1、第一节第一节 免疫标记技术简介免疫标记技术简介 将某种可微量或超微量测定的物质将某种可微量或超微量测定的物质（如放射性核素、荧光素、酶、化学发（如放射性核素、荧光素、酶、化学发光剂等）标记于抗原（抗体）上制成标光剂等）标记于抗原（抗体）上制成标记物，加入到抗原抗体的反应体系中与记物，加入到抗原抗体的反应体系中与相应的抗体（抗原）反应，以检测标记相应的抗体（抗原）反应，以检测标记物的有无及含量的多少，间接反映被测物的有无及含量的多少，间接反映被测物的存在。称做物的存在。称做免疫标记技术免疫标记技术（immunolabelling techniqueimmunolabelling techniqu
2、e）。）。免疫标记技术概念免疫标记技术概念优点优点:特异、敏感、快速；能定性特异、敏感、快速；能定性和定量甚至定位，且易于观察。和定量甚至定位，且易于观察。免疫标记技术的分类免疫标记技术的分类免疫荧光标记技术免疫荧光标记技术免疫酶标记技术免疫酶标记技术放射免疫测定法放射免疫测定法 金免疫技术、化学发光免疫技术、免疫印迹技术、流式细胞术 一、免疫荧光标记技术一、免疫荧光标记技术 (immunofluorescence,IF)(immunofluorescence,IF)用用荧光素荧光素与与抗体抗体连接成连接成荧光抗荧光抗体体，再与待检标本中，再与待检标本中抗原抗原反应，荧反应，荧光显微镜下观察，
3、抗原光显微镜下观察，抗原-抗体复合物抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定性或散发荧光，借此对抗原进行定性或定位。定位。免疫荧光法可用于检测多种免疫荧光法可用于检测多种病病原体原体的抗原、抗体，或鉴定的抗原、抗体，或鉴定免疫细免疫细胞膜胞膜抗原。抗原。二、免疫酶标记技术二、免疫酶标记技术 (enzyme immunoassay,EIA)(enzyme immunoassay,EIA)将抗原将抗原-抗体反应的抗体反应的特异性特异性与酶催与酶催化作用的化作用的高效性高效性相结合，借助酶作用相结合，借助酶作用于底物的于底物的显色反应显色反应判定结果。应用酶判定结果。应用酶标测定仪测定光密度（标测定仪测
4、定光密度（ODOD）值可反映）值可反映抗原含量，灵敏度达抗原含量，灵敏度达ng/mlng/ml甚至甚至pg/mlpg/ml水平。水平。三、放射免疫测定法三、放射免疫测定法 (radioimmunoassay,RIA)(radioimmunoassay,RIA)用用放射性核素放射性核素标记抗原或抗体进行免标记抗原或抗体进行免疫学检测。该法兼有放射性核素的高灵疫学检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原敏度和抗原-抗体反应的特异性，检测灵抗体反应的特异性，检测灵敏度达敏度达pgpg水平。水平。常用于标记的放射性核素为常用于标记的放射性核素为125125I I和和131131I I，分为液相和固相两
5、种方法。分为液相和固相两种方法。常用于测定微量物质，如胰岛素、生常用于测定微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素；吗啡、长激素、甲状腺素、孕酮等激素；吗啡、地高辛、地高辛、IgEIgE等。等。一、荧光基础知识简介一、荧光基础知识简介（一）荧光的产生（一）荧光的产生 一些化学物质能从外界一些化学物质能从外界吸收并储存吸收并储存能量能量（如光能、化学能等）而进入（如光能、化学能等）而进入激激发态发态，当其从，当其从激发态激发态再回复到再回复到基态基态时，时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。（即发光）。第二节 免疫荧光标记技术荧光免疫技术一般应
6、用荧光免疫技术一般应用致荧光物质致荧光物质进进行标记。行标记。荧光种类荧光种类致荧光：光激发产生致荧光：光激发产生化学荧光化学荧光X X线荧光线荧光阴极射线荧光阴极射线荧光 可产生荧光的分子或原子在接受能量可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。荧光发射的特点是：荧光发射的特点是：（二）荧光效率（二）荧光效率 荧光效率是指荧光分子将吸收的光荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。光量子的数值成正
7、比。荧光效率发射荧光的光量子数荧光效率发射荧光的光量子数/吸收光的光量子数吸收光的光量子数（三）荧光的猝灭（三）荧光的猝灭 荧光分子的辐射能力在受到激发光较长荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射收的能量无法以荧光的形式发射 荧光物质的保存应注意荧光物质的保存应注意避免光（特避免光（特别是紫外光）别是紫外光）的直接照射和与其他化合的直接照射和与其他化合物的接触。物的接触。（四）常用的免疫标记荧光物质（四）常用的免疫标记荧光物质
8、1 1、异硫氰酸荧光素、异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate,fluoresceinisothiocyanate,FITCFITC）黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。精等溶剂。最大吸收光波长为最大吸收光波长为490nm490nm495nm495nm，最大，最大发射光波长发射光波长520nm520nm530nm530nm，呈现明亮的，呈现明亮的黄黄绿色荧光绿色荧光，在冷暗干燥处可保存多年，是，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。应用最广泛的荧光素。其主要优点是：其主要优点是：人眼对黄绿色较为敏感，人眼对黄绿色较为
9、敏感，通常切片标本中的绿色荧光通常切片标本中的绿色荧光 少于红色。少于红色。2 2、四乙基罗丹明、四乙基罗丹明 （rhodamine,RIB200rhodamine,RIB200）橘红色粉末，易溶于酒精。性质稳橘红色粉末，易溶于酒精。性质稳定，可长期保存。定，可长期保存。最大吸收光波长为最大吸收光波长为570nm570nm，最大发射，最大发射光波长为光波长为595nm595nm600nm600nm，呈，呈橘红色荧光橘红色荧光。3 3、四甲基异硫氰酸罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate,tetramethylrhodamineisot
10、hiocyanate,TRITCTRITC）紫红色结晶粉末，溶于水和酒精。最紫红色结晶粉末，溶于水和酒精。最大吸引光波长为大吸引光波长为550nm550nm，最大发射光波长，最大发射光波长为为620nm620nm，呈，呈橙红色荧光橙红色荧光。与与FITCFITC的翠绿色荧光对比鲜明，可的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色，其异硫配合用于双重标记或对比染色，其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。二、荧光免疫标记技术原理和方二、荧光免疫标记技术原理和方法法（一）原（一）原 理理 荧光免疫技术是用化学方法使荧光免疫技术是用化学方法使荧光荧光素标记
11、的抗体素标记的抗体（或抗原）与（或抗原）与组织或细组织或细胞中的相应抗原胞中的相应抗原（或抗体）结合，进（或抗体）结合，进行定性定位检查抗原或抗体的方法。行定性定位检查抗原或抗体的方法。（二）方（二）方 法法 1 1、直接荧光法、直接荧光法 把荧光抗体加到待检的细胞悬液、细把荧光抗体加到待检的细胞悬液、细胞涂片或组织切片上进行染色，经抗原胞涂片或组织切片上进行染色，经抗原抗体反应后，洗去未结合的荧光抗体。抗体反应后，洗去未结合的荧光抗体。将待检标本在荧光显微镜下观察，有荧将待检标本在荧光显微镜下观察，有荧光的部位即有相应抗原存在。光的部位即有相应抗原存在。可用于病毒感染细胞、带某种特异可用于病
12、毒感染细胞、带某种特异抗原的细胞（如抗原的细胞（如T T细胞和细胞和B B细胞）或病原细胞）或病原菌的检查，也可用于组织中沉着的免疫菌的检查，也可用于组织中沉着的免疫复合物的检查。复合物的检查。抗原抗原标记抗体标记抗体光原光原荧光荧光直接法原理示意图直接法原理示意图缺点：检查每种抗原均需制备相应标记的抗体缺点：检查每种抗原均需制备相应标记的抗体炭疽杆菌炭疽杆菌24h24h培养物直接荧光抗体检测培养物直接荧光抗体检测间接法原理示意图抗原抗原抗体抗体标记标记抗体抗体光原荧光(一一)间接法间接法 将抗体将抗体(一抗一抗)与标本中的与标本中的抗原结合抗原结合,再用再用FITC标记的二抗染色。标记的二抗
13、染色。2 2、间接荧光法、间接荧光法 将组织或细胞上的抗原直接与将组织或细胞上的抗原直接与相应抗体（不标记荧光）结合，此相应抗体（不标记荧光）结合，此为第一抗体，再把能与第一抗体特为第一抗体，再把能与第一抗体特异结合的荧光标记的抗免疫球蛋白异结合的荧光标记的抗免疫球蛋白抗体加入，此为荧光标记的第二抗抗体加入，此为荧光标记的第二抗体，在荧光显微镜下观察荧光。体，在荧光显微镜下观察荧光。间接法原理示意图间接法原理示意图抗原抗原抗体抗体标记标记抗体抗体光原光原荧光荧光优点：敏感，一种标记抗体可以检测多种抗原优点：敏感，一种标记抗体可以检测多种抗原缺点：操作繁琐缺点：操作繁琐3 3、免疫荧光细胞化学、
14、免疫荧光细胞化学 先先将已知的抗原或抗体标记上荧光素将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗，再用这种荧光抗体（或抗原）原）作为分子探针作为分子探针检查细胞或组织内的相应检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，可以看见荧光所在的细胞或组镜观察标本，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量及利用定量技术测定含量。三、荧光标记抗原
15、三、荧光标记抗原/抗体时非特异性抗体时非特异性 染色的主要因素染色的主要因素 微生物的原发荧光微生物的原发荧光 组织的原发荧光组织的原发荧光 游离荧光素及其衍生物的存在游离荧光素及其衍生物的存在 抗体不纯抗体不纯 抗原不纯抗原不纯 染色不当染色不当四、免疫荧光标记技术的应用四、免疫荧光标记技术的应用（一）定性分析一）定性分析 荧光物质特性的光谱包括激发光谱荧光物质特性的光谱包括激发光谱和荧光光谱两种。在分光光度法中，和荧光光谱两种。在分光光度法中，被测物质只有一种特征的吸收光谱，被测物质只有一种特征的吸收光谱，而荧光分析法能测出两种特征光谱，而荧光分析法能测出两种特征光谱，因此，鉴定物质的可靠
16、性较强。因此，鉴定物质的可靠性较强。（二）定量测定（二）定量测定 荧光分析法的定量测定方法较多，荧光分析法的定量测定方法较多，可分为直接测定法和间接测定法两类。可分为直接测定法和间接测定法两类。1 1、直接测定法、直接测定法 利用荧光分析法对被利用荧光分析法对被分析物质进行浓度测定。分析物质进行浓度测定。2 2、间接测定法、间接测定法 有些物质本身不能发有些物质本身不能发光或荧光量子产率低，只能用间接测定光或荧光量子产率低，只能用间接测定法法化学转化法、荧光猝灭法、敏化发光法化学转化法、荧光猝灭法、敏化发光法五、五、荧光免疫技术实验示例荧光免疫技术实验示例抗细胞核抗体抗细胞核抗体(Antinu
17、clear(Antinuclear antibody,ANA)antibody,ANA)检测对胶原性疾病检测对胶原性疾病(如全身性红斑如全身性红斑性狼疮性狼疮)及其他自身免疫性疾病的诊断及其他自身免疫性疾病的诊断有一定意义。有一定意义。【原原 理理】全身性红斑性狼疮全身性红斑性狼疮 (SLE)(SLE)是一种是一种自身免疫性疾病，患者血清中出现自身免疫性疾病，患者血清中出现ANAANA。以大白鼠肝细胞核作为抗原基质，加以大白鼠肝细胞核作为抗原基质，加病人血清病人血清 (第一抗体第一抗体)，再加荧光标记，再加荧光标记的抗人的抗人IgG(IgG(第二抗体第二抗体)进行间接免疫荧进行间接免疫荧光试验
18、，若患者血清中有光试验，若患者血清中有ANAANA，ANAANA便便与肝细胞核抗原结合，再与荧光标记与肝细胞核抗原结合，再与荧光标记的抗人的抗人IgGIgG结合，在荧光镜下可见细胞结合，在荧光镜下可见细胞核显示黄绿色特异荧光。核显示黄绿色特异荧光。【材材 料料】1 1、大白鼠肝组织印片。大白鼠肝组织印片。2 2、病人血清。病人血清。3 3、荧光标记抗人荧光标记抗人IgGIgG。4 4、丙酮、丙酮、PBSPBS、缓冲甘油、缓冲甘油 (PBS+(PBS+等量甘等量甘油油)。5 5、阳性血清和阴性血清。阳性血清和阴性血清。【方方 法法】1 1、将大白鼠肝冰冻印片浸于丙酮中固定将大白鼠肝冰冻印片浸于丙
19、酮中固定5 5分分钟，钟，PBSPBS漂洗三次，每次漂洗三次，每次3 3分钟，取出晾干，分钟，取出晾干，-20-20保存备用。保存备用。2 2、用、用PBSPBS稀释病人血清，使成稀释病人血清，使成1:51:5、1:101:10、1 1：20201:12801:1280稀释度。稀释度。3 3、将不同稀释度的病人血清将不同稀释度的病人血清1010微升微升分别加入鼠肝印片上，放湿盒内，分别加入鼠肝印片上，放湿盒内，置置3737培养箱中培养箱中3030分钟。分钟。4 4、用、用PBSPBS洗去印片上未结合的血清，洗去印片上未结合的血清，然后再用然后再用PBSPBS漂洗三次，每次漂洗三次，每次3 3分
20、钟，分钟，晾干。晾干。5、分别滴加适当稀释的荧光标记分别滴加适当稀释的荧光标记抗人的抗人的IgG(1:10),IgG(1:10),放湿盒内，置放湿盒内，置3737培养箱中培养箱中3030分钟。分钟。7 7、在染好的玻片上滴加缓冲甘油，荧在染好的玻片上滴加缓冲甘油，荧光镜检。光镜检。6 6、用、用PBSPBS洗去未结合的荧光抗体，然后洗去未结合的荧光抗体，然后再用再用PBSPBS漂洗三次，每次漂洗三次，每次3 3分钟，晾干。分钟，晾干。【结结 果果】整个肝细胞核着色发出整个肝细胞核着色发出黄绿色黄绿色荧光者荧光者为阳性为阳性;不发荧光者为阴性。不发荧光者为阴性。第三节第三节 酶免疫技术酶免疫技术
21、一、一、酶免疫技术中酶、显色底物和标记物的制备酶免疫技术中酶、显色底物和标记物的制备 在酶免疫技术中用于标记的酶应在酶免疫技术中用于标记的酶应具有具有催化活性高、催化专一性强与抗原抗体偶催化活性高、催化专一性强与抗原抗体偶联后不影响抗原抗体的免疫反应性和酶活联后不影响抗原抗体的免疫反应性和酶活性性；催化的；催化的底物易于配制底物易于配制、保存且催化底、保存且催化底物产生的物产生的信号产物易于观察和检测信号产物易于观察和检测；对人；对人无害且价廉、易得等特点。无害且价廉、易得等特点。表表1 1 常用酶及底物常用酶及底物常用酶常用酶底物底物加终止液加终止液前颜色前颜色加终止液后加终止液后颜色颜色辣
22、根过氧辣根过氧化物酶化物酶（HRPHRP）RZ3.1RZ3.1碱性磷酸碱性磷酸酶（酶（APAP）邻苯二胺邻苯二胺（OPDOPD）四甲基联苯四甲基联苯胺（胺（TMBTMB）对硝基苯磷对硝基苯磷酸酯（酸酯（p-p-NPPNPP）橙黄色橙黄色蓝色蓝色黄色黄色棕黄色棕黄色黄色黄色黄色黄色（二）二）标记物的制备标记物的制备标记物制备的方法两类：标记物制备的方法两类：1 1、交联法、交联法 交联法是以一可同时与酶和抗体（抗原）交联法是以一可同时与酶和抗体（抗原）结合的交联剂作为结合的交联剂作为“桥桥”，分别连接酶与，分别连接酶与抗体（抗原）的方法，此类方法中目前最抗体（抗原）的方法，此类方法中目前最常用的
23、是戊二醛交联法，形成的结合物为：常用的是戊二醛交联法，形成的结合物为：酶酶-戊二醛戊二醛-抗体（抗原抗体（抗原）。2 2、直接法、直接法 直接法是用一活化剂首先将酶直接法是用一活化剂首先将酶活化，被活化的酶分子上的基团直活化，被活化的酶分子上的基团直接可与抗体（抗原）结合形成标记接可与抗体（抗原）结合形成标记物，如过碘酸钠法。物，如过碘酸钠法。形成的结合物为：形成的结合物为：酶酶-抗体（抗原）抗体（抗原）。二、二、辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)(Horseradish Peroxidase,HRP)标记抗体的制备示例标记抗体的制备示例（一）
24、辣根过氧化物酶和底物简介（一）辣根过氧化物酶和底物简介 Horseradish Peroxidase,HRP Horseradish Peroxidase,HRP 比活性高，稳定，分子量小，纯酶比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。容易制备，所以最常用。HRPHRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量结合而成的糖蛋白，糖含量1818。底物：邻苯二胺、四甲基联苯胺底物：邻苯二胺、四甲基联苯胺简易过碘酸盐氧化法原理：辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适
25、用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH(氢硼化钠）(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。四 操作步骤 （1）称取5mgHRP溶解于0.5ml蒸馏水中。（2）向溶液中加入0.5ml新配的0.1M NaIO溶液，混匀，4静置30分钟。（3）加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混匀，静置30分钟。（4）加入含5mg抗体的水溶液1ml，混匀装入透析袋，pH9.5 碳酸盐缓冲液透析，4过夜。（5）加0.2 mL 新配的5 mg/mL NaBH液，混匀，再置4,2h。（6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4
26、 1h。（7）3000 r/min 离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15moL/L pH7.4 的PBS中。（8）将上述溶液装入透析袋中，对0.15 moL/L pH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000 r/min 离心30 min 去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。(二)HRPHRP标记抗体的方法标记抗体的方法 1 1、原理、原理 戊二醛为一种双功能试剂，通过戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶基共价结合，形成酶-戊二醛戊二醛-免疫球
27、免疫球蛋白结合物。蛋白结合物。2 2、试剂及器材试剂及器材(1)0.1M PH6.8(1)0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水磷酸缓冲盐水(PBS)(PBS)：取：取0.2M Na2HPO4 49ml,0.2M NaH2PO4 0.2M Na2HPO4 49ml,0.2M NaH2PO4 51ml51ml，NaCl 1.8gNaCl 1.8g，加蒸馏水至，加蒸馏水至200ml200ml。(2)1.25(2)1.25戊二醛液：取戊二醛液：取2525戊二醛戊二醛50ml50ml与与PH6.8PH6.8的的PBS1mlPBS1ml混合。混合。(3)1M PH9.5(3)1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取碳
28、酸盐缓冲液：取1M1M碳酸钠碳酸钠3ml3ml与与1M1M碳酸氢钠碳酸氢钠7ml7ml混合。混合。(4)0.2M(4)0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg29.2mg溶溶于于0.01M PH9.50.01M PH9.5碳酸缓冲液碳酸缓冲液1ml1ml中。中。(5)0.15M PH7.4 PBS(5)0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。及生理盐水。(6)PH7.8(6)PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。液。(7)(7)萘氏试剂及聚乙二醇萘氏试剂及聚乙二醇(PEG(PEG，MW2000)MW2000)。(8)(8)纯化的特异性抗
29、体或抗纯化的特异性抗体或抗IgGIgG抗体。抗体。(9)HRP(RZ3.0)(9)HRP(RZ3.0)。(10)Sephadex G-25(10)Sephadex G-25层析柱层析柱(2cm(2cm50cm)50cm)。(11)(11)搅拌器，分光光度计，离心机。搅拌器，分光光度计，离心机。(12)(12)透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。3 3、标记步骤、标记步骤(1)(1)称取称取HRP 25mgHRP 25mg溶于溶于1.251.25戊二醛戊二醛溶液中，于室温静置过夜。溶液中，于室温静置过夜。(2)(2)反应后的酶溶液经反应后的酶溶液经Sephadex
30、 G-25Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在在1ml/1ml/分钟，收集棕色流出液。如体分钟，收集棕色流出液。如体积大于积大于5ml5ml，则以，则以PEGPEG浓缩至浓缩至5ml5ml。放置。放置25ml25ml小烧杯中，缓慢搅拌。小烧杯中，缓慢搅拌。(3)(3)将待标记的抗体将待标记的抗体12.5mg12.5mg用用生理盐水生理盐水稀释至稀释至5ml5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。，搅拌下逐滴加入酶溶液中。(4)(4)用用1M PH9.51M PH9.5碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液0.25ml0.25ml，继续搅拌继续搅拌3 3小时。小
31、时。(5)(5)加加0.2M0.2M赖氨酸赖氨酸0.25ml0.25ml，混匀后，置室，混匀后，置室 温温2 2小时。小时。(6)(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置置4 14 1小时。小时。(7)(7)3000rpm3000rpm离心离心30min30min，弃上清。沉淀物，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量于少量0.15M PH7.40.15M PH7.4的的PBSPBS中。中。(8)(8)将上述溶液装入透析袋中，对将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.40.15M PH7.4的的PBSP
32、BS缓冲盐水透析，缓冲盐水透析，去除铵离子后去除铵离子后(用萘氏试剂检测用萘氏试剂检测)，10000rpm10000rpm离心离心3030分钟去除沉淀，分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。冰冻保存。4 4、结果判定结果判定(1)(1)定性及效价滴定定性及效价滴定:用特异性抗原用特异性抗原(或抗体或抗体)同酶标记抗体同酶标记抗体(或抗免疫球或抗免疫球蛋白抗体蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接可初步鉴定其活性。最后以直接ELIS
33、AELISA法法(或在正式实验系统里或在正式实验系统里)对酶对酶结合物进行滴定。结合物进行滴定。(2)(2)定量和克分子比值测定定量和克分子比值测定 可用分光光度可用分光光度计测定计测定(光程光程1cm)1cm)。酶量酶量(mg(mgml)ml)OD403nmOD403nm0.4 0.4 IgG IgG量量(mg(mgml)ml)OD280nm-OD280nm-OD403nm OD403nm0.42)0.42)0.940.940.620.62 (三三)注意事项注意事项 1.1.在具备高质量在具备高质量HRPHRP的条件下，的条件下，所要标记的抗所要标记的抗体也要活性高体也要活性高,效价高效价高
34、(最低最低116),116),纯度高纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。活性好的首要条件。2.2.所使用试剂的所使用试剂的PHPH和浓度和浓度及用量必须严格及用量必须严格掌握。掌握。所用试剂，最好所用试剂，最好(或必需或必需)新鲜配制新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体(杂杂质质)。否则，影响标记效果。否则，影响标记效果。3.3.室温搅拌时室温搅拌时须避光须避光，室内温度一般在，室内温度一般在2525为宜。标记物每次为宜
35、。标记物每次透析前透析前，须认，须认真检查，防止漏液。真检查，防止漏液。4.4.浓的标记物相当稳定，常加入浓的标记物相当稳定，常加入30304040甘油于甘油于-10-10下保存。下保存。44可保存可保存1 12 2年，但稀释成年，但稀释成110110，只能保存数周。，只能保存数周。已配制的使用液应在已配制的使用液应在1212小时内用完。小时内用完。切忌反复冻融。切忌反复冻融。三、酶免疫技术类型和应用三、酶免疫技术类型和应用 酶免疫技术按照抗原抗体系统是定酶免疫技术按照抗原抗体系统是定位于组织细胞上还是存在于液体样品位于组织细胞上还是存在于液体样品中分为中分为酶免疫组化技术和酶免疫测定酶免疫组
36、化技术和酶免疫测定（EIAEIA）。）。酶免疫测定分为酶免疫测定分为 均相酶免疫测定和异相酶免疫测定。均相酶免疫测定和异相酶免疫测定。1 1、酶免疫增强测定技术（、酶免疫增强测定技术（EMITEMIT）2 2、克隆酶供体免疫分析（、克隆酶供体免疫分析（CEDIACEDIA）（二）异相酶免疫测定（二）异相酶免疫测定1 1、酶联免疫吸附试验、酶联免疫吸附试验2 2、酶联免疫斑点试验、酶联免疫斑点试验3 3、生物素亲和素、生物素亲和素ELISAELISA4 4、发光酶免疫测定、发光酶免疫测定（一）均相酶免疫测定（一）均相酶免疫测定 1 1、酶联免疫吸附试验、酶联免疫吸附试验(enzyme linke
37、d immunosorbent assay,ELISA)是酶免疫测定中应用最广的技术，是酶免疫测定中应用最广的技术，用于测定用于测定可溶性抗原或抗体可溶性抗原或抗体。将已知抗原或抗体吸附在固将已知抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原面，使抗原-抗体反应在固相表面进抗体反应在固相表面进行，借助洗涤将固相上的抗原行，借助洗涤将固相上的抗原-抗体抗体复合物与液相中游离成分分离。复合物与液相中游离成分分离。酶标仪酶标仪 (1)(1)间接法：间接法：用于测定抗体。先将抗原被覆，洗涤后加待检血清，充分漂洗后加入酶标记的抗抗体，洗后即可供显色观察。(2)双
38、抗体夹心法：先用抗体(IgG)被覆，加待检抗原，作用洗涤后，加酶标记抗体。（3 3）竞争法）竞争法 即可检测即可检测抗原抗原又可检测又可检测抗体抗体。它是。它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的的限量抗体（抗原）结合限量抗体（抗原）结合，待测抗原，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，标记复合物少，因此，显色程度与待显色程度与待测物含量成反比测物含量成反比。竞争法竞争法待测样本待
39、测样本酶标抗体酶标抗体底底 物物终止液终止液2 2、酶联免疫斑点试验、酶联免疫斑点试验(ELISPOTELISPOT)原理：原理：将将抗细胞因子抗体抗细胞因子抗体包被固相载包被固相载体，加入不同来源的细胞，细胞分泌的体，加入不同来源的细胞，细胞分泌的细胞因子与包被抗体结合，在细胞周围细胞因子与包被抗体结合，在细胞周围形成抗体形成抗体-抗原（细胞因子）复合物。抗原（细胞因子）复合物。然后加入相应酶标记的抗细胞因子抗体，然后加入相应酶标记的抗细胞因子抗体，通过底物显色反应测定结合在固相载体通过底物显色反应测定结合在固相载体上的细胞因子量，并可在光镜下观察分上的细胞因子量，并可在光镜下观察分泌细胞因
40、子的细胞。泌细胞因子的细胞。3 3、BAS-ELISABAS-ELISA 生物素（生物素（biotinbiotin）是广泛分布于动、植）是广泛分布于动、植物体内的一种生长因子，又称辅酶物体内的一种生长因子，又称辅酶R R或维生或维生素素H H。亲和素。亲和素(avidin)(avidin)是卵白及某些微生物是卵白及某些微生物中的一种蛋白质。生物素与亲和素间具有中的一种蛋白质。生物素与亲和素间具有高度亲和力，且均能偶联高度亲和力，且均能偶联抗体、抗原和辣抗体、抗原和辣根过氧化物酶根过氧化物酶而不影响其生物学活性。在而不影响其生物学活性。在生物素生物素-亲和素系统亲和素系统(biotin avid
41、in(biotin avidin system,BAS)system,BAS)中，借助所形成的亲和素中，借助所形成的亲和素-生生物素物素-酶复合物，追踪生物素标记的抗原或酶复合物，追踪生物素标记的抗原或抗体，通过酶催化底物显色，可检出相应抗体，通过酶催化底物显色，可检出相应抗体或抗原。抗体或抗原。生物素酶标亲合素系统反应示意图生物素酶标亲合素系统反应示意图4 4、发光酶免疫测定发光酶免疫测定 与一般与一般EIAEIA的区别是酶所催化的的区别是酶所催化的底物是底物是发光剂发光剂。产物不是一般。产物不是一般EIAEIA的有色物质，的有色物质，而是发光产物，所发出的光可用特定的仪而是发光产物，所发出
42、的光可用特定的仪器测定。常用的酶是器测定。常用的酶是HRPHRP和和APAP，HRPHRP的发光的发光底物有鲁米诺及衍生物、对底物有鲁米诺及衍生物、对-羟基苯乙酸；羟基苯乙酸；APAP的底物为的底物为3-3-（2 2-螺旋金刚烷）螺旋金刚烷）-4-4-甲氧甲氧基基-(3-(3-磷酸氧基磷酸氧基)-)-苯基苯基-1-1，2-2-二氧乙烷和二氧乙烷和4-4-甲基伞形酮磷酸盐。甲基伞形酮磷酸盐。四、四、酶免疫技术实验示例酶免疫技术实验示例酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 （Enzyme Linked Immunosorbent Enzyme Linked Immunosorbent Assay,EL
43、ISAAssay,ELISA）双抗体夹心法检测双抗体夹心法检测HBsAgHBsAg【原原 理理】以特异性抗体以特异性抗体(抗抗-HBs)-HBs)致敏载体表致敏载体表面，然后将含有抗原的标本与致敏的面，然后将含有抗原的标本与致敏的载体一起孵育，洗去过量溶液。再加载体一起孵育，洗去过量溶液。再加人酶标特异抗体人酶标特异抗体(酶标抗酶标抗-HBs)-HBs)。酶标。酶标抗体就连接到已结合于抗体致敏的载抗体就连接到已结合于抗体致敏的载体表面的抗原上，孵育后，洗去过量体表面的抗原上，孵育后，洗去过量的结合物。最后加底物溶液，根据颜的结合物。最后加底物溶液，根据颜色反应来判定抗原含量。色反应来判定抗原含
44、量。【材材 料料】HBsAg HBsAg试剂盒，本试剂盒采用双试剂盒，本试剂盒采用双抗体夹心法检测抗体夹心法检测HBsAgHBsAg，适用于适用于血血清或血浆清或血浆标本，具有快速简便，特标本，具有快速简便，特异性强，灵敏度高，重复性好，所异性强，灵敏度高，重复性好，所需标本量少等优点。需标本量少等优点。试剂盒含试剂盒含:1 1、包被抗包被抗-HBs-HBs反应条反应条1 1板板 2 2、酶结合物酶结合物 1 1瓶瓶 3 3、HBsAgHBsAg阳性对照阳性对照1 1瓶瓶 4 4、HBsAgHBsAg阴性对照阴性对照1 1瓶瓶 5 5、洗涤液洗涤液:用前每瓶作用前每瓶作1 1：2020稀释稀释
45、1 1瓶瓶 6 6、显色剂（显色剂（TMBTMB）A A 1 1瓶瓶 7 7、显色剂（显色剂（TMBTMB）B B1 1瓶瓶 8 8、终止液终止液 1 1瓶瓶 【方方 法法】1 1、加人待测标本加人待测标本 每孔每孔5050微升微升，并设并设HBsAgHBsAg阳性对照阳性对照2 2孔孔，HBsAgHBsAg阴性对照阴性对照2 2孔，空白对照孔，空白对照1 1孔，然后加入酶结合物孔，然后加入酶结合物每孔每孔1 1滴滴 (50(50微升、空白对照孔不加微升、空白对照孔不加)，充分混匀后置充分混匀后置3737孵育孵育3030分钟。分钟。2 2、手工洗板：手工洗板：弃去反应条孔内液体、弃去反应条孔内
46、液体、拍干、用洗涤液注满每孔，弃去拍干，拍干、用洗涤液注满每孔，弃去拍干，反复五次后拍干。反复五次后拍干。(洗板机洗板：选择洗涤五次程序洗板，洗板机洗板：选择洗涤五次程序洗板，洗涤液注满每孔，浸泡时间不短于洗涤液注满每孔，浸泡时间不短于2020秒，洗涤程序完成后拍干。秒，洗涤程序完成后拍干。)3 3、加显色剂：加显色剂：先加显色剂先加显色剂A A每孔每孔1 1滴滴 (50(50微升微升)，然后再加显色剂，然后再加显色剂B B每孔每孔1 1滴滴 (约约5050微升，混匀，微升，混匀，3737孵育孵育1010分钟。分钟。【结果判断结果判断】比色法：比色法：每孔加终止液每孔加终止液1 1滴滴 (50
47、(50微升微升)，混匀，混匀，波长波长450nm450nm，先用空白孔校零点，然后，先用空白孔校零点，然后读取各孔光密度值样品读取各孔光密度值样品ODOD值值2.12.1判断判断为阳性，否则为阴性。为阳性，否则为阴性。备注：备注：阴性对照平均阴性对照平均ODOD值值 低于低于0.050.05作作0.050.05计算，高于计算，高于0.050.05按实际按实际ODOD值计算。值计算。【注意事项注意事项】1 1、试剂盒置试剂盒置2288保存。保存。2 2、使用前试剂应摇匀，并弃去使用前试剂应摇匀，并弃去1 12 2滴滴后垂直滴加。后垂直滴加。3 3、从冷藏环境中取出试剂盒内全部瓶从冷藏环境中取出试
48、剂盒内全部瓶装试剂及待测标本所需微孔条，置室装试剂及待测标本所需微孔条，置室温平衡温平衡3030分钟后再行测试，余者应及分钟后再行测试，余者应及时封存于冰箱中以备后用。时封存于冰箱中以备后用。4 4、待测标本不可用待测标本不可用NaN3NaN3防腐。防腐。5 5、不同批号试剂请勿通用。不同批号试剂请勿通用。6 6、结果判断须在结果判断须在1010分钟内完成。分钟内完成。7 7、若浓缩洗涤液出现结晶时，请置若浓缩洗涤液出现结晶时，请置 3737至溶解。至溶解。第四节第四节 放射免疫技术放射免疫技术 一、原理与方法一、原理与方法（一）原理（一）原理 放射免疫分析法（放射免疫分析法（radioimm
49、unoassay RIAradioimmunoassay RIA）应用竞争性结合的原理，应用放射性同素应用竞争性结合的原理，应用放射性同素标记抗原（或抗体）与相应抗体（或抗原）结标记抗原（或抗体）与相应抗体（或抗原）结合，通过测定抗原抗体结合物的放射活性判断合，通过测定抗原抗体结合物的放射活性判断结果。结果。本方法可进行超微量分析，敏感性高，可用本方法可进行超微量分析，敏感性高，可用于测定抗原、抗体、抗原抗体复合物。于测定抗原、抗体、抗原抗体复合物。放射免疫标记技术常用的同位素放射免疫标记技术常用的同位素有有125125和和1311311 1、液相法、液相法 将待检标本（例如含胰岛素抗原）将待
50、检标本（例如含胰岛素抗原）与定时的同位素标记的胰岛素（抗原）与定时的同位素标记的胰岛素（抗原）和定时的抗胰岛素抗体混合，经一定和定时的抗胰岛素抗体混合，经一定作用时间后，分离收集抗原抗体复合作用时间后，分离收集抗原抗体复合物及游离的抗原，测定这两部分的放物及游离的抗原，测定这两部分的放射活性，计算结合率。射活性，计算结合率。放射免疫分析常用的有放射免疫分析常用的有液相法液相法和和固相法固相法两种两种（二）方法2 2、固相法、固相法 将抗原或抗体吸附到固相载体表面，将抗原或抗体吸附到固相载体表面，然后加待检标本，最后加标记抗体测然后加待检标本，最后加标记抗体测定固相载体的放射活性。常用的固相定固
