1、 第第 四四 章章 酶酶化学（化学（EnzymeEnzyme)学习目的与要求：学习目的与要求：1.酶的酶的概念概念及发展及发展分类及命名分类及命名 5.酶作用的机制酶作用的机制2.酶催化作用的特点酶催化作用的特点 6.酶促反应的速度及其影响因素酶促反应的速度及其影响因素3.3.酶的化学本质及组成酶的化学本质及组成 7.酶的分离纯化与酶活力测定酶的分离纯化与酶活力测定4.4.酶结构与其生物活性的关系酶结构与其生物活性的关系 重点：重点：1.1.酶的化学本质及组成酶的化学本质及组成 4.酶促反应的速度及其影响因素酶促反应的速度及其影响因素2.2.酶结构与其生物活性的关系酶结构与其生物活性的关系 5
2、.酶的分离纯化与酶活力测定酶的分离纯化与酶活力测定3.酶作用的机制酶作用的机制难点：难点：1.酶作用的机制酶作用的机制 3.3.抑制剂对酶反应的影响抑制剂对酶反应的影响2.2.底物浓度对酶促反应速度影响底物浓度对酶促反应速度影响 4.4.酶活力测定酶活力测定第一节、酶的概念，分类及命名第一节、酶的概念，分类及命名一一.酶的概念及发展酶的概念及发展 酶酶是一类由活性细胞产生的具有催化作用和高度专一是一类由活性细胞产生的具有催化作用和高度专一性的特殊性的特殊蛋白质蛋白质。简单说，酶是一类由活性细胞产生的。简单说，酶是一类由活性细胞产生的生生物催化剂物催化剂。酶的概念酶的概念发展史发展史(1)(1)
3、酶是蛋白质酶是蛋白质:1926 1926年年,James Summer,James Summer由刀豆制出脲酶结晶确立酶是蛋白质的由刀豆制出脲酶结晶确立酶是蛋白质的观念，其具有蛋白质的一切性质。观念，其具有蛋白质的一切性质。(2)(2)核酶的发现：核酶的发现：1981198119821982年，年，Thomas R.CechThomas R.Cech实验发现有催化活性的天然实验发现有催化活性的天然RNARNARibozymeRibozyme。L19 RNAL19 RNA和核糖核酸酶和核糖核酸酶P P的的RNARNA组分具有酶活性是两个最著名的组分具有酶活性是两个最著名的例子。例子。199519
4、95年，发现年，发现DNADNA的催化活性。的催化活性。(3)(3)抗体酶（抗体酶（abzymeabzyme）：）：19861986年，年，Richard LerrurRichard Lerrur和和Peter SchaltzPeter Schaltz运用单克隆抗体技运用单克隆抗体技术制备了具有酶活性的抗体（术制备了具有酶活性的抗体（catalytic antibodycatalytic antibody）。）。CH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOOHONADH二二.酶的分类酶的分类n氧化氧化-还原酶催化氧化还原酶催化氧化-还原反应。还原反应。n主要包括脱氢酶主要包括脱氢酶(Dehy
5、drogenaseDehydrogenase)和氧化酶和氧化酶(OxidaseOxidase)。n如，乳酸如，乳酸(Lactate)(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。1.1.氧化氧化-还原酶还原酶 OxidoreductaseOxidoreductaseCH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH2CH3CCOOHO转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。移到另一个底物的分子上。例如，例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。
6、谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。2.2.转移酶转移酶 TransferaseTransferaseH2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OHn水解酶催化底物的加水分解反应。水解酶催化底物的加水分解反应。n主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。n例如，脂肪酶例如，脂肪酶(Lipase)(Lipase)催化的脂的水解反应催化的脂的水解反应3.3.水解酶水解酶 HydrolaseHydrolaseHOOCCH=CHCOOHH2OHOOCCH2CHCOOHOHn裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或 原子形成双键的反原
7、子形成双键的反应及其逆反应。应及其逆反应。n 主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。n 例如，例如，延胡索酸水合酶催化的反应。延胡索酸水合酶催化的反应。4.裂解酶裂解酶 LyaseLyaseOCH2OHOHOHOHOHOCH2OHCH2OHOHOHOH异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。子的重排过程。例如，例如，6-6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。5.异构酶异构酶 IsomeraseIsomerasen合成酶，又称为连接酶，能够催化合成酶，又称为连
8、接酶，能够催化C-CC-C、C-OC-O、C-N C-N 以及以及C-S C-S 键的键的形成反应。这类反应必须与形成反应。这类反应必须与ATPATP分解反应相互偶联。分解反应相互偶联。A+B+ATP+H-O-H=A A+B+ATP+H-O-H=A B+ADP+Pi B+ADP+Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反应例如，丙酮酸羧化酶催化的反应 丙酮酸丙酮酸 +COCO2 2 草酰乙酸草酰乙酸6.6.合成酶合成酶 Ligase or SynthetaseLigase or Synthetase三三.酶的命名酶的命名（1 1）根据其催化底物来命名；）根据其催化底物来命名；（2 2）根据所催化反应的性
9、质来命名；）根据所催化反应的性质来命名；（3 3）结合上述两个原则来命名；）结合上述两个原则来命名；（4 4）有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点。）有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点。1.1.习惯命名法习惯命名法2.2.国际系统命名法国际系统命名法n系统名称包括底物名称、构型、反应性质系统名称包括底物名称、构型、反应性质,2,2个底物，底物个底物，底物之间之间“：”，水解酶水解，水解酶水解2 2字可省略，最后加一个酶字。字可省略，最后加一个酶字。例如：例如：(习惯名称习惯名称:谷丙转氨酶谷丙转氨酶)系统名称系统名称:L-:L-丙氨酸丙氨酸 ：-酮戊二酸氨基转移酶酮戊二酸氨基转移
10、酶 酶催化的反应酶催化的反应:谷氨酸谷氨酸 +丙酮酸丙酮酸 -酮戊二酸酮戊二酸 +丙氨酸丙氨酸四四.酶的编号酶的编号例如：例如：RNaseT1-EC3148 EC -EC -酶酶 3 -3 -水解酶水解酶 1 -1 -脂键脂键 4 -4 -磷酸二酯键磷酸二酯键 8 -8 -编号（第编号（第8 8个）个）第二节、酶催化作用的特点一.酶和一般催化剂的共性及酶催化作用特性酶和一般催化剂的共性及酶催化作用特性1.1.酶和一般催化剂的酶和一般催化剂的共性共性：n加快反应速度；加快反应速度；n不改变平衡常数；不改变平衡常数；n自身不参与反应。自身不参与反应。2.2.酶催化作用酶催化作用特性特性：n条件温和
11、条件温和：常温、常压、：常温、常压、pH=7pH=7；n高效率高效率：反应速度与不加催化剂相比可提高：反应速度与不加催化剂相比可提高10108 8 10102020，与加普通催化剂相比可提高，与加普通催化剂相比可提高10107 710101313；n专一性专一性：即酶只能对特定的一种或一类底物起作用。：即酶只能对特定的一种或一类底物起作用。n易变敏感性易变敏感性：易受各种因素的影响。：易受各种因素的影响。n酶的活性调节控制酶的活性调节控制：受在活细胞内受到精密严格的调节控制。：受在活细胞内受到精密严格的调节控制。n酶分子代谢更新：酶分子代谢更新：二二.专一性专一性1.1.绝对专一性绝对专一性有
12、些酶只作用于一种底物，催化一个反应，有些酶只作用于一种底物，催化一个反应，而不作用于任何其它物质。而不作用于任何其它物质。2.2.相对专一性相对专一性这类酶对结构相近的一类底物都有作用。这类酶对结构相近的一类底物都有作用。3.3.立体异构专一性立体异构专一性簇（基团）专一性簇（基团）专一性键专一性键专一性旋光异构专一性。旋光异构专一性。几何异构专一性几何异构专一性第三节、酶的化学本质及组成第三节、酶的化学本质及组成一一.酶的化学本质酶的化学本质1.1.由由基本组成单位氨基酸基本组成单位氨基酸2.2.具有具有蛋白质的性质蛋白质的性质-两性离解性质等两性离解性质等3.3.具具有有双缩脲反应双缩脲反
13、应二二.酶的组成酶的组成全酶全酶(holoenzyme(holoenzyme）=酶蛋白酶蛋白 +辅因子辅因子单成份酶单成份酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。（简单蛋白质简单蛋白质）双成份酶双成份酶（结合蛋白质）（结合蛋白质）酶酶 酶蛋白酶蛋白（apoenzymeapoenzyme）辅因子辅因子（cofactercofacter)辅酶辅酶（coenzyme)coenzyme)辅基辅基(prosthetic group)prosthetic group)三三.酶的辅因子酶的辅因子酶的辅因子是酶的对热稳定的非蛋白小分子物质部分，酶的辅因子是酶的对热稳定的非
14、蛋白小分子物质部分，其主要作用是作为电子、原子或某些基团的载体参与反其主要作用是作为电子、原子或某些基团的载体参与反应并促进整个催化过程。应并促进整个催化过程。(1)(1)传递电子体：传递电子体：如如 卟啉铁、卟啉铁、铁硫簇；铁硫簇；(2)(2)传递氢（递氢体）：传递氢（递氢体）：如如 FMN/FADFMN/FAD、NAD/NADPNAD/NADP、C C0 0Q Q、硫辛酸；、硫辛酸；(3)(3)传递酰基体：传递酰基体：如如 C C0 0A A、TPPTPP、硫辛酸；、硫辛酸；(4)(4)传递一碳基团：传递一碳基团：如如 四氢叶酸；四氢叶酸；(5)(5)传递磷酸基：传递磷酸基：如如 ATPA
15、TP，GTPGTP；(6)(6)其它作用：其它作用：转氨基，如转氨基，如 V VB6 B6；传递传递COCO2 2，如，如 生物素。生物素。第四节第四节 酶分子结构与其生物活性的关系酶分子结构与其生物活性的关系一.酶分子结构酶分子结构根据结构不同酶可分为根据结构不同酶可分为单体酶单体酶：只有单一的三级结构蛋白质构成。：只有单一的三级结构蛋白质构成。寡聚酶寡聚酶：由多个（两个以上）具有三级结构的亚基聚合而成。：由多个（两个以上）具有三级结构的亚基聚合而成。多酶复合体多酶复合体：由几个功能相关的酶嵌合而成的复合体。：由几个功能相关的酶嵌合而成的复合体。二二.活性中心活性中心活性中心：酶分子中直接和
16、底物结合活性中心：酶分子中直接和底物结合并起催化反应的空间局限（部位）。并起催化反应的空间局限（部位）。催化部位催化部位(Catalytic site):):酶分子中促使酶分子中促使底物发生化学变化的底物发生化学变化的部位称为催化部位。部位称为催化部位。l通常将酶的结合部通常将酶的结合部位和催化部位总称为位和催化部位总称为酶的活性部位或活性酶的活性部位或活性中心。中心。l结合部位决定酶的结合部位决定酶的专一性，专一性，l催化部位决定酶所催化部位决定酶所催化反应的性质。催化反应的性质。调控部位调控部位(Regulatory siteRegulatory site):):酶分子中存在着一酶分子中存
17、在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用抑制作用三三.必须基团必须基团酶表现催化活性不可缺少的基团。酶表现催化活性不可缺少的基团。亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。唑基。酸碱性基团：门冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨基，酪酸碱性基团：门冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨基，酪氨酸的酚羟基，组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。氨酸的酚羟基，组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。H2NCHC
18、CH2OHOOHOHH2NCHCCH2OHOSHSHH2NCHCCH2OHONNHNNHH2NCHCCH2OHOCH2COHOH2NCHCCH2OHOCOHOCOOHH2NCHCCH2OHOCH2CH2CH2NH2NH2H2NCHCCH2OHOOHOH第五节、酶作用的机制第五节、酶作用的机制一一.酶催化作用与反应活化能酶催化作用与反应活化能自自由由能能反应进程反应进程产物产物反应物反应物IIIIIII：酶催化反应活化能酶催化反应活化能II：化学催化剂反应活化能化学催化剂反应活化能III：无催化反应活化能：无催化反应活化能二二.酶催化作用的中间产（络合）物学说酶催化作用的中间产（络合）物学说n在
19、酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化生化学变化,中间复合物再分解成产物和酶。中间复合物再分解成产物和酶。E +S =E-S E +S =E-S P +E P +En许多实验事实证明了许多实验事实证明了E ES S复合物的存在。复合物的存在。E ES S复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。三三.使酶具有高效性的机制使酶具有高效性的机制1.1.临近定向效应临近定向效应l在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶促反应中
20、，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度；在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度；l另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点.2.2.“张力张力”和和“形变形变”底物与酶结合诱导酶的分子构象变化，变化的酶分子又使底物分底物与酶结合诱导酶的分子构象变化，变化的酶分子又使底物分子的敏感键产
21、生子的敏感键产生“张力张力”甚至甚至“形变形变”，从而促使酶，从而促使酶底物中间底物中间产物进入过渡态。产物进入过渡态。3.3.酸碱催化酸碱催化l酸酸-碱催化可分为狭义的酸碱催化可分为狭义的酸-碱催化和广义的酸碱催化和广义的酸-碱催化。酶参碱催化。酶参与的酸与的酸-碱催化反应一般都是广义的酸碱催化方式。碱催化反应一般都是广义的酸碱催化方式。l广义酸碱催化是指通过质子酸提供部分质子广义酸碱催化是指通过质子酸提供部分质子,或是通过质子或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程。碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程。l酶活性部位上的某些基团可以作为良好的质子供体或受体对酶活
22、性部位上的某些基团可以作为良好的质子供体或受体对底物进行酸碱催化。底物进行酸碱催化。His His 残基的咪唑基是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。残基的咪唑基是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。-COOH,-NH3,-SH,+OHNHNH+-COO,-NH2,-S,-.-O-NHN:4.4.共价催化共价催化l催化剂通过与底物形成反应催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化。应速度的过程，称为共价催化。l酶中参与共价催化的基团主酶中参与共价催化的基团主要包括要包括
23、His His 的咪唑基，的咪唑基，Cys Cys 的巯基，的巯基，Asp Asp 的羧基，的羧基，Ser Ser 的羟基等。的羟基等。l某些辅酶，如焦磷酸硫胺素某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。价催化作用。四四.酶专一性的机制酶专一性的机制认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样1.1.锁钥假说锁钥假说(lock and key hypothesis)lock and key
24、hypothesis)该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.2.2.诱导契合假说（诱导契合假说（inducedfit hypothesis)inducedfit hypothesis)第六节、酶促反应动力学第六节、酶促反应动力学一一.底物浓度对酶促反应速度影响底物浓度对酶促反应速度影响底物浓度底物浓度对酶促反应速度影响对酶促反应速度影响 在酶浓度，在酶浓度，pHpH，温度等条件不，温度等条件不变的情况下研究底物浓度和反应变的情况下研究底物浓度和反应速度的关系。如右
25、图所示：速度的关系。如右图所示：n在低底物浓度时在低底物浓度时,反应速度与底反应速度与底物浓度成正比，表现为物浓度成正比，表现为一级反应一级反应特征特征。n当底物浓度达到一定值时，底物当底物浓度达到一定值时，底物浓度增加，反应速度增加，表现浓度增加，反应速度增加，表现为为混合级反应特征混合级反应特征n当底物浓度，几乎所有的酶都与当底物浓度，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大底物结合后，反应速度达到最大值（值（V Vmaxmax），此时再增加底物浓），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为度，反应速度不再增加，表现为零级反应零级反应。V=Vmax SKm+S二二.米氏方程米氏方程
26、19131913年，德国化学家年，德国化学家MichaelisMichaelis和和MentenMenten根据根据中间产物学说中间产物学说对对酶促反映的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓酶促反映的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为度和反应速度关系的著名公式，称为米氏方程米氏方程。K Km m 米氏常数米氏常数V Vmaxmax 最大反应速度最大反应速度三三.米氏方程的推导米氏方程的推导V=V m ax S K m +S判断酶的最适底物判断酶的最适底物KmKm最小的底物最小的底物计算一定速度下的底物浓度计算一定速度下的底物浓度V=80%Vma
27、x V=80%Vmax 时，时，(S)=(S)=？由：由：0.8 0.8 Km+0.2(S)=(S),0.8 Km=0.2(S)Km+0.2(S)=(S),0.8 Km=0.2(S)(S)=4 Km (S)=4 Km 又又:V=99%Vmax V=99%Vmax ,(S)=99 Km,(S)=99 Km6.6.了解酶的底物在体内的浓度水平了解酶的底物在体内的浓度水平Km (S)Km (S)7.7.判断反应的方向判断反应的方向KmKm最小的反应最小的反应8.8.判断抑制作用的类型判断抑制作用的类型1 1 K Km 1 1m 1 1 =+V V V Vmax max S S V Vmaxmax五五
28、.米氏常数米氏常数KmKm的的测定测定-4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v1/1/VmaxVmax斜率斜率=Km/=Km/VmaxVmax-1/-1/KmKmV=V m ax S K m +S斜率斜率=-=-KmKm102030405060708090020406080100Tem perature OCRelative Activity(%)最适温度第七节第七节 影响酶促反应速度的因素影响酶促反应速度的因素一一.温度对酶反应的影响温度对酶反应的影响n一方面是温度升高一方面是温度升高,酶促反酶促反应速度加快。应速度加快。n另一方面另一方
29、面,温度升高温度升高,酶的高酶的高级结构将发生变化或变性，级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。导致酶活性降低甚至丧失。n因此大多数酶都有一个因此大多数酶都有一个最适最适温度温度。在最适温度条件下在最适温度条件下,反应速度最大。反应速度最大。二二.pH.pH对酶反应的影响对酶反应的影响n在一定的pH下,酶具有最大的催化活性,通常称此pH为最适pH。速度酶浓度三三.酶浓度对酶反应的影响酶浓度对酶反应的影响在底物足够过量而其它条件固定的情况下，并且反应系在底物足够过量而其它条件固定的情况下，并且反应系统中不含有抑制酶活性的物质及其他不利于酶发挥作用统中不含有抑制酶活性的物质及其他不利于酶
30、发挥作用的因素时，酶促反应的速度和酶浓度成正比的因素时，酶促反应的速度和酶浓度成正比四四.激活剂对酶反应的影响激活剂对酶反应的影响1.1.概念：凡是能提高酶活力的物质概念：凡是能提高酶活力的物质(简单化合物简单化合物)都称为酶的都称为酶的激活剂。激活剂。（activator)activator)。2.2.成分：其中大部分是一些无机离子和小分子简单有机物。成分：其中大部分是一些无机离子和小分子简单有机物。如：如：NaNa+、K K+、CaCa2+2+、MgMg2+2+、CuCu2+2+、ZnZn2+2+、CoCo2+2+、CrCr2+2+、FeFe2+2+、ClCl-、BrBr-、I I-、CN
31、CN-、NONO3 3-、POPO4 4-、GSH GSH、VitCVitC 等；等；3.3.功能：功能：1 1）.这些离子可与酶分子上的氨基酸侧链基团结合，这些离子可与酶分子上的氨基酸侧链基团结合，可能是酶活性部位的组成部分，可能是酶活性部位的组成部分，2 2）.也可能作为辅酶或辅基的一个组成部分起作用；也可能作为辅酶或辅基的一个组成部分起作用；4.4.特点：特点：1 1）.一般情况下，一种激活剂对某种酶是激活剂，而对另一般情况下，一种激活剂对某种酶是激活剂，而对另 一种酶则不一定是激活剂，可能发生抑制作用；一种酶则不一定是激活剂，可能发生抑制作用；2 2）.对于同一种酶，不同激活剂浓度会产
32、生不同的作用。对于同一种酶，不同激活剂浓度会产生不同的作用。五五.抑制剂对酶反应的影响抑制剂对酶反应的影响（一）（一）.酶的抑制作用的概念酶的抑制作用的概念有些物质能与酶分子上某些必须基团结合（作用有些物质能与酶分子上某些必须基团结合（作用),),使酶的使酶的活性中心的化学性质发生改变，导致酶活力下降或丧失，活性中心的化学性质发生改变，导致酶活力下降或丧失，这种现象称为这种现象称为酶的抑制作用酶的抑制作用。n抑制剂：抑制剂：能够引起酶的抑制作用的化合物则称为能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂抑制剂 （inhibitor)inhibitor)。n抑制作用抑制作用的的特点特点：酶的抑制剂一般
33、具备两个方面的：酶的抑制剂一般具备两个方面的特点特点：na.a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。似。nb.b.能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。定的复合体或结合物。（二）（二）.抑制作用的类型抑制作用的类型1.1.不可逆抑制作用不可逆抑制作用抑制剂与酶反应中心的抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失合，引起酶的永久性失活。如有机磷毒剂二异活。如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。丙基氟磷酸酯。2.2.可逆抑制作用
34、：可逆抑制作用：抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑剂抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类：根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类：（1）竞争性抑制：）竞争性抑制：概念：概念：某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促
35、反应被抑制了。在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。特点：特点：竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。竞争能力来消除。竞争性抑制可用下式表示：竞争性抑制可用下式表示：竞争性抑制作用的速度方程：竞争性抑制作用的速度方程：竞争性抑制作用的竞争性抑制作用的LineweaverLineweaverBurkBurk图图 ：（2）非竞争性抑制：）非竞争性抑制：概念：概念：酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的
36、结合，所酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。以称为非竞争性抑制剂。如某些金属离子（如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及）以及EDTA等，通常能与酶分等，通常能与酶分子的调控部位中的子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。抑制。特点：特点：非竟争性抑制不能通过增大底物浓度的方法来消除非竟争性抑制不能通过增大底物浓度的方法来消除。非竞争性抑制可用下式表示：非竞争性抑制可用下式表示：非竞争性抑制作用的速度方程：非竞争性抑制作用的速度方程：非竞争性抑制作用的非竞争性抑制作用的L
37、ineweaverLineweaverBurkBurk图图 ：（3 3）反竞争性抑制：）反竞争性抑制：概念：酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，概念：酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引起酶活性下降。引起酶活性下降。反竞争性抑制可用下式表示：反竞争性抑制可用下式表示：特点：特点：非竟争性抑制不能通过增大底物浓度的方法来消除非竟争性抑制不能通过增大底物浓度的方法来消除。反竞争性抑制作用的速度方程：反竞争性抑制作用的速度方程：反竞争性抑制作用的反竞争性抑制作用的LineweaverLineweaverBurkBurk图图 ：第八节、酶的分离纯化与酶活力测定第八节、酶的分离纯化与酶活力测定
38、一一.酶的分离纯化酶的分离纯化1.1.基本原则基本原则 提取过程中避免酶变性而失去活性提取过程中避免酶变性而失去活性 防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等 要求在低温下操作要求在低温下操作 加入的化学试剂不使酶变性加入的化学试剂不使酶变性 操作中加入缓冲溶液操作中加入缓冲溶液2.2.基本操作程序基本操作程序a.a.选材选材：微生物（微生物发酵物微生物（微生物发酵物:胞内酶，胞外胞内酶，胞外酶），动物（动物器脏：消化酶，血液：酶），动物（动物器脏：消化酶，血液：SODSOD酶，尿酶，尿液：尿激酶等）液：尿激酶等）,植物（木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶植物（木瓜蛋白酶，菠萝蛋白
39、酶等）。等）。b.b.抽提抽提：加入提取液提取。胞内酶先要进行细胞破加入提取液提取。胞内酶先要进行细胞破碎（机械研磨，超声波破碎，反复冻融或自溶等），碎（机械研磨，超声波破碎，反复冻融或自溶等），c.c.分离分离：先进行净化处理（过滤，絮凝，离心脱先进行净化处理（过滤，絮凝，离心脱色），再采用沉淀法分离（盐析法，有机溶剂沉淀色），再采用沉淀法分离（盐析法，有机溶剂沉淀法，超离心等）。法，超离心等）。d.d.纯化纯化：可采用离子交换层析，凝胶过滤，液相色可采用离子交换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等方法。谱，亲和色谱和超滤等方法。3.3.酶的制剂形式酶的制剂形式a.a.固体固体：干燥（
40、冰冻升华，喷雾干燥，真空干燥）：干燥（冰冻升华，喷雾干燥，真空干燥）b.b.液体：液体：溶液溶液4.4.保存保存低温下短期保存低温下短期保存0-40-4（固体）（固体）-20-20-70-70（液体）（液体）二二.酶活力的测定酶活力的测定1.1.酶活力概念酶活力概念酶活力酶活力：又称为酶活性，一般把酶催化一定化学反应的能力称：又称为酶活性，一般把酶催化一定化学反应的能力称为酶活力，通常以在一定条件下酶所催化的化学反应速度来表为酶活力，通常以在一定条件下酶所催化的化学反应速度来表示。酶活力可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的示。酶活力可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量表示
41、，单位为增加量表示，单位为mol/minmol/min等。等。2.2.酶活力的表示方法酶活力的表示方法-酶活力单位酶活力单位酶活力单位的基本定义为：酶活力单位的基本定义为：规定条件（最适条件）下一定时间内催化完成一定化学规定条件（最适条件）下一定时间内催化完成一定化学反应量所需的酶量。反应量所需的酶量。据不同情况有几种酶活力单位（据不同情况有几种酶活力单位（activity unitactivity unit）或又称酶）或又称酶单位（单位（enzyme unitenzyme unit）国际单位国际单位U U（UnitUnit）：是以最佳条件或某一固定条件下每分钟催化）：是以最佳条件或某一固定条
42、件下每分钟催化生成生成1 1molmol产物所需要的酶量为一个酶活力单位。产物所需要的酶量为一个酶活力单位。“Katal“Katal”单位：是指在一定条件下单位：是指在一定条件下1 1秒钟内转化秒钟内转化1mol1mol底物底物所所需的酶量。需的酶量。KatKat和和U U的换算关系：的换算关系：1 1 Kat=6Kat=610107 7U U，1U=16.671U=16.67n n KatKat 以上的酶单位定义中，如果底物（以上的酶单位定义中，如果底物（S S）有一个以上可被作）有一个以上可被作用的化学键，则一个酶单位表示用的化学键，则一个酶单位表示1 1分钟使分钟使1mol1mol有关基
43、团转化有关基团转化的酶量。的酶量。如果是如果是两个相同的分子两个相同的分子参加反应，则每分钟催化参加反应，则每分钟催化2mol2mol底底物物转化的酶量称为一个酶单位。转化的酶量称为一个酶单位。在在“U”U”和和“katkat”酶活力单位的定义和应用中，酶催化底物的酶活力单位的定义和应用中，酶催化底物的分子量必须是已知的，否则将无法计算分子量必须是已知的，否则将无法计算。习惯单位习惯单位在实际使用中，不同酶有各自的规定，如：在实际使用中，不同酶有各自的规定，如：-淀粉酶活力单位：淀粉酶活力单位：每小时分解每小时分解1g1g可溶性淀粉的酶量为可溶性淀粉的酶量为一个酶单位。（一个酶单位。（QB54
44、6-80QB546-80），也有规定每小时分解），也有规定每小时分解1mL2%1mL2%可溶性淀粉溶液为无色糊精的酶量为一个酶单位。显然可溶性淀粉溶液为无色糊精的酶量为一个酶单位。显然后者比前一个单位小。后者比前一个单位小。糖化酶活力单位：糖化酶活力单位：在规定条件下，每小时转化可溶性在规定条件下，每小时转化可溶性淀粉产生淀粉产生1mg1mg还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为一个酶还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为一个酶单位。单位。蛋白酶：蛋白酶：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生1g1g酪氨酸所需的酶量。酪氨酸所需的酶量。DNADNA限制性内切酶：限制性内切
45、酶：推荐反应条件下，一小时内可完全推荐反应条件下，一小时内可完全消化消化1g1g纯化的纯化的DNADNA所需的酶量。所需的酶量。比活力比活力:指每指每mgmg酶蛋白质酶蛋白质/蛋白氮所含的酶活力单位数。蛋白氮所含的酶活力单位数。比活力比活力=U=U或或Kat/mgKat/mg酶蛋白或蛋白氮酶蛋白或蛋白氮(U(U或或Kat/mlKat/ml酶液酶液,或或U U或或Kat/mgKat/mg酶制剂）酶制剂）比活力表示酶制剂的比活力表示酶制剂的纯度纯度的一个指标。的一个指标。4.4.内内(sec.)(sec.)每一每一或或或每或每molmol酶酶5.5.酶活力测定酶活力测定酶活力测定就是测定一定量的酶
46、，在单位时间内产物酶活力测定就是测定一定量的酶，在单位时间内产物(P)(P)的生成（增加）量或底物（的生成（增加）量或底物（S S）的消耗（减少）量。）的消耗（减少）量。即测定时确定三种量：即测定时确定三种量：加入一定量的酶；加入一定量的酶；一定时间间隔；一定时间间隔；物质的增减量。物质的增减量。1 1）.测定酶活力常有以下几种方法测定酶活力常有以下几种方法u反应计时法反应计时法：反应计时必须准确。反应体系必须预热至规定温度后，：反应计时必须准确。反应体系必须预热至规定温度后，加入酶液并立即计时。反应到时，要立即灭酶活性，终止反应，并记加入酶液并立即计时。反应到时，要立即灭酶活性，终止反应，并
47、记录终了时间。终止酶反应。录终了时间。终止酶反应。u常使酶立刻变性最常用的方法：常使酶立刻变性最常用的方法：是加入三氯乙酸或过氯酸使酶蛋白沉淀。是加入三氯乙酸或过氯酸使酶蛋白沉淀。也可用也可用SDSSDS使酶变性，或迅速加热使酶变性。使酶变性，或迅速加热使酶变性。有些酶可用非变性法来停止反应或用破坏其辅因子来停止反应有些酶可用非变性法来停止反应或用破坏其辅因子来停止反应。反应量的测定反应量的测定法：测底物减少量或产物生成量均可。在反应过程法：测底物减少量或产物生成量均可。在反应过程中产物是从无到有，变化量明显，极利于测定，所以大都测定产中产物是从无到有，变化量明显，极利于测定，所以大都测定产物
48、的生成量物的生成量2).2).酶活力测定的分析方法酶活力测定的分析方法具体物质量的测定，据被测定物质的物理化学性质通过定量分具体物质量的测定，据被测定物质的物理化学性质通过定量分析法测定。析法测定。常用的方法有：常用的方法有：光谱分析法光谱分析法：酶将产物转变为（直接或间接）一个可用：酶将产物转变为（直接或间接）一个可用分光光度法分光光度法或荧光光度法或荧光光度法测出的化合物。测出的化合物。化学法化学法：利用化学反应使产物变成一个可用某种物理方法测出的化：利用化学反应使产物变成一个可用某种物理方法测出的化合物，然后再反过来算出酶的活性。合物，然后再反过来算出酶的活性。放射性化学法放射性化学法：
49、用同位素标记的底物，经酶作用后生成含放射性的：用同位素标记的底物，经酶作用后生成含放射性的产物，在一定时间内，生成的放射性产物量与酶活性成正比。产物，在一定时间内，生成的放射性产物量与酶活性成正比。多酶复合体多酶复合体由几个功能相关的酶嵌合而成的复合体。由几个功能相关的酶嵌合而成的复合体。催化同一化学反应，结构与性质不同的一类酶催化同一化学反应，结构与性质不同的一类酶如：人乳酸脱氢酶如：人乳酸脱氢酶LDHLDH1 1 H H4 4 73 2 43 14 10 0 43 12 27.1 73 2 43 14 10 0 43 12 27.1LDHLDH2 2 H H3 3M 24 4 44 34
50、25 0 44 49 34.7M 24 4 44 34 25 0 44 49 34.7LDHLDH3 3 H H2 2M M2 2 3 11 12 35 40 5 12 33 20.9 3 11 12 35 40 5 12 33 20.9LDHLDH4 4 HM HM3 3 0 27 1 5 20 16 1 6 11.7 0 27 1 5 20 16 1 6 11.7LDHLDH5 5 M M4 4 0 56 0 12 5 79 0 0 5.7 0 56 0 12 5 79 0 0 5.7种类种类亚基亚基 活性百分比活性百分比心心 肝肝 肾肾 肺肺 脾脾 肌肉肌肉 红细胞红细胞 白细胞白细胞
