1、免疫缺陷动物免疫缺陷动物实验动物研究中心 黄莉2内容：内容：1概念2免疫缺陷动物的分类、特点及其应用3人体肿瘤裸鼠移植瘤模型概述4人体肿瘤裸鼠移植瘤模型的建立5人体肿瘤免疫缺陷动物体内转移模型的建立3免疫缺陷动物(Immunodeficiency animal):由于先天性遗传突变或用人工的方法造成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物。1 1概念概念42 2 免疫缺陷动物的分类免疫缺陷动物的分类,来源来源,特点及其应用特点及其应用（1）分类（2）免疫缺陷动物、特点、来源及应用 5免 疫 缺 陷 动 物 先天性的免疫缺陷动物 获得性免疫缺陷动物 T淋巴细胞功能缺陷动物（裸大鼠和裸小鼠）B淋巴细胞
2、功能缺陷动物（性连锁性免疫缺陷小鼠，马）NK细胞功能缺陷动物（Beige小鼠）联合免疫缺陷动物T、B联合免疫缺陷的SCID小鼠 T、NK细胞缺陷小鼠T、B和NK细胞三联免疫缺乏小鼠Motheaten小鼠 其它免疫缺陷动物（显形半肢畸形的无脾小鼠）（1）分类6l获得性免疫缺陷动物：l小鼠AIDS模型：SCID小鼠AIDS模型、AIDS的转基因小鼠。l猴AIDS模型：反转录病毒诱发、SIV诱发。l有蹄动物病毒感染。l黑猩猩HIV感染。lAIDS diseasesAIDSdiseaseslAIDSAIDS When the immune system is lacking one or more o
3、f its components,the result is an immunodeficiency disorder.lThese can be inherited,acquired through infection,or produced as an inadvertent side effect of drugs such as those used to treat cancer or transplant patients.lAIDS is an immunodeficiency disorder caused by a virus that destroys helper T c
4、ells and that is harbored in macrophages as well as helper(T4)T cells.The AIDS virus splices its DNA into the DNA of the cell it infects;the cell is thereafter directed to churn out new viruses.8 （2 2）免疫缺陷动物免疫缺陷动物l T淋巴细胞功能缺陷l裸小鼠(Nude mice):指先天无胸腺的小鼠,简称裸小鼠。l 特点：11号染色体上的裸基因(nu)发生突变,导致出现裸体异常状态。l纯合裸基因的小
5、鼠(nu/nu)临床表现为2个主要缺陷特征：l毛发缺乏呈裸体外表；l仅有胸腺上皮，使T淋巴细胞不能正常分化，导致细胞免疫功能低下。9lB细胞功能正常，NK细胞活力增强。l繁育能力差，乳腺发育缺损，以雄性纯合子与雌性杂合子繁育。lT细胞缺陷可通过移植成熟T细胞、胸腺细胞得到恢复。101112HairlessGuineaPigCD-1NudeMouselDeveloped from the transfer of the nude gene from Crl:NU-Foxn1nu to a CD-1 mouse through a series of crosses and backcrosses
6、 beginning in 1979 at Charles River Laboratories,Wilmington,MA.The animal lacks a thymus,is unable to produce T-cells,and is therefore immunodeficient.lCOATCOLOR Hairless,albino backgroundlRESEARCHAPPLICATIONtumor biology and xenograft research 14l应用：肿瘤学,微生物学,免疫学和寄生虫学等基础医学的研究.l微生物学的研究：由于裸鼠的T淋巴细胞功能缺陷
7、,免疫机能低下,是研究病毒,微生物感染机制的良好模型动物。15l免疫学研究：l研究T淋巴细胞,B淋巴细胞,NK细胞的功能；l肿瘤学研究：裸小鼠不排斥杂交瘤，腹腔内接种可以生长肿瘤，并能生产含有高效价抗体的大量腹水。如BALB/c裸鼠制备单克隆抗体，产生的抗体量多于有胸腺小鼠。HybridomaTechnologylA hybridoma can be produced by injecting a specific antigen into a mouse,collecting antibody-producing cells from the mouses spleen,and fusing
8、 them with long-lived cancerous immune cells.Individual hybridoma cells are cloned and tested to find those that produce the desired antibody.Their many identical daughter clones will secrete,over a long period of time,the made-to-order monoclonal antibody.17裸鼠腹水瘤18l寄生虫的研究：多种寄生虫的感染研究l如裸鼠胸腔内接种卡氏肺囊虫,能
9、复制出卡氏肺囊虫疾病模型；用美洲锥虫感染(肌肉型)裸鼠,产生美洲锥虫慢性感染模型。19l 临床医学研究:l外科学研究 利用裸鼠异种移植离断后神经,观察离体后神经元的生物学性质；l眼科学研究 裸鼠眼内注射视网膜母细胞瘤,观察瘤细胞破环视网膜的全过程;l皮肤病研究 裸鼠感染白色念珠菌,新型隐球菌等,观察其发病机理。20l来源：为突变种自发无毛小鼠l临床表现：1966年在苏格兰的一群小鼠中发现，该鼠生长不良，繁殖力低下，易发生严重感染。l组织病理表现：对无毛小鼠进行胸纵膈连续切片，显示出胸腺缺失，能接受同种或异种组织移植。目前已培育有多种遗传性无胸腺动物，如裸小鼠、裸大鼠、裸豚鼠和遗传性无脾小鼠动物
10、模型。21能接受同种或异种组织移植能接受同种或异种组织移植人造器官培植：鼠背长人耳人造器官培植：鼠背长人耳2223l B淋巴细胞功能缺陷动物：性连锁性免疫缺陷小鼠（Xlinked immune deficiency mouse,XID)特点l位于X染色体上基因缺陷导致B淋巴细胞功能缺乏l临床常表现：血清中分泌免疫球蛋白IgG和IgM缺失,细胞免疫功能正常.与人的Bruton氏丙种球胆白缺乏症相似.l移植正常鼠的骨髓到xid宿主，B细胞缺失可得到恢复。而将xid鼠的骨髓移植到受射线照射的同系正常宿主，其仍然表现为不正常的表型。l该小鼠用于研究B细胞的发生、功能、异质性。24l NK细胞功能缺陷动
11、物Beige(bg)小鼠:l位于13号染色体上的bg隐性基因发生突变，造成NK细胞缺乏；l该基因影响T淋巴细胞功能，同时粒细胞的趋化性和杀菌作用降低；l该基因还影响溶酶体的功能，溶酶体功能缺陷，Beige小鼠它对各种化脓性细菌非常敏感，对各种病原因子较敏感，SPF条件才能较好生存。l用于研究色素缺乏易感性增高综合征。25l严重的联合免疫缺陷小鼠(Severe combined immunodeficient mice,SCID)l为严重的免疫缺陷疾病,动物临床表现为低球蛋白血症、低淋巴细胞血症。26l来源及特点：lSCID小鼠由C57BL/Ka与BALB/cAnIcr品系小鼠杂交产生F1代，F
12、1代兄妹交配到F17代时，发现位于第16号染色体的scid单个隐性基因突变所致。lC.B-17Icr为携带来自C57BL/ka小鼠的免疫球蛋白重链Igh-1b等位基因的 BALB/cAnIcr的同源近交系。27l血液中白细胞缺乏，所有T淋巴细胞和B淋巴细胞功能测试均为阴性，对外源性抗原无细胞免疫和抗体免疫反应。l纯合子血清中无免疫球蛋白，淋巴结、胸腺变小。饲养于SPF环境中。l通过移植人免疫组织或免疫细胞，可使SCID小鼠具有人类部分免疫系统，称为SCID-hu小鼠。28 SCID小鼠外观与普通小鼠相同，但脾脏和胸腺重量不够正常鼠的1030%。外周血液中白细胞总数减少，淋巴细胞占白细胞总数的1
13、020%，正常为70%。29鼠龄鼠龄/周周鼠数鼠数体重体重/g g胸腺重量胸腺重量/mgmg脾脏重量脾脏重量/mgmgSCIDSCID4 4131316.516.50.60.63.5 3.5 0.30.328.128.12.92.9BALB/cBALB/c4 4111116.816.80.80.870.270.28.48.483.483.410.710.7SCIDSCID6 6161619.419.40.90.93.43.40.40.428.728.73.23.2BALB/cBALB/c6 6121218.918.91.11.174.674.67.97.986.586.512.112.1SCI
14、DSCID8 8181821.421.41.71.73.53.50.40.429.329.33.93.9BALB/cBALB/c8 8141421.721.71.41.472.372.38.68.692.692.611.811.8SCIDSCID1010161623.723.71.81.83.63.60.20.229.829.83.33.3BALB/cBALB/c1010101024.024.01.71.775.275.29.79.796.796.714.514.5SCIDSCID和和BALB/cBALB/c小鼠体重、胸腺重量和脾脏重小鼠体重、胸腺重量和脾脏重量比较量比较30鼠龄鼠龄/周周鼠数
15、鼠数白细胞总数白细胞总数/10/109.9.L L-1-1中性粒细胞中性粒细胞淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞SCIDSCID4 412122.12.10.30.30.770.770.840.840.120.120.230.230 00.020.02BALB/cBALB/c4 410107.47.41.11.10.140.140.260.260.720.720.860.860 00.010.01SCIDSCID6 616162.32.30.60.60.740.740.870.870.110.110.260.260.010.010.020.02BALB/cBALB/c6 610106.96.90
16、.70.70.150.150.270.270.710.710.820.820 00.030.03SCIDSCID8 816162.62.60.70.70.760.760.860.860.140.140.230.230 00.020.02BALB/cBALB/c8 812127.17.10.80.80.150.150.230.230.760.760.840.840.010.010.020.02SCIDSCID101012123.13.11.01.00.740.740.860.860.130.130.260.260 00.010.01BALB/cBALB/c101010106.86.80.90.9
17、0.120.120.190.190.800.800.860.860 00.020.02SCIDSCID和和BALA/cBALA/c小鼠外周血细胞分类比较小鼠外周血细胞分类比较31 渗漏现象渗漏现象：少数SCID小鼠的免疫功能可出现极小程度的恢复,把这种现象称为渗漏现象。这种现象不遗传，但受品系，年龄和环境的影响。有研究表明C3H-SCID小鼠的渗漏率低于CB17-SCID小鼠。SPF环境下可存活1年，采用scid小鼠基因纯合子(scid/scid)兄妹交配进行繁殖。32人肺巨细胞癌PLA-801C(上)及PLA-801D(下)SCID小鼠移植后4周荷瘤小鼠l虫蛙小鼠（Motheaten mic
18、e）1965年发现于C57BL/6J的突变，位于第6对染色体上的me基因发生突变，寿命不超过8周。l出生后2天皮肤有脓肿出现,有严重的联合免疫缺陷，对抗原无反应，NK细胞活性低。l纯合子(me/me)小鼠有自身免疫倾向。用于判断生命早期免疫功能缺陷和某种自身免疫性疾病的模型。lC57BL/6J-me在12日龄表皮可见嗜中性白细胞集聚，表皮色素呈斑点状，故称虫蛙小鼠。lthe motheaten mouse can be regarded as a genetically determined model of interstitial lung disease characterized by
19、 alveolar hemorrhage,derangement of parenchymal cells,fibrosis,and an alveolitis with distinctive features 34lT、B和NK细胞三联免疫缺乏小鼠 人工培育的先天性免疫缺陷小鼠。将3个隐性突变基因的3种小鼠（即NK细胞缺陷的Beige基因,T细胞缺陷的nu基因和B细胞缺陷Xid基因）经过杂交、回交、互交等方法，筛选和导入育成的T、B和NK细胞缺乏的Beige-nude-xid小鼠。35l 其它免疫缺陷动物（显性半肢畸形的无脾小鼠）l1号染色体显性基因Dh突变小鼠；l纯合子小鼠（Dh/Dh）
20、泌尿、生殖和骨骼系统发生严重畸形，出生后很快死亡。l杂合子（Dh/+）小鼠缺乏脾脏,在一定程度上损伤体液免疫反应。泌尿、生殖系统、消化道和骨骼有一定程度的畸形。l将nu基因和Dh基因结合在一起，可培育出无胸腺、无脾脏的小鼠。36ComparisonofImmunodeficientStrainsHair Thymus T-Cells B-CellsNK Cells Fix Complement CD-1 Nude-+Nu/Nu Nude-+Balb/c Nude-+NIH-III Nude-+Fox Chase SCID+-+Fox Chase SCID Outbred+-+Fox Chase
21、 SCID Beige+-+NOD SCID+-Nude Rat-+37383 3 人体肿瘤裸鼠移植瘤模型概述人体肿瘤裸鼠移植瘤模型概述（1）人体肿瘤异种移植的研究历史（2）已建立的人体肿瘤裸鼠移植瘤模型（3）人体肿瘤裸鼠移植瘤的生物学特性（1）人体肿瘤异种移植的研究历史 上世纪初研究发现：不同种属实验动物接受肿瘤移植的能力是有差异的。同种移植：鼠自发肿瘤移植于同种鼠的成功率在98%,但在异种鼠体内不能生长。其原因是供体与受体间的组织相容性抗原不同引起的免疫抑制排斥。为克服异种间的免疫排斥，研究者对降低动物免疫功能的方法进行了多种尝试：40原因是供体与受体间的组织相容性抗原原因是供体与受体间的
22、组织相容性抗原不同引起的免疫抑制排斥不同引起的免疫抑制排斥41v免疫迟发部位移植：将人体肿瘤移植到免疫抑制迟发的特殊部位（如鼠脑内,豚鼠眼前房,仓鼠的颊部,鸡胚),有获得成功的报道。但由于肿瘤生长缓慢又受到移入包膜的限制，瘤块小，不能适应需要较多瘤源的实验治疗工作。v降低动物免疫功能：利用注射免疫抑制剂如抗淋巴细胞血清,抗胸腺血清；60Co或X射线照射,在一定程度上提高了肿瘤移植成功率。但对动物有很大的副作用，导致动物肠道受损，寿命缩短。42v切除免疫组织：将新生动物的胸腺和脾脏切除,利用免疫抑制剂注射动物的方法，或用射线照射的方法进行不同的组合,在一定程度上破坏了异种肿瘤移植的排斥，提高了肿
23、瘤移植的成功率。43v肾胞膜下移植：给正常小鼠肾包膜下(SRC)直接移植人肿瘤，移植的肿瘤块可直接从血管床丰富的肾包膜下获得营养和氧气。体式显微镜下观察6d内的肿块变化，用于药物筛选结果与裸鼠SRC接种11天结果相似v无胸腺小鼠和一系列免疫缺陷小鼠的出现，人体肿瘤在免疫缺陷动物体内异种移植的成功，为肿瘤领域的研究带来了一场革命。（2）人体肿瘤裸鼠移植瘤模型的建立人体肿瘤裸鼠移植瘤模型的建立我国目前已建立的人体肿瘤裸鼠移植模型概况（见下表）我国目前已建立的人体肿瘤裸鼠移植模型概况（见下表）肿瘤类型裸鼠品系模型名称模型特点建模人及单位肺鳞癌BALB/cZPS-90皮下及胸腔移植成功率100%，支气
24、管移植80%曾宪民等（1994年），中山医科大学实验动物中心肺鳞癌BALB/cLSX-83戴志强（1988年）等，中国科学院上海药物研究所肺腺癌BALB/cLAX-91具有稳定高分泌癌抗原（CEA)的功能汕头大学医学院肿瘤研究所肺腺癌BALB/cLAX-83戴志强（1988年）等，中国科学院上海药物研究所肺腺癌BALB/cLTETAa-2中国科学院基础医学研究所肺腺癌BALB/cAnip-973腹腔移植形成肺及淋巴结的转移王吾如等(1987年),哈尔滨医科大学病理学教研室肺腺癌BALB/cPC-84045湛江医学院病理教研室肺小细胞癌BALB/cLTEP-Sml电镜下细胞内现A-PUD颗粒赖百
25、塘等(1988年),北京医科大学病理学教研室肺巨细胞癌BALB/cPG皮下接种形成肺及淋巴结的转移吴秉铨等(1985年),北京医科大学病理学教研室肺巨细胞癌BALB/cPLA-801D皮下接种形成肺及淋巴结的转移。系以解放军总医院病理科提供的人肺巨细胞癌细胞系PLA-801D克隆D株在裸鼠皮下连续传代而建立魏泓等(1996年),第三军医大学实验动物教研室肺巨细胞癌BALB/cPLA-801D-ASPLA-801D的腹水瘤模型魏泓等(1996年),第三军医大学实验动物教研室肺燕麦细胞癌BALB/cLOX-82戴志强（1988年）等，中国科学院上海药物研究所肝细胞性肝癌SwissLTNM1-5(5
26、株)汤钊猷等(1982年,1985年,1986年)，上海医科大学中山医院肝癌研究室肝细胞性肝癌BALB/c移植瘤不仅分泌AFP,而且还分泌HBsAg杨善明等(1992),厦门大学抗癌研究中心肝细胞性肝癌BALB/cBEL-7402杨善明等(1992),厦门大学抗癌研究中心胃中分泌管状腺癌BALB/cC57BL/6SY86B皮下转代可形成转移李宏等(1988年),中国医科大学肿瘤研究所胃小弯腺癌Swiss/DFTHBGC-1陈诗书等(1989年)，上海第二军医大学胃管状腺癌BALB/cBGC-823皮下接种淋巴结转移率66.7%北京人民医院及湛江医学院病理教研室胃低分化粘液腺癌BALB/cMGC
27、-803皮下接种肺转率62.5%湛江医学院病理教研室结肠高分化胃癌BALB/cTHCN-8901潜伏期20天,皮下移植成功率95.7%。分泌CEA刘洪等(1984年)，天津市肿瘤研究所人乙状结肠管状腺癌BALB/cHCN-284潜伏期18天,皮下移植成功率100%。分泌CEA黄靖香等(1992年),解放军总医院病理科结肠癌BALB/cXHCn/W潜伏期12天,皮下移植成功率100%,光镜下移植瘤可见大量印戒细胞汪俊等(1987年)，中国医学科学院肿瘤研究所结肠腺癌BALB/c同时建立了皮下和腹腔移植瘤株史历等(1992年),哈尔滨医科大学肿瘤研究所食管鳞状细胞癌NC及BALB/cHEC2潜伏期
28、57天,皮下接种成功率100%蔡海英等(1992年),中山医科大学肿瘤研究所食管腺鳞癌NC及BALB/cHEC6潜伏期610天,皮下接种成功率100%蔡海英等(1992年),中山医科大学肿瘤研究所低分化鳞状细胞鼻咽癌NC/Ng CNE-2Z移植瘤中有EB病毒基因存在及EB病毒膜抗原与膜蛋白表达，皮下接种淋巴结转移 率81.5%唐慰萍等(1989年),湛江医学院肿瘤研究所高分化鳞状细胞鼻咽癌BALB/cCNE-1有EB病毒基因存在及EB病毒膜抗原与膜蛋白表达湛江医学院病理教研室低分化鳞状细胞鼻咽癌BALB/cCNE-21低分化鳞状细胞鼻咽癌BALB/c上海医科大学肿瘤医院放射生物室(1983年）
29、鼻窦(筛窦)癌Swiss病理中为低分化鳞癌，潜伏期14天，皮下移植成功率100%李五一等(1994年),北京协和医院耳鼻喉科鼻窦(上颌窦)癌Swiss李五一等(1994年),北京协和医院耳鼻喉科喉癌BALB/cLC-91王太一等,中国医科大学动物医学部脑恶性胶质瘤NC/NgSHE-44杜子威等(1984),苏州医学院脑星形胶质细胞瘤NC/NgNHA-8有成熟胶质微丝兰青等(1995年),苏州医学院脑星形一少枝混合型胶质细胞瘤NC/NgNHO-10有胶质微丝兰青等(1995年),苏州医学院脑胶质细胞瘤NC/NgNHC-9无胶质微丝兰青等(1995年),苏州医学院浆细胞骨髓瘤BABL/c山东医科大
30、学成骨肉瘤肺转移 癌BABL/c北京人民医院Bcap-37乳腺髓样癌BABL/c北京人民医院人横纹肌肉瘤BABL/c解放军总医院宫颈鳞癌BABL/c湛江医学院病理教研室50 随着人体肿瘤裸鼠移植瘤研究的不断深入,出现的问题，裸鼠移植瘤能否反应人体原发肿瘤的全部性质？裸鼠移植瘤在基因型和表现型上是否稳定？l裸鼠移植瘤组织学特性l裸鼠移植瘤性状的稳定性l裸鼠对移植瘤的反应3）人体肿瘤裸鼠移植瘤的生物学特性人体肿瘤裸鼠移植瘤的生物学特性51l裸鼠移植瘤组织学特性：一般情况下,人体肿瘤裸鼠移植瘤保持了原发肿瘤的特性：如病理形态学，染色体和肿瘤标记物等特点；l病理形态学：多数肿瘤移植后呈结节状生长，肿瘤
31、周围有包膜，少数可观察到远处转移和局部侵袭；l染色体和肿瘤标记物：移植瘤经传代后仍保持人类肿瘤细胞染色体的核型特征,肿瘤细胞的机能和原发肿瘤分泌特性。人体肿瘤裸鼠移植瘤中产生的肿瘤分人体肿瘤裸鼠移植瘤中产生的肿瘤分泌活性物质及表面抗原泌活性物质及表面抗原甲胎蛋白甲胎蛋白(AFP)AFP)及及HBsAgHBsAg:肝癌细胞肝癌细胞癌胚抗原癌胚抗原(CEA):CEA):结肠癌细胞结肠癌细胞,人肺腺癌（裸小鼠移植瘤在人肺腺癌（裸小鼠移植瘤在 裸鼠血清中可检测裸鼠血清中可检测CEACEA）白细胞刺激因子白细胞刺激因子(CSF)CSF)：肺癌肺癌,口腔癌口腔癌,甲状腺癌和胆管癌甲状腺癌和胆管癌促红细胞生
32、成素促红细胞生成素(EPO)EPO)：肾癌和肝癌肾癌和肝癌激素（激素（HCG,ADH,ACTH,PG):HCG,ADH,ACTH,PG):肺癌和肾癌，肝癌和许多恶肺癌和肾癌，肝癌和许多恶 性肿瘤性肿瘤酶酶(LDH)LDH)和其它物质和其它物质(黑色素黑色素):):移植瘤，恶性黑色素瘤，移植瘤，恶性黑色素瘤，非何杰金氏淋巴瘤非何杰金氏淋巴瘤53l裸鼠移植瘤性状的稳定性l不稳定性：人体肿瘤裸鼠移植瘤经过长期传代，表现出的基因型和表现型不稳定。l肿瘤细胞的选择性生长：裸鼠体内的移植瘤仅表现一种或几种肿瘤细胞亚群的选择性生长，移植瘤中不能出现人体原发肿瘤的全部特性。54l表现出一定的异质性：如细胞周期
33、时相（整倍体细胞和非整倍体细胞）、超微结构和肿瘤的标记物与原发肿瘤细胞在生物学性状上有差异。一些肿瘤移植到裸鼠后会发生某些性状的改变，如肿瘤标记物丢失，或产生在原肿瘤中不存在的标记物。55 如：人肺癌移植于裸鼠，许多原肿瘤标记物丢失（1-抗胰蛋白酶,ACTH,铁蛋白,CEA,降钙素）；如：肾癌移植后，除分泌红细胞生成素外，还分泌使肝脏肿大，体液增多的物质。因此，认识裸鼠常不能再现人体原发肿瘤全部性状和在遗传学上的不稳定性，对合理应用实验模型和科学分析试验结果有十分重要的意义。56l裸鼠对移植瘤的反应l 人体肿瘤间质不同程度的被裸鼠间质代替：恶性肿瘤裸鼠移植后，随着移植肿瘤的生长，裸鼠产生血管床
34、和纤维架组成肿瘤间质，肿瘤实质是人癌细胞增殖形成的，但人体肿瘤裸鼠移植瘤可诱发裸鼠间质细胞发生恶变;l或移植瘤间质细胞和肿瘤细胞一样能在裸鼠体内增殖。总之裸鼠的间质细胞受肿瘤产生化学物质影响可发生恶变，间质又影响肿瘤细胞的分化程度，分化程度高的见于鳞状上皮癌，分化程度低的见于腺癌。4 4 人体肿瘤裸鼠移植瘤模型的建立人体肿瘤裸鼠移植瘤模型的建立（1 1）繁殖和饲养）繁殖和饲养 l采用隐性纯合子(nu/nu)雄性裸鼠与表现型正常的杂合子(+/nu)雌鼠，生产表型正常的仔鼠和裸鼠.饲养在SPF环境中58（2 2）人体肿瘤裸鼠移植方法人体肿瘤裸鼠移植方法l根据移植肿瘤处理方式的不同分：组织块移植法,
35、悬液移植法,细胞培养移植法。组织块移植（用于建瘤株的初期）术前准备：-眼科剪、眼科镊、手术刀柄及刀片（10号）、培养皿、套管针、注射器（1mL)、针头（4号）、器械、纱布、棉球打包消毒。-消毒液擦净工作台，打开紫外灯，消毒半小时以上。59 移植方法：-人肿瘤手术切除标本放入1640细胞培养液，或将供瘤鼠脱颈椎处死，皮肤用1碘伏、75酒精消毒，用手术刀切开皮肤和肿瘤，尽量取色泽肉红的肿瘤块，于PBS液中剪成1 mm3大小,用套管针吸取2块，接种到裸鼠的腋部,腹股沟,背部皮下或指定部位。术后处理：-手术完毕，将供体鼠及肿瘤块包好放入污染袋，用有消毒剂的纱布擦净操作台，用喷雾装置对室内空气喷雾消毒。
36、术中所用的棉签、棉球、手套及纱布等应焚烧，器械煮沸消毒30min后，再高压灭菌处理。60悬液移植法：瘤组织加入细胞培养液,用玻璃匀浆器制成悬浮液，稀释到所需浓度（106 107/mL），接种到一定部位，每只0.2mL。细胞培养移植法：瘤细胞生长旺盛时进行移植，从培养瓶中倒出培养液，加入胰蛋白酶消化，离心，倒掉消化液，用Hanks清洗后，加入细胞培养液，稀释到所需浓度（计数106107/mL），进行皮下或其他指定部位注射。61l根据肿瘤移植途径不同分：皮下,肌肉,腹腔,肾包膜,原位移植等。皮下移植：使用组织块,组织悬液或细胞培养液均可。一般选择右侧腋下、背部、腹股沟等部位。肾胞膜下移植：肾包膜下
37、移植 早在70年代，Bogden就完成了癌细胞肾包膜下移植试验,称为SRCA(Subrenal capsule assay)，用12号套管针将瘤组织接种于肾门相对部位的肾胞膜下。6263原位移植 将人肿瘤细胞移植到与肿瘤原发部位相同的裸鼠体内，如将肝癌移植到裸鼠的肝脏。人肝癌组织的原位移植：裸鼠(58周龄,1820g,雌雄并用),麻醉后左侧仰位固定,消毒皮肤,右肋沿下斜切口(1cm)，打开腹腔,暴露肝脏,切开肝脏外膜，将患者手术新鲜无菌标本组织块移入，缝合。64结肠癌原位移植方法:肺癌的原位移植方法:-支气管移植法(0.030.05mL)；-肺癌瘤块肺部直接移入法:膀胱癌的原位移植方法：腹水瘤
38、的建立及移植方法：0.2mL实体瘤细胞悬液注入裸鼠腹腔，肿瘤生长后引起腹水，腹水中含有大量肿瘤细胞,可移植传代，称腹水瘤.腹水瘤细胞注入皮下，可形成实体瘤。65（3 3）影响人体肿瘤裸鼠移植成功的因素）影响人体肿瘤裸鼠移植成功的因素l人体肿瘤细胞本身的特征l裸鼠免疫功能状态l裸鼠背景l移植部位和途径l激素和宿主性别l鼠龄l其它因素66l人体肿瘤细胞本身的特征 人体肿瘤手术标本裸鼠移植具有一定规律，对 381例肿瘤裸鼠移植分析后发现：分化低的肿瘤,恶性黑色素瘤和结肠癌移植成功率高，乳腺癌,前列腺肿瘤,造血器官肿瘤移植成功率低；女性生殖系统肿瘤,转移和复发性肿瘤成功率高，生长速度快；已建株的癌细胞
39、在裸鼠移植成功率高于人癌手术标本移植；381例肿瘤裸鼠移植后，肿瘤手术标本裸鼠移植成功率平均为28.3%(原发性肿瘤占11.5%；复发性肿瘤为50%，转移性肿瘤38.5%)。67l裸鼠遗传背景和免疫功能状态裸鼠不是没有免疫力，其体内存在较高的NK细胞,B细胞和非依赖T细胞的免疫活性。不同遗传背景影响肿瘤的生长：裸基因(nu)导入不同背景品系的小鼠，产生不同的生物学特性的裸鼠品系，如BALB/c,CBA/N,NFS/N,NIH(S),C3H/HeN,C57BL/6N,LASA等。68如BALB/c，NFS/N，NIH(S)裸鼠消化道肿瘤生长较快;BALB/c-AnN裸鼠体内NK细胞活性比同龄的N
40、IH(S)裸鼠NK细胞活性低。联合免疫缺陷小鼠提高了人体肿瘤异种移植的成功率。ImmunedeficientmousestrainsStrain:DeficienciesSCIDT,B,(high NK)SCID/BeigeT/B/NKNudeT,B cell function low,(high NK)beige/nude/XID(bnx)T,B,NK(can be leaky)NOD/SCIDT,B,NK,macrophage(can drift)NOD/SCID/B2M k/oT,B,NK,Macrophage-absolute deficiencies.Best model avail
41、able.4 month lifespan.Nude/NOD/SCIDT,B,NK-2 year lifespan70l移植部位和途径部位：肿瘤接种的部位不同，成功率不同。脑内接种成功率最高；以肾包膜下接种成功率高于皮下接种；皮下接种以近头侧的腋下接种，成功率高。途径：移植途径不同可影响移植瘤的生物学特性。皮下接种一般不发生肿瘤的转移和侵袭，而腹腔内接种较容易显示肿瘤细胞的侵袭和转移能力。71裸鼠乳腺癌（依赖雌激素）雌性裸鼠雄性裸鼠雌性裸鼠卵巢切除雌性裸鼠卵巢切除并用雌激素处理生长情况慢更慢不生长生长良好l 激素和宿主性别 激素依赖性肿瘤(如乳腺癌,子宫肿瘤,骨瘤)在裸鼠中难移植成功，裸鼠的性
42、别和激素水平直接影响裸鼠移植瘤。72幼年裸鼠和成年裸鼠移植肿瘤生长比较鼠龄幼年裸鼠(3周龄)或新生裸鼠成年裸鼠（68周)肿瘤生长情况明显的侵袭和高度自发性或实验性转移局限性生长或低转移l鼠龄鼠龄对移植肿瘤生长及其转移的影响与不同龄鼠的NK细胞活性不同有关普通和洁净状况下裸鼠移植瘤生长比较饲养环境洁净和健康裸鼠普通和肝炎阳性裸鼠皮下或腹腔接种喉癌(HEP-2)或结肠癌(SW480)可形成瘤，有皮下肿瘤侵袭胞膜；腹腔接种呈明显侵袭和转移未形成肉眼可见瘤体，接种细胞数量增加，少数成瘤，但无侵袭和转移发生l裸鼠健康和洁净状况 裸鼠受病毒或细菌感染，可增加抗原刺激，从而影响NK细胞等非T淋巴细胞依赖性免
43、疫活性，影响移植瘤的成活及转移发生。745 5 人体肿瘤免疫缺陷动物体内转移模型的建立人体肿瘤免疫缺陷动物体内转移模型的建立（1）免疫缺陷动物宿主及其体内肿瘤转移比较（2）移植方法75l免疫缺陷动物的培育,为肿瘤转移模型的建立带来了新的宿主动物和研究工具；其应用提高了建立肿瘤转移模型的成功率。肿瘤转移是恶性肿瘤患者死亡的原因l目的：研究机体免疫功能与肿瘤转移的关系；通过整体观察确认肿瘤转移过程；建立合理的肿瘤转移动物模型，有效进行肿瘤机理研究和抗转移药物的筛选。76(1)(1)免疫缺陷动物宿主及其体内肿瘤转移的比较免疫缺陷动物宿主及其体内肿瘤转移的比较l无胸腺裸鼠lT、NK细胞缺陷的Beige
44、-nude小鼠lT、B细胞缺陷的Scid小鼠lT、B、NK细胞三联免疫缺陷小鼠77l无胸腺裸鼠大多数人类恶性肿瘤在裸鼠建立了移植移植瘤,但在裸鼠体内建立的人类恶性肿瘤裸鼠转移瘤还很少,转移瘤的建立具有一定偶然性。经皮下移植的人恶性肿瘤(手术标本,培养细胞)均表现不转移和转移力低,仅在皮下形成局限性肿瘤,不易扩散。因此，无胸腺裸鼠皮下移植瘤模型在肿瘤转移研究中具有局限性局限性。78lT、NK细胞缺陷的Beige-nude小鼠在裸鼠体内难移植成功的人T淋巴细胞性白血病细胞系(CEM)移植到Beige-nude体内，建立了肿瘤移植模型,但移植瘤在皮下仅呈现局限性生长;将裸鼠体内形成低转移和不转移的癌
45、株(成人类肺腺癌PAa)移植于Beige-nude小鼠，其体内移植瘤转移率明显高于裸鼠对照组。79l T、B细胞缺陷的Scid小鼠Scid小鼠T、B淋巴细胞缺陷，接受人类肿瘤移植后,成活率高,容易发生侵袭和转移。白血病细胞移植到Scid小鼠后，肿瘤細胞在其骨髓，脾脏等造血器官和非造血器官(胸腺，中枢神经系统)中增生、扩散，其病理过程与白血病病人的临床过程极为相似。目前用于白血病(B细胞性白血病,T细胞性白血病和髓细胞性白血病)和淋巴瘤的研究，80l T、B、NK细胞三联免疫缺陷小鼠深度免疫缺陷小鼠,在肿瘤模型建立应用中优于裸鼠。将前B细胞性白血病细胞移植于Beige-nude-xid小鼠，癌细
46、胞在鼠体内广泛扩散。81 免疫缺陷 小鼠 肿瘤生长及转移 无胸腺裸鼠T、NK细胞缺陷小鼠T、B细胞缺陷的SCID小鼠T、B、NK细胞三联免疫缺陷人体恶性肿瘤皮下接种不转移或转移力低，不易扩散局限性生长有转移发生移植成活率高易发生侵袭和转移T淋巴细胞性白血病细胞系难移植成功仅建立了移植模型，皮下局限性生长肿瘤细胞在造血和非造血器官增生和扩散成人类肺腺癌PAa 低转移或不转移体内转移率高于裸鼠前B细胞性白血病细胞癌细胞在体内广泛扩散先天性免疫缺陷小鼠人体肿瘤移植后生长比较先天性免疫缺陷小鼠人体肿瘤移植后生长比较82(2)(2)移植方法移植方法l原位移植l结合体外筛选的移植方法l结合体内筛选的移植方
47、法83l原位移植法（前述）优点：目前原位移植法已得到广泛应用，能提高肿瘤移植自发性转移模型建立的成功率。原位移植可获得与人体内相近的微环境，提供了多种促进肿瘤生长的因子，且血液供应丰富，有利于肿瘤组织侵袭和扩散。侵袭和转移的方式较皮下移植更客观的模拟和反映人体肿瘤转移和侵袭的过程。84l结合体外筛选的移植方法将肿瘤细胞在体外用多种方法进行克隆,分别给动物注射已筛选出的高转移瘤株和低转移瘤株,该方法称为体外克隆筛选法。如人肺巨细胞癌母系细胞PLA-801进行克隆化，建成A,B,C,D四株亚系，接种于裸鼠皮下后，D株为高转移株，C株为低转移株。原理是肿瘤本身是多克隆异质性细胞所组成,转移的发生主要
48、取决于高转移能力的瘤株存在于肿瘤细胞群体中。l结合体内筛选的移植方法将人肿瘤细胞移植到有利于肿瘤表型表达的体内部位如腹腔注射或原位移植。移植后的肿瘤转移后，取肝,肺转移灶直接移植到裸鼠皮下传代,或体外培养后,再移植，以此循环数次，建立高转移瘤株。“脾-肝循环”体内筛选法：是将肿瘤细胞悬液注射到动物脾内，在肝脏中形成转移瘤后，在体外进行细胞培养，再行脾内注射，在肝脏中形成转移瘤，如此循环反复数次，以筛选出高转移瘤株。复习：复习：名词解释：近交系；封闭群；品种与品系；近交系数；近交衰退；亚系；支系；同源性（homologous）；重组近交系；系统杂交动物；转基因动物；嵌合体动物；克隆动物；免疫缺陷动物；SCID鼠；裸鼠；渗漏现象。近交系和封闭群小鼠的命名，特点，应用。实验动物选择的基本原则。88 转基因动物与克隆动物的区别；转基因动物的方法；显微注射技术制备转基因动物的过程；动物克隆技术的基本方法；目前克隆技术有几种细胞核移植；先天性免疫缺陷动物分类，在人体肿瘤体内转移模型中的特点。
