1、长沙能润医学检验所邓鹏HLA HLA 基因检测基因检测Table of ContentsTable of Contents什么是HLAMHC、HLA、亚型、关联什么是HLA分型 I型，II型，III型，IV型HLA分型与疾病检测骨髓与器官移植，免疫性疾病，代谢性疾病，神经内科疾病，骨科疾病等 基本概念基本概念 人类白细胞抗原人类白细胞抗原human leukocyte antigen ,HLA MHCMajor histocompatibility complex，主要组织相容性复合体主要组织相容性复合体（包括（包括HLA、H-2、ChLA、RhLA、DLA、SLA、RLA、GpLA、B等）等
2、）1940年代，年代，Snell和和Gorer小鼠间的肿瘤及皮肤移植试验发现：小鼠间的肿瘤及皮肤移植试验发现：决定小鼠间移植排斥与否（即决定小鼠间移植排斥与否（即组织相容性组织相容性）的基因位于的基因位于17号染色体短臂号染色体短臂命名为组织相容性命名为组织相容性-2（H-2）H-2是一个由许多紧密连锁的基因位点构成是一个由许多紧密连锁的基因位点构成的复杂系统的复杂系统1950年代年代Dausset经产妇血清进行经产妇血清进行个体之间抗体与白细胞个体之间抗体与白细胞凝集和细胞毒试验凝集和细胞毒试验发现发现人的人的MHC，命名为，命名为HLA 基因位于第基因位于第6号染色体短臂号染色体短臂 19
3、60年代，年代，Benacerraf 不同品系的豚鼠对一些抗原的免疫应答不同品系的豚鼠对一些抗原的免疫应答能力比较能力比较发现：发现：控制机体对不同抗原的免疫应答能力的控制机体对不同抗原的免疫应答能力的基因（基因（IrIr基因基因）位于）位于MHCMHC基因复合体内。基因复合体内。Benacerraf、Dausset和和Snell三位科学家三位科学家分别从不同角度对分别从不同角度对MHC的免疫遗传学进的免疫遗传学进行的开拓性研究，行的开拓性研究，荣膺荣膺1980年的诺贝尔医学和生理奖。年的诺贝尔医学和生理奖。HLA共分为4型：I型分子包括HLA-A、HLA-B和HLA-C，广泛存在与各种组织细
4、胞中；II型分子包括HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR，存在于B细胞、巨噬细胞和活化T细胞中；III型分子为补体系统，包括C2和C4位点，存在于血清中；IV型分子可能是一些分化抗原，只存在于淋巴细胞、某些细胞毒性T细胞和白细胞中。HLA分型分型 HLA基因系统的多态性及一些主要基因座位的等位基因数基因系统的多态性及一些主要基因座位的等位基因数正式命名显示多态性的正式命名显示多态性的HLA基因座位有基因座位有31个，共个，共2 320个等位基因。个等位基因。图中所图中所示为常见基因座位的等位基因数。示为常见基因座位的等位基因数。及一些主要基因座位的等位基因数及一些主要基因座位的等位基因数正
5、式命名显示多态性的正式命名显示多态性的HLA基因座位有基因座位有31个，共个，共2 320个等位基因。个等位基因。图中所示为常见基因座位的图中所示为常见基因座位的等位基因数。等位基因数。HLA分型的基本检测方法：分型的基本检测方法：细胞学方法测抗原特异性（型）细胞学方法测抗原特异性（型）血清学方法测抗原特异性血清学方法测抗原特异性（型）（型）（微量淋巴细胞毒试验）（微量淋巴细胞毒试验）分子生物学方法测等位基因分子生物学方法测等位基因 PCR/SSP PCR/Luminex PCR/SBT PCR/二代测序二代测序 PCR/流式细胞仪流式细胞仪HLA抗原和等位基因命名抗原和等位基因命名:用血清学
6、及细胞学方法检测抗原特异性用血清学及细胞学方法检测抗原特异性:HLA-B27,HLA-DR4（血清学方法）（血清学方法）HLA-DPw2（细胞学方法）（细胞学方法）用分子生物学方法检测等位基因：用分子生物学方法检测等位基因：HLA-DRB1*04 05 位点名主型等位基因序号HLA-B*27 07例如例如H HLA-B27A-B27H HLA-BA-B*27012701H HLA-BA-B*27022702H HLA-BA-B*27032703H HLA-BA-B*27042704H HLA-BA-B*2705127051H HLA-BA-B*2705227052H HLA-BA-B*2706
7、2706H HLA-BA-B*27072707H HLA-BA-B*27082708H HLA-BA-B*27092709H HLA-BA-B*27102710H HLA-BA-B*27112711.H HLA-BA-B*27232723Loci Considered to be Matched ACBDRDQDP4 M bpFathersMothersHLA:无血源相关 10/10 同胞兄妹 单倍型全相合，半相合 父母亲 半相合 17脐血干细胞移植脐血干细胞移植外周血干细胞移植骨髓干细胞移植3040506070十年存活率（%）6抗原5抗原4抗原3抗原不匹配抗原匹配数HLA-A、B、D R 抗
8、 原 配型与移植肾存活率（加州大学资料）常见常见HLAHLA与疾病关联与疾病关联疾病疾病 HLAHLA抗原抗原 相对风险相对风险强直性脊椎炎强直性脊椎炎 B27 89.8B27 89.8BehcetBehcet综合征综合征 B51 10-15B51 10-15多发性硬化症多发性硬化症 DR2 4.8DR2 4.8乳糜泻乳糜泻 DR3 10.8DR3 10.8GraveGraves s病病 DR3 3.7DR3 3.7系统性红斑狼疮系统性红斑狼疮 DR3 5.8DR3 5.8类风关类风关 DR4 4.2DR4 4.2胰岛素依赖型糖尿病胰岛素依赖型糖尿病 DR3/DR4 25.0DR3/DR4 2
9、5.0重症肌无力重症肌无力 DR3 2.5DR3 2.5小结小结 HLA的三个特性使其成为热点：的三个特性使其成为热点：决定组织相容性决定组织相容性 高度多态性高度多态性与疾病关联与疾病关联Table of ContentsHLA 基因分型 低分辨:SSPrSSO Luminex bead for class I&class II中等分辨中等分辨HLA分型分型24Next generation sequencing高分辨高通量高分辨高通量HLA分型分型Illumina Sequencing by Synthesis(SBS)chemistryMiSeqPacific Biosciences-S
10、ingle-molecule real-time sequencing27Sequencing based typing(SBT)高等分辨高等分辨HLA分型分型 Sanger 测序原理 Sanger 测序原理ATAGCTAGTGAACGTCAGT35TATCGA53ACGTACGdNTPddNTP-DyesATAGCTAGTGAACGTCAGT35TATCGCA53TATAGCTAGTGAACGTCAGT35TATCGCA53TTGATAGCTAGTGAACGTCAGT35TATCGCA53TGCTGAACACGTACGT Sanger 测序原理ATAGCTAGTGAACGTCAGT35TAT
11、CGA53ATAGCTAGTGAACGTCAGT35TATCGCA53TATAGCTAGTGAACGTCAGT35TATCGCA53TGATAGCTAGTGAACGTCAGT35TATCGCA53TGCTGAACHLA分型模板的扩增分型模板的扩增1.Long PCR (each:HLA-A,-B,-C,-DR,-DQ,DP,MICA)2.Amplicons (PCR:exon+loci)Long PCR to amplify the target genewww.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1206614109Assembly and AlignmentProb
12、lems in sequence assemblyAmplicons-HLA CoverageHLA-AHLA-BHLA-CHLA-DQB1HLA-DPB1HLA-DQA1HLA-DRB1HLA-DRB3HLA-DRB4HLA-DRB5HLA-DPA14.1kb2.6kb4.2kb10.3kb9.7kb7.3kb7.1kb4.1kbTable of ContentsAS的病因的病因v基因有关：HLA-B27的转基因大鼠成功地培育出强直性脊柱炎的动物模型。目前已发现包括B27在内的3种基因与此病相关；并且有明显家族发病倾向。v免疫有关：MHC，T-Cellsv感染有关：相关学说认为，来自尿道、前
13、列腺、精囊的抗原经Batson循环到达骶髂关节、脊柱和眼睛等部位而发生相关病变，解释了男性好发的原因。AS的经典检查的经典检查体征：体征：骶髂关节炎检查：骶髂关节炎检查：“4”字试验、骶髂关节字试验、骶髂关节压迫试验、髂棘推压试验、骨盆挤压试验压迫试验、髂棘推压试验、骨盆挤压试验附着点炎检查：坐骨结节、肋软骨、肋胸附着点炎检查：坐骨结节、肋软骨、肋胸关节、耻骨联合等压痛关节、耻骨联合等压痛脊柱和胸廓检查：脊柱和胸廓检查：Schober试验、指地距、试验、指地距、枕墙距、胸廓活动度等枕墙距、胸廓活动度等骶髂关节骶髂关节 AS的经典检查B27测序的测序的AS检查检查HLA-B27阴性的AS约5-1
14、0%的AS患者为HLA-B27阴性AS患者的HLA-B27阳性率达90-95%我国汉族人群HLA-B27阳性率2-7%（3千万-1亿），AS患病率为0.3%（4百万），大部分HLA-B27阳性者并不发生AS。HLA-B27与与AS患病率：0.3%，20-30岁，男女比例 10:1，有家族倾向；主要侵犯：中轴关节（骶髂关节、脊柱骨突、脊柱旁软组织）可伴发外周关节及关节外表现，严重者发生脊柱畸形和关节强直B27检测可作为有相关症状或高危人群AS早期的筛选方法！AS不是RA的一种特殊类型！强直性脊柱炎强直性脊柱炎类风湿性关节炎类风湿性关节炎地区分布种族差异大世界性性别分布男女女男年龄20-3030-
15、50家族史明显不明显类风湿因子（）（）HLA基因座位的等位基因和真正的疾病易感基因处于紧密连锁不平衡，而HLA基因本身并不是引起疾病的真正基因，仅仅是遗传标志。连锁不平衡学说分子模拟学说关节源性肽假说其他：T细胞受体库假说超抗原假说B27修饰因子假说Cys67模型B27抗原与某些G（-）菌之间存在类似的分子结构，能发生分子模拟或交叉反应，机体免疫系统把B27当作病原体抗原产生免疫应答，对机体产生免疫损害。认为关节源性肽只存在于关节组织中，特异性地由HLAB27提呈，正常情况下递呈水平低，反应T细胞处于耐受状态；当某些具有同源结构蛋白的病毒或细菌感染时，则可致敏耐受的T细胞，从而识别以低水平递呈
16、的关节源性肽，引起自身免疫反应而损伤组织。长沙能润医学公司的优势 长沙能润医学成立于2010年，专注于：基因资源与基因检测、肿瘤基因研究与转化、免疫细胞治疗和存储。为医疗机构、制药与健康体检公司提供特色精准医学解决方案。集团旗下拥有以下业务版块：基因检测、细胞治疗、生物培训、生物双创项目投资、精准医疗科研。集团还参股投资了免疫诊断试剂国家工程实验室、国家基因检测技术示范中心、智慧医院工程建设公司燕通生物、海南乐城合家精准医疗医院等机构。与中科院、中南大学湘雅医学院、湖南师大医学院及斯坦福、犹他、华盛顿、UAB、耶鲁等大学教授合作共建实验室。在未来，集团将以“基因科技服务健康”为宗旨，以双创平台为基础，以基因细胞技术系统为主导，系统模块化，模块产品化为策略，整合产、学、研、金、用资源，努力成为杰出的精准医学服务提供商。公司基因检测实力雄厚，与中南大学湘雅医学院百人计划邹义洲教授长期合作，有3台ABI3730测序仪，1台Luminex,公司员工80%具有硕士及硕士以上学历，具有丰富的基因检测服务经验，已经完成上万个案例。THANKS FOR YOUR ATTENTION
