1、V16.2内毒素检查第1页，共18页。内毒素 是G-菌细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源性致热原。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来 内毒素耐热而稳定，抗原性弱。细菌内毒素的主要化学成分为脂多糖 它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热第2页，共18页。内毒素危害 1、致热性。2、致死性毒性。3、Shwartzman反应。（使单核吞噬细胞系统清除激活的凝血因子能力降低，导致局部坏死）4、白细胞减少。5、降低血压，休克 6、激活凝血系统。第3页，共18页。检测方法2015年版 中国药典 第四部 1143细菌内毒素检查法 规定：利用鲎试
2、剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。鲎试剂法凝胶法光度测定法浊度法显色基质法第4页，共18页。鲎试剂 从海洋无脊椎动物“鲎”的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制而成的生物制剂。鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示，即鲎试剂的灵敏度，单位为EU/ml。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。第5页，共18页。鲎试剂反应原理内毒素活化C因子C因子凝固酶原活化B因子B因子凝固酶G因子-葡聚糖活化G因子凝固蛋白原凝固蛋白原第6页，共18页。细菌内毒素国家标准品
3、 系自大肠埃希菌提取精制得到的内毒素，用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，仲裁鲎试剂灵敏度。细菌内毒素工作标准品 系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。细菌内毒素检查用水 指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。第7页，共18页。注意事项 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250C、3 0分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检査的适宜方法（如180，2h）。若使用塑料器具，如微孔板和与微量加样器
4、配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具（30%H2O2 处理4h 有效）。第8页，共18页。试验的干扰 该反应极其灵敏、凝胶形成速率与内毒素浓度成正比 PH值影响细菌内毒素的检测试验的最适pH在68，为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲液调节pH值 温度 反应物中Ca2+/Mg2+离子浓度第9页，共18页。药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定：L=K/M 式中 L 为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/mlEU/mg或EU/U(活性单位）表示；K 为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以 EU/(kgh)表示，注射剂K=5EU/(kgh)，放射性药品注射剂
5、K=2.5EU/(kgh)，鞘内用注射剂K=0.2EU/(kgh)；M 为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kgh),mg/(kg.h)或U/(kgh)表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62m2计算。注射时间若不足1小时，按1小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量(M)第10页，共18页。最大有效稀释倍数(MVD)M V D=c L/式中L 为供试品的细菌内毒素限值；c 为供试品溶液的浓度，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml,当L 以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml。如需计算在MVD时的供试
6、品浓度，即最小有效稀释浓度，可使用公式c=/L;为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml)，或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。第11页，共18页。目的：考察鲎试剂的灵敏度是否准确、考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。鲎试剂灵敏度复核第12页，共18页。鲎试剂灵敏度复核 加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，垂直放入371恒温器中，保温602分钟。结果观察 将试管轻轻取出，缓缓倒转180，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，未形成凝胶或形成的凝
7、胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。第13页，共18页。鲎试剂灵敏度复核 计算：当最大浓度2管均为阳性，最低浓度0.25管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果。c=lg-1（X/4）式中 X 为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。结果判断：当c 在0.52（包括0.5和2）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。第14页，共18页。干扰实验 目的：确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据
8、。当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须进行干扰试验。第15页，共18页。凝胶限度试验编号内毒素浓度/配置内毒素的溶液 平行管数A无/供试品溶液2B2/供试品溶液2C2/检查用水2D无/检查用水2制备溶液A、B、C 和D。使用稀释倍数不超过M V D并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A 和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。第16页，共18页。凝胶限度试验 结果判断：保温60分钟2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效 若溶液A的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定。若溶液A的两个平行管均为阳性，判定供试品不符合规定。若溶液A 的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时溶液A 需做4 支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定，否则判定供试品不符合规定。若供试品的稀释倍数小于MVD而溶液A 出现不符合规定时，需将供试品稀释至MVD 重新实验，再对结果进行判断。第17页，共18页。谢 谢！第18页，共18页。
