配制成较浓的溶液，然后可以将其配制成较浓的溶液，然后按比例吸取一定体积溶液，加入至按比例吸取一定体积溶液，加入至培养基中。培养基中。固体培养基的配制：可以在配制好固体培养基的配制：可以在配制好的液体培养基中加入适量的琼脂粉，的液体培养基中加入适量的琼脂粉，灭菌。未冷却前取出，摇匀。灭菌。未冷却前取出，摇匀。肉膏蛋白胨培养基的配制肉膏蛋白胨培养基的配制1培养基成分：培养基成分：牛肉膏牛肉膏0.5g，蛋白胨，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂，琼脂 1.52g，水，水100ml。pH 7.52配制方法：配制方法：（1）分别称取蛋白胨
15、和）分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于烧杯中，加入所需的所需量，置于烧杯中，加入所需水量的水量的2/3左右的蒸馏水。用玻棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中左右的蒸馏水。用玻棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中溶解，（也可将，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中溶解，（也可将小烧杯置于石棉网上适度加热溶解），倒入上述烧杯中，用玻小烧杯置于石棉网上适度加热溶解），倒入上述烧杯中，用玻棒搅拌使药品全部溶解。棒搅拌使药品全部溶解。（2）加入所需量的琼脂（液体培养基省略此步骤）加入所需量的琼脂（液体培养基省略此步骤）（3）用）用1mol/L NaOH溶液调溶液调pH至至7
16、.5。（4）将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。）将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。（5）分装、加塞、包扎。）分装、加塞、包扎。（6）高压蒸汽灭菌）高压蒸汽灭菌121灭菌灭菌20min。高氏合成一号培养基的配制高氏合成一号培养基的配制1培养基成分培养基成分可溶性淀粉可溶性淀粉2g，KNO3 0.1g，K2HPO43H2O 0.05g，MgSO47H2O 0.05g，NaCl 0.05g，FeSO47H2O 0.001g，琼脂，琼脂 1.52g，水，水 100ml，pH 7.52配制方法配制方法（1）称量及溶化）称量及溶化 量取所需水量的量取所需水量的2/3左右加入到烧杯中，置于石棉左右加
17、入到烧杯中，置于石棉网上加热至沸。称量可溶性淀粉，置于另一小烧杯中，加入少量网上加热至沸。称量可溶性淀粉，置于另一小烧杯中，加入少量冷水，将淀粉调成糊状，然后倒入上述装沸水的烧杯中，继续加冷水，将淀粉调成糊状，然后倒入上述装沸水的烧杯中，继续加热，使淀粉完全融化。分别称量热，使淀粉完全融化。分别称量KNO3、NaCl、K2HPO4和依次和依次逐一加入水中溶解。（培养基使用前每逐一加入水中溶解。（培养基使用前每100ml培养基加入灭菌的培养基加入灭菌的1ml 5MgSO4，1ml 0.1FeSO4溶液。）溶液。）（2）加入所需量的琼脂（液体培养基省略此步骤）加入所需量的琼脂（液体培养基省略此步骤
18、）（3）用）用1mol/L NaOH溶液调溶液调pH至至7.5。（4）将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。）将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。（5）分装、加塞、包扎。）分装、加塞、包扎。（6）高压蒸汽灭菌）高压蒸汽灭菌121灭菌灭菌20min。豆芽汁葡萄糖培养基的配制豆芽汁葡萄糖培养基的配制1 1培养基成分培养基成分黄豆芽黄豆芽 10g 10g葡萄糖葡萄糖 5g 5g琼脂琼脂 1.5 1.52g2g水水 100ml 100ml自然自然pHpH2 2配制方法配制方法（1 1）称新鲜黄豆芽）称新鲜黄豆芽10g10g，置于烧杯中，再加入，置于烧杯中，再加入100ml100ml水，水，小火煮沸小
19、火煮沸30min30min，用纱布过滤，补足失水，即制成，用纱布过滤，补足失水，即制成1010豆豆芽汁。芽汁。（2 2）配制时，按每）配制时，按每100ml100ml的的1010豆芽汁加入豆芽汁加入5g5g葡萄糖，葡萄糖，煮沸后加入琼脂（液体培养基省略此步骤）煮沸后加入琼脂（液体培养基省略此步骤），补足失水，补足失水。（3 3）分装、加塞、包扎。）分装、加塞、包扎。（4 4）高压蒸汽灭菌）高压蒸汽灭菌110 110 灭菌灭菌20min20min。马丁培养基的配制马丁培养基的配制1培养基成分培养基成分 葡萄糖葡萄糖 1g，蛋白胨，蛋白胨 0.5g，KH2PO43H2O 0.1g，MgSO47H2
20、O 0.05g，0.1孟加拉红溶液孟加拉红溶液 0.33ml，琼脂，琼脂 1.52g，水，水 100ml，自然自然pH。2去氧胆酸钠溶液去氧胆酸钠溶液 2ml（预先灭菌，临用前加入）链（预先灭菌，临用前加入）链霉素溶液（霉素溶液（10,000 u/ml）0.33ml（临用前加入）（临用前加入）2配制方法配制方法（1）称量）称量 称取培养基各成分的所需量。称取培养基各成分的所需量。（2）溶化）溶化 在烧杯中加入约在烧杯中加入约2/3所需水量，然后依次逐一溶化培养所需水量，然后依次逐一溶化培养基各成分。基各成分。按每按每100ml培养基加入培养基加入0.33ml的的0.1孟加拉红溶液孟加拉红溶液。
21、（3）加入所需琼脂（液体培养基省略此步骤）加入所需琼脂（液体培养基省略此步骤），补足水至所需，补足水至所需体积。体积。（4）分装、加塞、包扎。）分装、加塞、包扎。（5）高压蒸汽灭菌）高压蒸汽灭菌110 灭菌灭菌20min。（6）临用前，加热融化培养基，候冷至）临用前，加热融化培养基，候冷至60左右，按每左右，按每100ml培养基无菌操作加入培养基无菌操作加入2ml的的2去氧胆酸钠溶液及去氧胆酸钠溶液及0.33ml的链霉素的链霉素溶液（溶液（10 000 u/ml），迅速混匀。），迅速混匀。实验内容实验内容 （棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎）（棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎）棉塞的制作。棉塞的制
22、作。试管包扎。试管包扎。锥形瓶用封口膜包扎。锥形瓶用封口膜包扎。培养基配方出现的自然pH系指培养基不经酸、碱调节而自然呈现的pH。北科大微生物培养基的配制及灭菌2去氧胆酸钠溶液 2ml（预先灭菌，临用前加入）链霉素溶液（10,000 u/ml）0.19，MgSO47H2O 0.培养基配方出现的自然pH系指培养基不经酸、碱调节而自然呈现的pH。1-2组制备细菌培养基（肉膏蛋白胨培养基）；05g，MgSO47H2O 0.固体培养基配制完成！葡萄糖80，蛋白胨3，(NH4)2HPO4 0.另外，在使用前，向培养基中加入去氧胆酸钠和链霉素(30u/ml)。产葡萄糖氧化酶的微生物大多为霉菌。产葡萄糖氧化
23、酶的微生物大多为霉菌。05g，MgSO47H2O 0.（1）称新鲜黄豆芽10g，置于烧杯中，再加入100ml水，小火煮沸30min，用纱布过滤，补足失水，即制成10豆芽汁。（4）高压蒸汽灭菌110 灭菌20min。最后将高压灭菌器内的剩余水排出。摇床培养：接种斜面保存的菌种于发酵培养基，250mL摇瓶50mL装液量，28恒温，200rmin-1旋转摇床，培养2d。实验内容实验内容（干热灭菌法）（干热灭菌法）将培养皿、吸管等玻璃器皿洗净干燥后，用旧报纸包将培养皿、吸管等玻璃器皿洗净干燥后，用旧报纸包好，或装入特制的铁筒中好，或装入特制的铁筒中(每个吸管用纸包好后装入铁每个吸管用纸包好后装入铁筒筒
24、)。包装吸管时应将吸取的一端放在取时先拆开的一。包装吸管时应将吸取的一端放在取时先拆开的一端，防止取用时手触及吸取端。端，防止取用时手触及吸取端。将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱中，彼此间留有一将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱中，彼此间留有一定的空隙以便流通空气。定的空隙以便流通空气。关紧箱门，打开电源。关紧箱门，打开电源。调节温度调节温度160170，灭菌，灭菌1小时。小时。待自然降温冷却后待自然降温冷却后(60以下以下)才能开门取出玻璃器皿，才能开门取出玻璃器皿，避免由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。避免由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。实验内容实验内容（高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法）高压
25、蒸汽灭菌法是利用高压来提高蒸汽的温度，达到完全灭菌的目的。高压蒸汽灭菌法是利用高压来提高蒸汽的温度，达到完全灭菌的目的。关好排水阀门放入去离子水至超过加热管关好排水阀门放入去离子水至超过加热管23cm为止，注意水量一定要加为止，注意水量一定要加足，否则容易造成事故。足，否则容易造成事故。将要灭菌的培养基、灭菌水等，包装好后放入灭菌锅中，关上器盖，旋紧将要灭菌的培养基、灭菌水等，包装好后放入灭菌锅中，关上器盖，旋紧螺旋时，先将每个螺旋旋转到一定程度螺旋时，先将每个螺旋旋转到一定程度(不要太紧不要太紧)，然后再旋紧相对的两，然后再旋紧相对的两个螺旋，以达到平衡旋紧，否则易造成漏气，达不到彻底灭菌的
26、目的。个螺旋，以达到平衡旋紧，否则易造成漏气，达不到彻底灭菌的目的。通电加温，同时打开排气阀门，排尽锅内的空气，即阀门冲出的全部是蒸通电加温，同时打开排气阀门，排尽锅内的空气，即阀门冲出的全部是蒸气时则表示彻底，此时可关闭排气阀门，如果过早关闭阀门，排气不彻底气时则表示彻底，此时可关闭排气阀门，如果过早关闭阀门，排气不彻底，也达不到彻底灭菌的目的。，也达不到彻底灭菌的目的。压力表的指针上升时，锅内温度也逐渐升高，当压力表指针升至压力表的指针上升时，锅内温度也逐渐升高，当压力表指针升至15磅（磅（0.1MPa）时，蒸气温度相当于）时，蒸气温度相当于120121，此时开始计算灭菌时间，控，此时开始
27、计算灭菌时间，控制热源，使处于制热源，使处于15磅压力保持磅压力保持20-30分钟，即能达到完全灭菌的目的，然后分钟，即能达到完全灭菌的目的，然后停止加温。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降停止加温。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间（低压力，延长时间（0.056MPa(112.6)灭菌灭菌30min）。）。灭菌时间一到，切断电源，待压力自然降至零、锅内蒸气完全排尽时，打灭菌时间一到，切断电源，待压力自然降至零、锅内蒸气完全排尽时，打开锅盖取出培养基，如需制备固体斜面培养基时，则应趁热将试管斜放在开锅盖取出培养基，如需制备固体斜面培养基时
28、，则应趁热将试管斜放在桌上，冷却后便可收起。桌上，冷却后便可收起。1.最后将高压灭菌器内的剩余水排出。最后将高压灭菌器内的剩余水排出。实验实验安排安排分为分为4类：类：1-2组制备组制备细菌细菌培养基（培养基（肉膏蛋白胨培养基肉膏蛋白胨培养基）；(8*100ml)3-5组组制备制备放线菌放线菌培养基（培养基（高氏合成高氏合成1号培养基号培养基）；(8*100ml)6-8组组制备葡萄糖氧化酶菌株筛选培养基；制备葡萄糖氧化酶菌株筛选培养基；(8*100ml)制备制备酵母菌酵母菌培养基（培养基（豆芽汁葡萄糖培养基豆芽汁葡萄糖培养基）；做霉菌做霉菌培养基（培养基（马丁培养基马丁培养基）每个类别制备每个类别制备1瓶瓶含含10颗颗玻璃珠玻璃珠的的99ml灭菌水（霉菌为灭菌水（霉菌为95ml）每每2人人准备：带棉塞空准备：带棉塞空试管试管5个个、培养皿培养皿10-12个个、相应的固体、相应的固体培养基培养基100ml 另需单独制备另需单独制备4*100ml的灭菌水供全体使用（用于菌液稀释）的灭菌水供全体使用（用于菌液稀释）准备准备1ml 和和200ul 枪头各枪头各4盒供全体使用。盒供全体使用。谢谢观看谢谢观看
