1、免疫组织化学及其在临床病理中的应用免疫组化室常用小设备免疫组化室常用小设备n冰箱(4、-18)；贮存免疫组化试剂用。n高压锅，电炉(1000-1500W)或微波炉(700-800瓦)(抗原修复用，可任选一种)，1000ml烧杯；n孵育盒、塑料耐高温切片架；n冲洗瓶、定时器、塑料试管、5-10ml玻璃试管等；n100l、200 l、20 l 可调微量移液器各1支；相应的吸嘴。n磨砂玻片；n空调1台；n恒温箱1台；npH计1台(PHS-25型)。全自动免疫组化染色机二、免疫酶标技术20世纪70年代建立80年代为发展高峰90年代在国、内外病理科广泛应用n将抗原和抗体反应与酶的催化反应相结合而建立的一
2、种免疫检测技术。n先用结合剂（戊二醛）将酶结合在抗体分子的氨基或羟基上而形成酶标记抗体。n然后和相应抗原反应，使抗原抗体复合物上带有酶分子，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或有一定电子密度的颗粒，在光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。2.1）酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，可在光镜和电镜下观察。2）所形成的终产物沉淀必须稳定，不向周围弥散。3）中性PH值时酶应稳定，酶标记后活性不改变。3 3、免疫酶技术中常用的标记酶免疫酶技术中常用的标记酶常用方法常用方法四、免疫组化常用方法四、免疫组化常用方法1、直接法将酶直接标记在一抗 2、间接法将酶标记在二抗，常用
3、 3、PAP法、ABC法复合物4、SP法 5、多重免疫组化染色法 1、直接法（酶标记）将酶（以HRP为例）标记在特异抗体上，然后用酶标抗体直接与相应抗原特异结合。形成抗原抗体酶复合物，最后用底物显色剂显色。2、间接法直接法直接法间接法间接法二抗二抗一抗一抗抗原抗原酶酶34、ABC法：法：卵白素生物素过氧化物酶连结法（avidin biotin-peroxidase complex technique,ABC）利用卵白素（avidin）与生物素（Biotin）特有的高度亲和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过氧化物酶（HRP）结合，形成生物素化HRP，然后与卵白素按一定比例混合，形成ABC复合物
4、。用生物素二抗与第一抗体结合，再与ABC复合物联结形成抗原抗体生物素二抗ABC。最后用底物显色剂显色。国外其他公司亦将此法注册为LSAB法，LABSA法和SABC法等用链霉菌抗生物素蛋白代替ABC复合物中的卵白素蛋白即形成SP法。染色原理同ABC法。SP放大系统比传统的PAP、ABC方法更为简便、敏感、特异、低背景。6.多重免疫组化方法多重免疫组化方法原理：根据各个染色系统显色剂的不同加以组合。应用：目前主要为双重染色，用于临床诊断或科研。乳腺癌ki-67和EMA双标记基本过程基本过程（SPSP法）法）（一）（一）标本的取材和固定原则：原则：取材新鲜、及时固定、取材新鲜、及时固定、形态的完好、
5、形态的完好、抗原性不丢失抗原性不丢失。1）取材：）取材：新鲜组织及时取材，部位合适，新鲜组织及时取材，部位合适，工具锋利，大小薄厚合适工具锋利，大小薄厚合适2）固定：）固定：及时固定，选用合适固定液及时固定，选用合适固定液 新鲜组织及时放入液氮或低温冰箱新鲜组织及时放入液氮或低温冰箱（二）常用固定液 温度：一般温度为7037之间，其中以 室温（22）为常用。浓度：10%中性福尔马林（4%甲醛）浓度最合适，乙醇最常用95%。100%反而固定能力较差。丙酮一般原浓度。复合固定液的浓度都较单独用低。时间：固定时间要视组织块的大小，固定液的 种类及浓度、固定所处的温度等而定。原则上，组织块大小与固定时
6、间成正 比。目的：防止掉片 原因：许多抗体需要进行抗原修复（微 波或高压）。现有试剂：防脱片白胶（Elmers Glue）多聚赖氨酸（poly-l-lysin）防脱片剂（Apes）等，后两者的效果比前者好。3.原因：当待检抗原是存在细胞内或有膜 被、而抗体是大分子的时候，抗体 就很难通过细胞的质膜顺利达到接 触抗原。办法：用净化剂（即表面活性剂三硝基甲 苯）TritonX100溶解于PBS中，液 体浸洗组织切片或涂片。Ki-67，乳腺癌，Ki-67阳性定位胞核，DAB显色，苏木素复染，福尔马林固定，石蜡包埋。SP X 200 尖锐湿疣尖锐湿疣 HPV二、免疫组化在诊断中的应用原则二、免疫组化在
7、诊断中的应用原则5.正确评价免疫组化结果：结果受抗体质量、特异性，技术操作，标本固定等因素影响；6.合理选择抗体：既要达到目的，又要节约的原则，分1、2、3线抗体；7.待检标本抗原保存要好：要求快速、新鲜、充分的固定，合适的固定剂，普通福尔马林固定液应进行抗原修复。腺上皮腺上皮CK标记阳性标记阳性低分化腺癌低分化腺癌 CK标记阳性标记阳性EMA大网膜上低分化癌大网膜上低分化癌 CEA标记阳性标记阳性AFP标记胞浆阳性标记胞浆阳性HMB45阳性阳性,恶性黑色素瘤恶性黑色素瘤Vimentin胞浆阳性胞浆阳性组织中平滑肌组织中平滑肌Actin标记阳性标记阳性高分化平滑肌肉瘤，瘤细胞及血管壁高分化平滑
8、肌肉瘤，瘤细胞及血管壁Actin阳性阳性血管壁平滑肌血管壁平滑肌Actin阳性阳性组织细胞组织细胞CD68胞浆阳性胞浆阳性Mac387,组织细胞肉瘤组织细胞肉瘤血管内皮细胞血管内皮细胞CD34阳性阳性树突状细胞树突状细胞 S-100阳性阳性n神经细丝蛋白（neurofiaments，NF）：神经元特异性中间丝蛋白；中枢、外周神经元及其肿瘤阳性标记；n神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）：仅存在于神经元细胞和神 经内分泌细胞。n嗜铬素A（chromogranin A，CgA）：仅存 在于神经元细胞和神经内分泌细胞。n突触素（synaptophysin，S
9、yn）：神经元突触 前小泡膜蛋白，广泛存在于神经、肌肉突触处。胰岛胰岛CgA标记阳性标记阳性胰岛胰岛Syn标记标记淋巴瘤淋巴瘤LCA标记标记B细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤CD20膜阳性膜阳性间变性大细胞性淋巴瘤间变性大细胞性淋巴瘤ALK膜阳性膜阳性何杰金淋巴瘤何杰金淋巴瘤R-S细胞细胞CD30阳性阳性（九）与临床治疗有关的标记：（九）与临床治疗有关的标记：Her-2（+）Her-2（+）Her-2（+）Her-2（+）Her-2（+）ER（+）CD117()，CD34()，Vimentin()，Actin()，Desmin()，S-100()；（十）肿瘤细胞增殖活性：肿瘤细胞肿瘤细胞PCNA核阳性核阳性四、免疫组化在临床病理四、免疫组化在临床病理中的鉴别诊断作用中的鉴别诊断作用淋巴瘤非霍奇金淋巴瘤霍奇金淋巴瘤T细胞淋巴瘤B细胞淋巴瘤前驱T周围（成熟）T前驱B周围（成熟）BCD30+CD15+B细胞淋巴瘤可加入其它分型抗体标记物T细胞或NK细胞淋巴瘤可加入其他分型标记物非淋巴造血系统肿瘤浆细胞瘤淋巴母髓性白血病霍奇金淋巴瘤某些T淋巴瘤（三）、恶性肿瘤耐药基因蛋白检测（三）、恶性肿瘤耐药基因蛋白检测与临床用药参考与临床用药参考Thank you
