1、第一节第一节 超临界流体色谱法超临界流体色谱法 以以超临界流体超临界流体作为流动相的一种色谱方法。所谓超临界作为流动相的一种色谱方法。所谓超临界流体，流体，是指既不是气体也不是液体的一些物质，它们的物理性是指既不是气体也不是液体的一些物质，它们的物理性质介于气体和液体之间质介于气体和液体之间。超临界流体色谱技术是超临界流体色谱技术是20世纪世纪80年代发展起来的一种崭新年代发展起来的一种崭新的色谱技术。由于它具有气相和液相所没有的优点，并能分离的色谱技术。由于它具有气相和液相所没有的优点，并能分离和分析气相和液相色谱不能解决的一些对象，应用广泛，发展和分析气相和液相色谱不能解决的一些对象，应用
2、广泛，发展十分迅速。据十分迅速。据Chester估计，至今约有全部分离的估计，至今约有全部分离的25涉及难涉及难以对付的物质，通过超临界流体色谱能取得较为满意的结果。以对付的物质，通过超临界流体色谱能取得较为满意的结果。1.超临界流体的特性超临界流体的特性 (1)物质的临界点物质的临界点 某些纯物质具有三相点和临界点。纯物质在三相点下，某些纯物质具有三相点和临界点。纯物质在三相点下，气、液、固三态处于平衡状态。而在物质的超临界温度下，气、液、固三态处于平衡状态。而在物质的超临界温度下，其气相和液相具有相同的密度。当处于临界温度以上，则其气相和液相具有相同的密度。当处于临界温度以上，则不管施加多
3、大压力，气体也不会液化。不管施加多大压力，气体也不会液化。在临界温度和临界在临界温度和临界压力以上，物质是以超临界流体状态存在。即在超临界状压力以上，物质是以超临界流体状态存在。即在超临界状态下，随温度、压力的升降，流体的密度会变化。此时的态下，随温度、压力的升降，流体的密度会变化。此时的物质既不是气体也不是液体，却始终保持为流体物质既不是气体也不是液体，却始终保持为流体。临界温。临界温度通常高于物质的沸点和三相点。度通常高于物质的沸点和三相点。（2）超临界流体的特性）超临界流体的特性 超临界流体具有对于分离极其有利的物理性质。超临界流体具有对于分离极其有利的物理性质。它们的这些性质恰好介于气
4、体和液体之间。它们的这些性质恰好介于气体和液体之间。超临界流体的超临界流体的扩散系数和粘度接近于气相色谱扩散系数和粘度接近于气相色谱，因此溶质的传质阻力小，可以获得快速高效分离因此溶质的传质阻力小，可以获得快速高效分离。另一方面，另一方面，其密度与液相色谱类似，便于在较低温其密度与液相色谱类似，便于在较低温度下分离和分析热不稳定性、相对分子质量大的物质。度下分离和分析热不稳定性、相对分子质量大的物质。另另外，超临界流体的物理性质和化学性质，如扩散、粘度和外，超临界流体的物理性质和化学性质，如扩散、粘度和溶剂力等，都是密度的函数。溶剂力等，都是密度的函数。因此，只要改变流体的密度，就可以改变流体
5、的性质，因此，只要改变流体的密度，就可以改变流体的性质，从类似气体到类似液体，无需通过气液平衡曲线。超临界从类似气体到类似液体，无需通过气液平衡曲线。超临界流体色谱中的流体色谱中的程序升密度程序升密度相当于气相色谱中程序升温度和相当于气相色谱中程序升温度和液相色谱中的梯度淋洗。液相色谱中的梯度淋洗。2.2.超临界流体色谱仪超临界流体色谱仪 19851985年出现第一台商品型的超临界流体色谱仪。年出现第一台商品型的超临界流体色谱仪。很多部很多部分类似于高效液相色谱仪，但有两点重要差别：分类似于高效液相色谱仪，但有两点重要差别：（l l）具有一根恒温的色谱柱。这点类似气相色谱中的）具有一根恒温的色
6、谱柱。这点类似气相色谱中的色谱柱，目的是为了提供对流动相的精确温度控制。色谱柱，目的是为了提供对流动相的精确温度控制。（2 2）带有一个）带有一个限流器限流器（或称反压装置）。目的用以对（或称反压装置）。目的用以对柱维持一个合适的压力，并且通过它使流体转换为气体后，柱维持一个合适的压力，并且通过它使流体转换为气体后，进入检测器进行测量。实际上，可把限流器看作柱末端延进入检测器进行测量。实际上，可把限流器看作柱末端延伸部分。伸部分。3.3.压力效应压力效应 在在SCFSCF中，压力的变化对容量因子中，压力的变化对容量因子k k产生显产生显著影响，由于以超流体作为流动相，它的密度著影响，由于以超流
7、体作为流动相，它的密度随压力增加而增加，而密度的增加引起流动相随压力增加而增加，而密度的增加引起流动相溶剂效率的提高，同时可缩短淋溶剂效率的提高，同时可缩短淋洗时间。洗时间。例如，采用例如，采用COCO2 2流体作流动相，当压力由流体作流动相，当压力由7.O7.O10106 6PaPa增加到增加到9.09.010106 6PaPa时，对于十六碳烷时，对于十六碳烷烃的淋洗时间可由烃的淋洗时间可由25min25min缩短到缩短到5min5min。在在SFCSFC中，中，通过通过程序升压实现了流体的程序升密，达到改程序升压实现了流体的程序升密，达到改善分离的目的。善分离的目的。4.4.固定相和流动相
8、固定相和流动相 用于用于SFCSFC中的色谱柱可以是填充柱也可以是中的色谱柱可以是填充柱也可以是毛细管柱，目前，毛细管超临界流体色谱（毛细管柱，目前，毛细管超临界流体色谱（CSFCCSFC）由于具有特别高的分离效率，倍受人们的青睐。由于具有特别高的分离效率，倍受人们的青睐。在在SFCSFC中，最广泛使用的流动相是中，最广泛使用的流动相是COCO2 2流体，它无色、流体，它无色、无味、无毒、易获取并且价廉，对各类有机分子都是一无味、无毒、易获取并且价廉，对各类有机分子都是一种极好的溶剂。它在紫外区是透明的；临界温度种极好的溶剂。它在紫外区是透明的；临界温度3131，临界压力临界压力7.297.2
9、910106 6PaPa；在色谱分离中，；在色谱分离中，COCO2 2流体允许对温流体允许对温度、压力有宽的选择范围。有时可在流体中引入度、压力有宽的选择范围。有时可在流体中引入1%1%10%10%甲醇，以改进分离的选择因子甲醇，以改进分离的选择因子值。值。除除COCO2 2流体外，可作流动相的还有乙烷、戊烷、氨、流体外，可作流动相的还有乙烷、戊烷、氨、氧化亚氮、二氯二氟甲烷、二乙基醚和四氢呋喃等。氧化亚氮、二氯二氟甲烷、二乙基醚和四氢呋喃等。5.检测器检测器 在高效液相色谱仪中经常采用的检测器，在高效液相色谱仪中经常采用的检测器，如紫外、荧光、火焰光度等都能在如紫外、荧光、火焰光度等都能在S
10、FC仪中很仪中很好应用。但好应用。但SFC比起比起HPLC还具有一个主要优点还具有一个主要优点是可采用是可采用GC中火焰离子化检测器（中火焰离子化检测器（FID）。）。FID对一般有机物分析具有较高的灵敏度，这也对一般有机物分析具有较高的灵敏度，这也就提高了就提高了SFC对有机物测定的灵敏。对有机物测定的灵敏。6超临界流体色谱法与其他色谱法超临界流体色谱法与其他色谱法比较比较 （l）与高效液相色谱法比较）与高效液相色谱法比较 SFC法的柱效一般比法的柱效一般比HPLC法要高：当平均线速度法要高：当平均线速度为为0.6cmS-1时，时，SFC法的柱效可为法的柱效可为HPLC法的法的3倍左右，倍左
11、右，在最小板高下载气线速度是在最小板高下载气线速度是4倍左右倍左右；由于流体的低粘；由于流体的低粘度使其流动速度比度使其流动速度比HPLC法快，法快，SFC法的分离时间比法的分离时间比HPLC法短。法短。（2 2）与气相色谱法比较）与气相色谱法比较 由于流体的扩散系数与粘度介于气体和液体由于流体的扩散系数与粘度介于气体和液体之间，之间，因此因此SFCSFC的谱带展宽比的谱带展宽比GCGC要小；要小；SFCSFC中流动相的作用类似中流动相的作用类似LCLC中流动相，流体作中流动相，流体作流动相不仅载带溶质移动，而且与溶质会产生相流动相不仅载带溶质移动，而且与溶质会产生相互作用力，参与选择竞争。互
12、作用力，参与选择竞争。如果把溶质分子溶解在超临界流体看作类似如果把溶质分子溶解在超临界流体看作类似于挥发，大分子物质的分压很大，可于挥发，大分子物质的分压很大，可应用比应用比GCGC低低得多的温度，实现对大分子物质、热不稳定性化得多的温度，实现对大分子物质、热不稳定性化合物、高聚物等的有效分离。合物、高聚物等的有效分离。（3）应用范围的比较）应用范围的比较 SFC比起比起GC法测定相对分子质量的范围要法测定相对分子质量的范围要大出好几个数量级，基本与大出好几个数量级，基本与LC法相当。当然，法相当。当然，尺寸排阻色谱法（尺寸排阻色谱法（SEC）所测分子质量范围是所）所测分子质量范围是所有色谱法
13、中最大的。有色谱法中最大的。超临界流体色谱法被广泛应用于天然物、药超临界流体色谱法被广泛应用于天然物、药物、表面活性剂、高聚物、多聚物、农药、炸药物、表面活性剂、高聚物、多聚物、农药、炸药和火箭推进剂等物质的分离和分析。和火箭推进剂等物质的分离和分析。1.1.聚苯醚低聚物的分析聚苯醚低聚物的分析色谱柱：色谱柱：10m10m 63m i.d.63m i.d.毛细管柱，毛细管柱，固定相：固定相：键合二甲基聚硅氧烷；键合二甲基聚硅氧烷；流动相：流动相：COCO2 2 ；柱温：；柱温：120 120 C C；程序升压；程序升压；四种组分仅双键四种组分仅双键数目和位置不同，难数目和位置不同，难分离；分离
14、；色谱柱：色谱柱：DB-225 DB-225 SFCSFC毛细管柱；毛细管柱；流动相：流动相：COCO2 2 ；从；从15MPa15MPa程序升压到程序升压到27MPa27MPa；2.5hr2.5hr完全分完全分离离。第二节第二节 毛细管电泳毛细管电泳 capillary electrophoresiscapillary electrophoresis 一、概述一、概述 早在一百多年以前，较原始的电泳实验，是早在一百多年以前，较原始的电泳实验，是在一个在一个U形一管中进行的，管中盛有溶液，两端置形一管中进行的，管中盛有溶液，两端置有电极，加上几百伏电压后，首次实验了对毒素有电极，加上几百伏电压
15、后，首次实验了对毒素和抗毒素的分离。和抗毒素的分离。1909年，年，L.Michaelis提出提出“电电泳泳”这一术语，用于测定蛋白质的等电点。这一术语，用于测定蛋白质的等电点。1981年，年，Jorgenson 和和 Lukacs 使用使用75m内径的熔融石内径的熔融石英毛细管，电泳分离氨基酸和肽。至此，出现了英毛细管，电泳分离氨基酸和肽。至此，出现了毛细管电泳（毛细管电泳（CE）技术。）技术。毛 细 管 电 泳，又 称 高 效 毛 细 管 电 泳毛 细 管 电 泳，又 称 高 效 毛 细 管 电 泳（H i g h Performance capillary electrophoresis
16、，HPCE）：）：（1 1）在内径（）在内径（1O1O200200）mm的石英毛细管的石英毛细管中进行，在毛细管中的散热较好，沿着管截面的中进行，在毛细管中的散热较好，沿着管截面的温度梯度很小，加在毛细管两端的电压可高达几温度梯度很小，加在毛细管两端的电压可高达几十千伏。十千伏。（2 2）不需要阻流介质，但可使用凝胶作分）不需要阻流介质，但可使用凝胶作分子筛介质。子筛介质。（3）可使用在柱检测法，缩短分析时间，结合计算机处）可使用在柱检测法，缩短分析时间，结合计算机处理数据，可实现自动化操作。理数据，可实现自动化操作。（4）灵敏度高，检测限可达（）灵敏度高，检测限可达（10-131O-15）m
17、ol，使用，使用激光诱导的荧光检测限可达（激光诱导的荧光检测限可达（1O-191O-21）mol。（5）分辨率高，理论塔板数为几十万至几百万米。）分辨率高，理论塔板数为几十万至几百万米。（6）取样量少，有时只需几个纳升（）取样量少，有时只需几个纳升（nL，10-9 L），流），流动相只需几毫升。动相只需几毫升。二、高效毛细管由泳的基本原理二、高效毛细管由泳的基本原理 含离子的溶液在电场中，含离子的溶液在电场中，当有直流电通过溶当有直流电通过溶液时，阴离子向阳极迁极，阳离子向阴极迁移，液时，阴离子向阳极迁极，阳离子向阴极迁移，溶液的导电率取决于离于浓度和其迁移率溶液的导电率取决于离于浓度和其迁移
18、率(又称淌又称淌度，即指溶质在单位时间和单位电场强度下移动度，即指溶质在单位时间和单位电场强度下移动的距离的距离)。离子迁移率以离子迁移率以表示，其大小受溶质的电表示，其大小受溶质的电荷离子大小比例所控制。荷离子大小比例所控制。在电场的影响下，带电荷的质点受到的力在电场的影响下，带电荷的质点受到的力F Fe e等于其净电荷等于其净电荷q q与电场强度与电场强度E E的乘积，的乘积，F Fe e=q=qE E。电场强度电场强度E E以每单位长度所加的电压以每单位长度所加的电压U U来表示，来表示，即即E=U/LE=U/L，其中，其中L L是毛细管长度。是毛细管长度。FeFe对正电荷为正对正电荷为
19、正值，对负电行为负值。电场力促使带电质点向两值，对负电行为负值。电场力促使带电质点向两极移动，质点在移动过程中也受到一种与电场力极移动，质点在移动过程中也受到一种与电场力方向相反的方向相反的阻滞阻滞力力FdFd，阻止其移动，此阻滞力与，阻止其移动，此阻滞力与质点的电泳速度质点的电泳速度成正比。成正比。质点平移动受到质点平移动受到摩擦阻力，摩擦阻力，摩擦阻力正比摩擦阻力正比于溶液的粘度、质点大小和其电泳速度。由于于溶液的粘度、质点大小和其电泳速度。由于存在摩擦阻力，一种带电质点在电场中运动，存在摩擦阻力，一种带电质点在电场中运动，被加速到一有限速度，此速度取决于被加速到一有限速度，此速度取决于F
20、e和和Fd，这一有限速度称为这一有限速度称为电泳速度，电泳速度，ep。对于每一种质点，在电场作用下的迁移均对于每一种质点，在电场作用下的迁移均具有特定的速度。具有特定的速度。HPCE分离，几乎都是在熔融石英毛细管分离，几乎都是在熔融石英毛细管中完成的，熔融石英是一种高度交联中完成的，熔融石英是一种高度交联的的SiO2聚聚合物，具有很好的抗拉强度。石英毛细管表面合物，具有很好的抗拉强度。石英毛细管表面含有许多硅酸基含有许多硅酸基：）：）SiOH，在一定的条件，在一定的条件下可离解。使表面带有负电荷。由于表面带负下可离解。使表面带有负电荷。由于表面带负电，因此，带负电荷的离子被表面排斥，而带电，因
21、此，带负电荷的离子被表面排斥，而带正电均离子则被毛细管壁吸引。正电均离子则被毛细管壁吸引。在毛细管壁的阴离子，与来自主体溶液在毛细管壁的阴离子，与来自主体溶液中的阳离子在石英一溶液界面上形成双电层。中的阳离子在石英一溶液界面上形成双电层。由于静电场的作用，靠近表面的那些抗衡离由于静电场的作用，靠近表面的那些抗衡离子是不迁移的，因此构成所谓稠密层。由于子是不迁移的，因此构成所谓稠密层。由于热运动关系，离表面远的离子构成可迁移层热运动关系，离表面远的离子构成可迁移层或扩散层，因为在双电层内离子的立体分布，或扩散层，因为在双电层内离子的立体分布，就形成一种电势梯度就形成一种电势梯度.当在毛细管两端加
22、有电场时；扩散层内可迁移的当在毛细管两端加有电场时；扩散层内可迁移的阳离子向阴极移动。由于离子是被水化的，因此，在阳离子向阴极移动。由于离子是被水化的，因此，在缓冲液中的液体也随迁移着的阳离子一道，向阴极移缓冲液中的液体也随迁移着的阳离子一道，向阴极移动，形成一种液流，称之为动，形成一种液流，称之为电渗流电渗流（electroosmoticelectroosmotic flowflow，EOFEOF），它是一种电泳驱动力。在双电层内，它是一种电泳驱动力。在双电层内，EOFEOF总是向双电层内抗衡离子方向迁移，穿过双电层总是向双电层内抗衡离子方向迁移，穿过双电层的电势下降的程度受电渗流速度所控制
23、。电渗流的线的电势下降的程度受电渗流速度所控制。电渗流的线速度速度eoeo ，可以定义为：，可以定义为：eoeoE式中，式中，eoeo是电渗迁移率，即在单位电场强度下，电渗流的是电渗迁移率，即在单位电场强度下，电渗流的线速度。线速度。在电渗流存在下，离子的迁移速度可表在电渗流存在下，离子的迁移速度可表示为：示为：=（eoeo）U/LU/Lt t 式中，式中，L Ld d是毛细管总长度；是毛细管总长度；U U是外加电压。是外加电压。离子的迁移时间为离子的迁移时间为t t，则，则 t=Lt=Lt tLd/Ld/（eoeo）U U 式中，式中，L Lt t为进样端到检测器之间的毛细管为进样端到检测器
24、之间的毛细管长度，或称为迁移长度。长度，或称为迁移长度。式中，式中，D D为溶质的平均扩散系数。由上式可见，如果热影响阿忽为溶质的平均扩散系数。由上式可见，如果热影响阿忽略不计的话，增大电压，可增加分离效率。略不计的话，增大电压，可增加分离效率。按按GiddingGidding方程，分辨率方程，分辨率R R只可定义为只可定义为12(/4)(/)Rn式中，式中，是两溶质的区带间的相对速度差。是两溶质的区带间的相对速度差。分离效率分离效率n n可表示为可表示为DUneo2)(在许多情况下，在许多情况下，电渗流速度比许多质点的电泳电渗流速度比许多质点的电泳速度要快，因此，在毛细管中的所有溶质将朝一个
25、速度要快，因此，在毛细管中的所有溶质将朝一个方向迁移，不管它们带多少正电荷，都将先被检出，方向迁移，不管它们带多少正电荷，都将先被检出，继之中性质点被检出，最后带负电荷的质点被检出继之中性质点被检出，最后带负电荷的质点被检出。2112)()(177.0eoDUR 四、四、HPCEHPCE仪器的基本结构仪器的基本结构 充满缓冲液的毛细管，两端分别浸入盛有缓冲液的充满缓冲液的毛细管，两端分别浸入盛有缓冲液的储瓶中，之后通以储瓶中，之后通以30kV30kV的电压，待测组分从毛细管的一的电压，待测组分从毛细管的一端引人，在电场作用下，由于离子迁移速度有差别，而端引人，在电场作用下，由于离子迁移速度有差别，而在整个毛细管内形成不同的样品区带，在毛细管的另一在整个毛细管内形成不同的样品区带，在毛细管的另一端放置检测器，以便连续地检测流过的每一个组分带，端放置检测器，以便连续地检测流过的每一个组分带，分析信号通过检狈分析信号通过检狈u u器接收后。经放大再输入计算机系统器接收后。经放大再输入计算机系统进行数据处理与储存。进行数据处理与储存。
