1、食品微生物检验技术（二）常见产毒霉菌的鉴定技术产毒霉菌极易在含糖的饼干、面包、粮食等类食品上生长，与食品卫生关系密切的霉菌大部分属于半知菌亚门中的曲霉属、青霉属和镰刀菌属。其产生的毒素主要有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、杂色曲霉素、烟曲霉毒素、单端孢霉烯化合物、玉米赤霉烯酮、伏马菌素以及展青霉素、桔青霉素、黄绿青霉素等。鉴定原理霉菌产毒需要一定的条件，影响霉菌产毒的条件主要是食品基质中的水分、环境中的温度和湿度及空气的流通情况。在食品微生物检验中，对有毒霉菌的检验，主要是根据霉菌菌丝体或孢子的颜色、形态特征等进行鉴别。鉴定原理乳酸-苯酚液、查氏培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基、无糖马
2、铃薯琼脂培养基、显微镜、目镜测微尺、物镜测微尺、生物安全柜、恒温水浴锅、冰箱、酒精灯、接种钩针、分离针、滴瓶、载物玻片、盖玻片、小刀等。鉴定器材预先将检验中的霉菌或检验中分离出的霉菌孢子培养后的霉菌进行纯培养。鉴定方法1.菌落的观察将纯培养物点植于平板上。曲霉、青霉通常接种查氏培养基，镰刀菌通常需要同时接种多种培养基，其他真菌一般使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基。将平板倒转，向上接种一点或三点，每菌接种两个平板，倒置于2528恒温培养箱中进行培养。当刚长出小菌落时，取出一个平皿，以无菌操作，用小刀将菌落连同培养基切下1cm2cm的小块，置菌落一侧，继续培养，于514d进行观察。鉴定方法2.斜面观察将
3、霉菌纯培养物划线接种（曲霉、青霉）或点种（链刀菌或其他菌）于斜面，培养514d，观察菌落形态，同时还可以将菌种管置显微镜下用低倍镜观察孢子的形态和排列。鉴定方法3.制片取载玻片加乳酸-苯酚液一滴，用接种针钩取一小块霉菌培养物，置乳酸-苯酚液中，用两支分离针将培养物撕开成小块，切忌涂抹，以免破坏霉菌结构。然后加盖玻片，如有气泡，可在酒精灯上加热排除。制片时最好是在接种罩内操作，以防孢子飞扬。鉴定方法4.镜检观察霉菌的菌丝和孢子的形态和特征及孢子的排列等，并做详细记录。本属的产毒霉菌主要包括黄曲霉、寄生曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉和棕曲霉。1.营养菌丝体 由具横隔的分枝菌丝构成；无色或有明亮的颜色,一
4、部分埋伏型,一部分气生型。2.产孢结构 分生孢子梗大都无横隔,光滑、粗糙或有麻点。梗的顶端膨大形成棍棒形、椭圆形、半球形或球形的顶囊,在顶囊上生出一层或二层小梗,双层时下面一层为梗基,每个梗基上再着生两个或几个小梗。从每个小梗的顶端相继生出一串分生孢子；由顶囊、小梗以及分生孢子链构成一个头状体的结构,称为分生孢子头。分生孢子头有各种不同颜色和形状,如球形、放射形、棍棒形或直柱形等。曲霉属霉菌典型的形态特征霉菌典型的形态特征构巢曲霉构巢曲霉黄曲霉黄曲霉黑曲霉黑曲霉烟曲霉烟曲霉曲霉属 本属产毒霉菌,主要包括黄绿青霉、桔青霉、圆弧青霉、展开青霉、纯绿青霉、红青霉等。1.营养菌丝体 呈无色、淡色或鲜明
5、的颜色,具横隔,或为埋伏型或部分埋伏型部分气生型。气生菌丝密毡状、松絮状或部分结成菌丝索。2.产孢结构 分生孢子梗由埋伏型或气生型菌丝生出,稍垂直于该菌丝(除个别种外,不象曲霉那样生有足细胞),单独直立或作某种程度的集合及至密集为一定的菌丝束,具横隔,光滑或粗糙。其先端生有扫帚状的分枝轮,称为帚状枝。帚状枝是由单轮或两次到多次分枝系统构成,对称或不对称,最后一级分枝即产生孢子的细胞,称为小梗。青霉属霉菌典型的形态特征 本属的产毒霉菌主要包括禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌、雪腐镰刀菌等。这些霉菌的代谢产物为单端孢霉烯族化合物、玉米赤霉烯酮和丁烯酸内酯等。1.营养菌丝体 气生菌丝发达高 0.51.0cm或
6、较低为 0.30.5cm，或更低为0.10.2cm；稀疏的气生菌丝，甚至完全无气生菌丝而由基质菌丝直接生出黏孢层，内含大量的分生孢子。2.产孢结构 可产生大、小两种分生孢子。小型分生孢子通常假头状着生,较少为链状着生,或者假头状和链状着生兼有。小型分生孢子生于分枝或不分枝的分生子梗 上,形状多样,卵形、梨形、椭圆形、长椭圆形、纺锤形、披针形、腊肠形、柱形、锥形、逗点形、圆形等。12(3)隔,通常小型分生孢子的量较大型分生孢子为多。大型分生孢子产生在菌丝的短小爪状突起上或产生在分生孢子座上,或产生在粘孢团中;大型分生孢子形态多样,镰刀形、线形、纺锤形、披针形、柱形、腊肠形、蠕虫形、鳗鱼形,弯曲、
7、直或近于直。顶端细胞多种形态,短啄形、锥形、钩形、线形、柱形,逐渐变窄细或突然收缩。镰刀菌属霉菌典型的形态特征霉菌典型的形态特征镰刀菌属蓝色犁头霉链格孢霉菌瓶霉菌大肠菌群计数MPN法u一群在36培养48h可发酵乳糖产酸产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。u该菌主要来源自人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。u并非分类学概念，在生化及血清学方面并非完全一致。一般认为包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群（Coliforms）n指在44.5培养24-48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。n北美国
8、家一般使用“粪大肠菌群”概念，如AOAC、FDA；而欧洲使用“耐热大肠菌群”概念，较少使用“粪大肠菌群”，如NMKL。n与大肠菌群一样，并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。粪大肠菌群（Fecal colifoms）n一群在44.5 发酵乳糖、产酸产气、IMViC生化试验为+-或-+-的革兰氏阴性无芽孢杆菌。n分类学概念：肠杆菌科、埃希氏菌属n是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪便中的主要菌种。一般生活在人大肠中并不致病，但它侵入人体一些部位时，可引起感染。nO抗原（菌
9、体抗原，150个）K抗原（荚膜抗原，90个）H抗原（鞭毛抗原，50个）大肠杆菌（Escherichia coli）能侵入肠粘膜上皮细胞，引起食物中毒的大肠杆菌。产毒性大肠杆菌（ETEC)肠胃炎、旅行性腹泻致病性大肠杆菌（EPEC)婴儿腹泻肠出血性大肠杆菌（EHEC)出血性结肠炎（O157：H7；O104：H4；O111；O26等）侵袭性大肠杆菌（EIEC)杆菌性痢疾粘附性大肠杆菌（EAEC)急慢性腹泻大肠杆菌（Escherichia coli）ETEC EIEC EHEC O157：H7；O104：H4等大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的关系n是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。
10、n食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，粪便中既有正常肠道菌，也可能有肠道致病菌（如大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌等），因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数量越多则肠道致病菌存在的可能性就越高，但两者之间并不总是呈平行关系。n通常情况下，粪大肠菌群与大肠菌群，在人和动物粪便中所占的比例较大，而且由于在自然界容易死亡等原因，粪大肠菌群的存在可认为食品直接或间接的受到了比较近期的粪便污染。因而，粪大肠菌群在食品中的检出，与大肠菌群相比，说明食品受到了更为不清洁的加工，肠道致病菌和食物中毒菌的可能性更大。食品卫生学意义 检样稀释月桂基硫酸盐胰蛋
11、白胨肉汤（LST）36，24482h 不产气产气煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）36，24482h 不产气产气大肠菌群阴性大肠菌群阳性报告大肠菌群计数MPN法流程图大肠菌群计数MPN法示意图产气管10mL BGLB接种25g移1ml移1ml101225ml生理盐水均质器102103各1ml各1ml各1ml9ml生理盐水9ml生理盐水各10mLLST固体样品液体样品225ml生理盐水玻璃珠25mL0将产气的试管内样品接种到BGLB肉汤LST不产气（不产气（-）小导管里无气泡小导管里无气泡LST产气（产气（+）大肠菌群计数MPN法操作MPN（最可能数）是表示样品中活菌密度的估测。因此MPN值只是活菌密
12、度的估算值，并不是样品中活菌数的真值。结果报告归纳总结培养基主要成分作用月桂基磺酸钠能抑制革兰氏阳性菌的生长，同时比胆盐的选择性和稳定性好。由于胆盐与酸产生沉淀，沉淀有时候会使对产气情况的观察变得有些困难；乳糖是大肠菌群可利用发酵的糖类。有利于大肠菌群的生长繁殖并有助于鉴别大肠菌群和肠道致病菌；胰蛋白胨提供基本的营养成分；LST肉汤是国际上通用的培养基，与乳糖胆盐肉汤的作用和意义相同，但具有更多的优越性。月桂基磺酸盐胰蛋白胨（LST）归纳总结培养基主要成分作用胆盐可抑制革兰氏阳性菌。煌绿是抑菌抗腐剂，可增强对革兰氏阳性菌的抑制作用。乳糖是大肠菌群可利用发酵的糖类。有利于大肠菌群的生长繁殖并有助
13、于鉴别大肠菌群和肠道致病菌。发酵试验判定原则：产气为阳性。由于配方里有胆盐，胆盐遇到大肠菌群分解乳糖所产生的酸形成胆酸沉淀，培养基可由原来的绿色变为黄色，同时可看到管底通常有沉淀。煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）归纳总结注意事项归纳总结注意事项固体样品大肠菌群检测流程液体样品大肠菌群检测流程大肠菌群单位MPN/100克或MPN/100毫升的产品，建议选择取样量1mL（g）3、0.1mL（g）3、0.01mL（g）3归纳总结注意事项大肠菌群标准要求不超过29MPN/100mL产品,建议检测流程为：粪大肠菌群计数MPN法大肠杆菌计数MPN法10倍稀释选择3个连续稀释度样品匀液接种LST482h361不
14、产气产气EC肉汤450.2242h不产气产气EMB琼脂平板361242h营养琼脂斜面培养I M Vi C生化试验，革兰染色查MPN表，报告361242h靛基质试验(吲哚试验)(I)阳性甲基红反应(MR)阳性阴性V-P试验(VP)阴性阳性阴性柠檬酸盐利用试验（C）G-大肠菌群检验平板计数法n平板计数法相对于MPN法来说，检验结果更精确。n适合用于污染比较严重的样品，但对于污染菌量太少的样品，还是MPN法更有优势。n所用培养基：VRBA琼脂、BGLB培养基。适用范围与培养基平板计数法流程图平板计数法操作菌落数在15-150之间的平板,计数典型和可疑菌落361 18h 24h配方(g/L):蛋白胨:
15、7.0;酵母粉:3.0;乳糖:10.0;3号胆盐:1.5;中性红:0.03;结晶紫:0.002;氯化钠:5.0;琼脂:15.0;pH 7.40.1,25其中蛋白胨提供氮源；酵母粉提供生长促进因子和族维生素；乳糖提供碳源，大肠菌群发酵乳糖，产生酸性物质；号胆盐是一种抑菌剂，主要是抑制革兰氏阳性菌；结晶紫也是一种抑菌剂，主要是抑制革兰氏阳性菌和一部分革兰氏阴性菌；中性红是一种指示剂，在酸性条件显红色，碱性条件下显无色。氯化钠维持细菌生长时的渗透压。琼脂是一种凝固剂。VRBA琼脂n选择菌落数在15-150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。n典型菌落为紫红色，菌落周围有胆盐与酸形
16、成的沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。平板菌落数的选择n一是非典型菌落，如在颜色、直径与典型菌落不符合的菌落。n另一种情况是被检样品中含有乳糖以外的其他糖类，如牛奶、饮料等样品。本来大肠菌群的定义是发酵乳糖，但由于样品含有的其他糖类混入了培养基，使得不能分解乳糖但能分解其他糖类的细菌也能够长出红色菌落，所以需要进行证实实验。什么样的菌落必须要做证实试验n经最后证实为大肠菌群阳性的BGLB管的百分比乘以计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g(mL)样品中大肠菌群数。n例：10-4样品稀释液1ml在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取10个接种BGLB肉汤，证实6个为阳性。则样品大肠
17、菌群数为：1006/10104/g(mL)=6.0105cfu/g(mL)结果报告食品中单核增生李斯特氏菌检验u李斯特氏菌属（Listeria）普遍存在于环境中，最新的分类学研究表明，其分为六个 种：单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、绵羊（伊氏）李斯特氏菌、英诺克（无害）李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、威氏李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌u在李斯特氏菌属只有两种致病菌：单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中最有检测意义是单核增生李斯特氏菌。一
18、、单核增生李斯特氏菌概况李斯特氏菌属n革兰氏阳性,老龄培养物多转为革兰阴性;兼性厌氧,无芽孢、无荚膜;生长温度范围为2-42（也有报道在0能缓慢生长）,pH范围pH4.4-pH9.6;nLM的幼龄菌（1624h的培养物），为革兰阳性小杆菌，常呈V字形，成对排列。n在2225环境中形成4根鞭毛，故在25肉汤培养液中出现轻微旋转或翻滚样的运动。而在32时仅形成一根鞭毛，动力缓慢。一、单核增生李斯特氏菌概况生物学特性n菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的-溶血环。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂
19、(TSAYE)琼脂上，用45角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。n氧化酶阴性。40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。n能发酵多种糖类，产酸不产气，不利用枸橼酸盐，一、单核增生李斯特氏菌概况生物学特性n该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和食品中能长期存活；n对碱和盐抵抗力强，60-70经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌；n湿热灭菌（121，至少15min）和干热灭菌（160-170，至少1hr）可
20、杀灭该菌，对紫外线和射线敏感；n对青霉素、氨苄青霉素、氨基糖苷类、氯霉素均敏感。一、单核增生李斯特氏菌概况生物学特性n相关食品：鲜奶、巴氏消毒奶、奶酪、冰激凌、生的蔬菜、发酵过的生肉制作的香肠、生的和加工过的禽肉、各种生的肉类、生的和烟熏的鱼肉。约有85-90%的病例是由被污染的食品引起的。n该病的临床表现，健康成人个体出现轻微类似流感症状，由该菌造成的脑膜炎的致死率可高达70%，败血症的死亡率达50%，围产期或新生儿感染的死亡率超过80%，怀孕期妇女的感染，母亲通常能存活下来。n抗生素治疗，用青霉素或氨苄青霉素注射给药，或与氨基糖苷类抗生素一起用药。一、单核增生李斯特氏菌概况流行病学检样25
21、g(或25mL)样品+LB1增菌液225mL，均质0.1mL+10mL LB2增菌液李斯特氏菌显色培养基PALCAM琼脂接种木糖、鼠李糖，361，24h；同时于TSA-YE平板划线纯化，30 1，24h48h木糖-，鼠李糖+鉴定结果报告30 1，24h30 1，1824h36 1，24h48h二、单核增生李斯特氏菌检测检测流程液体样品摇匀25mL均质固体样品225ml LB125g361818h典型菌落在显色培养基上的特征按照产品说明进行判定 操作规程TPALCAM琼脂科玛嘉李斯特显色琼脂二、单核增生李斯特氏菌检测 小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷阴性纯化纯化阳性纯化
22、单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环；在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环；在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强革兰氏阳性短杆菌有动力，呈伞状生长或月牙生长单增李斯特菌无害李斯特菌绵羊李斯特菌马红球菌金葡二、单核增生李斯特氏菌检测 操作规程结果鉴定综合以上生化试验和溶血试验结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌。二、单核增生李斯特氏菌检测 单核细胞增生李斯特氏菌生化特性与其他李斯特氏菌的区别单核细胞增生李斯特氏菌生化特性与其他李斯特氏菌的区别菌种菌种溶血反应溶血反应葡萄糖葡萄糖麦芽
23、糖麦芽糖 MR-VP 甘露糖甘露糖鼠李糖鼠李糖木糖木糖七叶苷七叶苷单核细胞增生李斯单核细胞增生李斯特氏菌特氏菌+/+-+-+格式李斯特氏菌格式李斯特氏菌-+/+-+斯氏李斯特氏菌斯氏李斯特氏菌+/+-+威氏李斯特氏菌威氏李斯特氏菌-+/+-V+伊氏李斯特氏菌伊氏李斯特氏菌+/+-+英诺克李斯特氏菌英诺克李斯特氏菌-+/+-V-+注：注：+阳性；阳性；-阴性；阴性；V反应不定反应不定食品中副溶血性弧菌检验u 副溶血性弧菌属弧菌科，是一种生活在近海的海洋微生物，深海一般未发现，大多在温暖的季节水体中分离到该菌。从多种海产品中均能分离到该菌。u副溶血性弧菌引发的胃肠炎一般表现为骤发性剧烈腹痛。所有的
24、副溶血性弧菌胃肠炎起因均是由于进食了海产品或海产品相关的一些食物。在日本，有副溶血型弧菌引发的胃肠炎相当普遍，约占全部胃肠炎爆发事件的50%，原因是日本人爱生吃鱼。一、副溶血性弧菌概况p海洋环境中副溶血性弧菌的浓度通常为102CFU/mL或更低。而该菌引发的胃肠炎仅在摄入大量细菌（106CFU）时才会发生。因此，只有在生吃污染严重的滤食性海鲜食品，或进食未经恰当烹饪处理的污染食品时，才会引起胃肠炎。p虽然副溶血性弧菌与肉及肉制品关联不大，但在腌肉制品中曾分离到其他的嗜盐弧菌（肋生弧菌和其他未分型弧菌），并且确定为引发变质的微生物。由于副溶血性弧菌存在于海鲜食品中，随着鱼肉来源的食品添加物质如鱼
25、糜等在肉制品中应用越来越多，未来由副溶血性弧菌引发的问题将不容忽视。一、副溶血性弧菌概况u形态学特征：革兰氏染色阴性；菌体呈直或弯曲杆状；单极鞭毛具动力，有时在固体培养基中生长后可产生周生鞭毛；培养特性：嗜盐，在含氯化钠(20-30gL最适)培养基上生长，无盐和110gL以上不生长。最适为37，4 不生长。最适pH为7.4-8.0。需氧性很强，厌氧条件下生长缓慢。n抵抗力：不耐热，对酸敏感（在2冰醋酸或食醋中立即死亡），对氯、碳酸、来苏水等一般化学消毒剂敏感，对磺胺噻唑、氯霉素、合霉素敏感。一、副溶血性弧菌概况二、GB 4789.7-2013 标准解读副溶血性弧菌检验食品微生物学检验食品安全国
26、家标准本标准规定了食品中副溶血性弧菌（本标准规定了食品中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolytcusVibrio parahaemolytcus）的检）的检验方法。本标准适用于食品中副溶血性弧菌的检验。验方法。本标准适用于食品中副溶血性弧菌的检验。1 范围二、GB 4789.7-2013 标准解读除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2 设备和材料2.1 2.1 培养箱：培养箱：36361 2.2 1 2.2 冰箱：冰箱：2255，771010 2.3 2.3 恒温水浴锅：恒温水浴锅：36361 1 2.4 2.4 均质器或无菌乳钵均质器或无菌乳钵 2.5 2.
27、5 天平：感量天平：感量0.1g 2.6 0.1g 2.6 无菌试管：无菌试管：18mm18mm180mm180mm、15mm15mm100mm100mm2.7 2.7 无菌吸管：无菌吸管：1mL1mL（具（具0.01mL0.01mL刻度）、刻度）、10mL10mL（具（具0.1mL0.1mL刻度）或微量移液器及吸头刻度）或微量移液器及吸头 2.8 2.8 无菌锥形瓶：容量无菌锥形瓶：容量250mL250mL、500mL500mL 1000mL 2.91000mL 2.9 无菌培养皿：直径无菌培养皿：直径90mm 2.10 90mm 2.10 全自动微生物生化鉴定系统全自动微生物生化鉴定系统
28、2.11 2.11 无菌手术剪、镊子无菌手术剪、镊子 二、GB 4789.7-2013 标准解读3 培养基和试剂3.1 3%3.1 3%氯化钠碱性蛋白陈水（氯化钠碱性蛋白陈水（APWAPW）3.2 3.2 硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖（硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖（TCBSTCBS）琼脂）琼脂3.3 3%3.3 3%氯化钠胰蛋白陈大豆（氯化钠胰蛋白陈大豆（TSATSA）琼脂）琼脂 3.4 3%3.4 3%氯化钠三糖铁（氯化钠三糖铁（TSITSI）琼脂）琼脂3.5 3.5 嗜盐性试验培养基嗜盐性试验培养基 3.6 3%3.6 3%氯化钠甘露醇试验培养基氯化钠甘露醇试验培养基3.7 3%3.7 3%氯
29、化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基 3.8 3%3.8 3%氯化钠氯化钠MRMRVPVP培养基培养基3.9 3%3.9 3%氯化钠氯化钠 3.10 3.10 我妻氏血琼脂我妻氏血琼脂3.113.11氧化酶试剂氧化酶试剂 3.12 3.12 革兰氏染色液革兰氏染色液 3.13 ONPG3.13 ONPG试剂试剂 3.14 Voges 3.14 VogesProskauerProskauer（V VP P）试剂）试剂 3.15 3.15 弧菌显色培养基。弧菌显色培养基。3.16 3.16 生化鉴定试剂盒生化鉴定试剂盒 二、GB 4789.7-2013 标准解读二、GB 4789
30、.7-2013 标准解读样品25g（mL）+225mL 3氯化钠碱性蛋白胨水接种3氯化钠碱性蛋白胨水3管，3个适宜的连续稀释度361 818hTCBS或科弧菌显色培养基划线分离挑取可疑菌落，接种于3氯化钠碱性蛋白胨大豆琼脂361 1824h筛选试验氧化酶试验，革兰氏染色，3氯化钠三糖铁琼脂，嗜盐性试验361 1824h 生化试验或先用API 20E生化鉴定试剂或VITEK结果与报告定性定量361 818h血清学试验、神奈川试验（选做项目）4 检验程序二、GB 4789.7-2013 标准解读5.1 样品制备5.1.1 非冷冻样品采集后应立即置710冰箱保存，尽可能及早检验；冷冻样品应在45以下
31、不超过15min或在25不超过18h解冻。5.1.2 鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求相应部分。5 操作步骤GB 4789.7-2013 标准解读5 操作步骤5.1.3 以无菌操作样品25g（mL）加入3%氯化钠碱性蛋白胨水225mL，用旋转刀片式均质器以8000r/min均质1min,或拍击式均质器拍击2min，制备成1：10的样品匀液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵，自225mL3%氯化钠碱性蛋白水中取少量
32、稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入500mL无菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品12次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，制备1：10的样品匀液。二、GB 4789.7-2013 标准解读5.2 增菌5.2.1 将5.1.3制备的1：10样品匀液于361培养8h18h。5.2.2 定量检测5.2.2.1 用无菌吸管1：10样品匀液1mL，注入含有9mL3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，准备1：100的样品匀液。5.2.2.2 另取1mL无菌吸管，按5.2.2.1操作程序，依次制备10倍系列稀释品匀液，每递增稀释一次，换用一支1mL无菌吸管5.2.2
33、.3 根据对检样污染情况的估计，选择3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种3支含有9mL3%绿化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种1mL。置361恒温箱内，培养8h18h。5 操作步骤二、GB 4789.7-2013 标准解读5.2 增菌5.2.1 将5.1.3制备的1：10样品匀液于361培养8h18h。5.2.2 定量检测5.2.2.1 用无菌吸管1：10样品匀液1mL，注入含有9mL3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，准备1：100的样品匀液。5.2.2.2 另取1mL无菌吸管，按5.2.2.1操作程序，依次制备10倍系列稀释品匀液，每递增稀释一次，换用一支1mL无菌吸管5.2.2.
34、3 根据对检样污染情况的估计，选择3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种3支含有9mL3%绿化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种1mL。置361恒温箱内，培养8h18h。5 操作步骤GB 4789.7-2013 标准解读5 操作步骤5.3 分离 5.3.1 对所有显示生长的增菌液，用接种坏在距离液面以下1cm内沾取一环增菌液，于TCBS平板或弧菌显色培养基平板上划线分离。一支试管划线一块平板。于361培养18h24h。5.3.2 典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种坏轻触，有类似口香糖的质感，直径2mm3mm。从培养箱取出TCBS平板后，应尽快（不超过1h）挑取菌
35、落或标记要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定。GB 4789.7-2013 标准解读5 操作步骤5.3 分离 5.3.1 对所有显示生长的增菌液，用接种坏在距离液面以下1cm内沾取一环增菌液，于TCBS平板或弧菌显色培养基平板上划线分离。一支试管划线一块平板。于361培养18h24h。5.3.2 典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种坏轻触，有类似口香糖的质感，直径2mm3mm。从培养箱取出TCBS平板后，应尽快（不超过1h）挑取菌落或标记要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定。GB
36、 4789.7-2013 标准解读5 操作步骤5.4 纯培养挑取3个或以上可疑菌落，划线接种3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，361培养18h24h。GB 4789.7-2013 标准解读5 操作步骤5.5 初步鉴定5.5.1 氧化酶试验：挑取纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。5.5.2 涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽孢，有鞭毛。5.5.3 挑取纯培养的单个可疑菌落，接种3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，361培养24h观察结果。副溶血性弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变
37、黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，有动力。5.5.4 嗜盐性试验：挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种0%、6%、8%和10%不同氯化钠浓度的胰胨水，361培养24h，观察液体浑浊情况。副溶血性弧菌在无氯化钠和10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在6%氯化钠和8%氯化钠的胰胨水中生长旺盛。GB 4789.7-2013 标准解读5 操作步骤5.6 确定鉴定取纯培养物分别接种含有3%氯化钠的甘露醇试验培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、MR-VP培养基，361培养24h48h后观察结果：3%氯化钠三糖铁琼脂隔夜培养物进行ONPG试验。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。GB 4789.
38、7-2013 标准解读6 结果与报告根据检出的可疑菌落生化性状，报告25g（mL）样品中检出副溶血性弧菌。如果进行定量检测，根据证实为副溶血性弧菌阳性试管管数，查最可能数（MPN检索表），报告每g（mL）副溶血性弧菌的MPN值。副溶血性弧菌细胞数量增殖三、副溶血性弧菌定性检测液体样品摇匀25mL均质固体样品225ml 3%氯化钠碱性蛋白陈水25g361818h典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2mm3mm。操作规程TCBS琼脂科玛嘉显色琼脂接种于3氯化钠碱性蛋白胨大豆琼脂氧化酶试验革兰氏染色3氯化钠TSI嗜盐性试验甘露醇试验
39、赖氨酸试验MRVPONPG结果鉴定三、副溶血性弧菌定性检测副溶血性弧菌的生化性状试验项目结果革兰氏染色镜检阴性，无芽胞氧化酶动力蔗糖葡萄糖甘露醇分解葡萄糖产气乳糖硫化氢赖氨酸脱羧酶V-PONPG注：阳性；阴性。当检出的可疑菌落符合生化性状要求时，报告25g（mL）样品中检出副溶血性弧菌。操作规程四、副溶血性弧菌定量检测样品稀释接种同大肠菌群检验稀释液和发酵液都为3%氯化钠碱性蛋白陈水平板分离及鉴定同副溶血性弧菌定性检验阳性管固体样品25g移1ml移1ml101225ml均质器102103各1ml各1ml各1ml9ml9ml.查最可能数（MPN）检索表，报告每克（毫升）副溶血性弧菌的MPN值。u
40、API 20E生化鉴定试剂盒或VITEK：刮取3氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上的单个菌落，用生理盐水制备成浊度适当的细胞悬浮液，使用API 20E生化鉴定试剂盒或VITEK鉴定。u血清学分型(可选择）五、注意事项罐头食品的商业无菌检验n罐装食品canned foods：将符合要求的原料处理、分选、修整、烹调（或不经烹调）、装罐（包括马口铁、玻璃罐、复合薄膜袋或其他包装材料容器）、密封、杀菌、冷却或无菌包装而制成的所有罐装食品。n商业无菌commercial sterility：罐头食品经过热杀菌以后，不含有致病的微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病性微生物，这种状态称作商业无菌。n商
41、业无菌检验examination of commercial sterility：按照一定的无菌程序，在无菌状态下对罐装食品是否符合商业无菌状态的检查和验证。一、术语n密封hermatical seal：食品容器经密闭后能阻止微生物进入的状态。n胖听swell：由于罐头内微生物活动或化学作用产生气体，形成正压，使一端或两端外凸的现象。n泄漏leakage：罐头密封结构有缺陷，或由于撞击而破坏密封，或罐壁腐蚀而穿孔致使微生物侵入的现象。一、术语主要是某些耐热、嗜热并厌氧或兼性厌氧的微生物中酸性罐头容器的马口铁与内容物相互作用引起的氢膨胀贮存温度过高，排气不良，金属容器腐蚀穿孔等 生物因素化学因素
42、 物理因素二、引起罐头食品变质的原因罐头食品微生物污染的来源杀菌不彻底致罐头内残留有微生物杀菌后发生漏罐二、引起罐头食品变质的原因经高压蒸汽杀菌的罐头内残留的微生物大都是耐热性的芽胞，如果罐头贮存温度不超过43，通常不会引起内容物变质重要污染源是冷却水中微生物空气是次要造成漏罐污染污染源。耐热菌、酵母菌和霉菌都可侵入罐内氧含量升高，微生物生长旺盛，内容物pH值下降。污染低酸性罐头的主要微生物霉菌不产芽胞的细菌酵母菌嗜热性细菌中温性需氧菌污染低酸性罐头的主要微生物中温性厌氧细菌463152二、引起罐头食品变质的原因抗热能力很强，易形成芽胞。嗜热性厌氧芽胞菌平酸腐败细菌嗜热脂肪芽胞杆菌凝结芽胞杆菌
43、嗜热解糖梭菌致黑梭菌嗜热性细菌这类细菌通常有产气硫化臭变质引起罐头食品酸败变质而又不胖听（即产酸不产气）的微生物。最适生长温度55（罐头胖听）分解糖的能力很强，能分解葡萄糖、乳糖、蔗糖、水杨苷及淀粉，产生酸和大量的气体。生长温度35-70（罐头平坦、内容物发黑、有臭鸡蛋味）分解蛋白质产生硫化氢（与马口铁化合成硫化物嗜热温度嗜热温度(45-50)下芽孢发芽。下芽孢发芽。造成的原因：造成的原因：库存和销售环境温度，库存和销售环境温度，加工中热处理后冷却加工中热处理后冷却二、引起罐头食品变质的原因污染低酸性罐头的主要微生物一类分解蛋白质的能力强，也能分解一些糖肉毒梭菌生胞梭茵双酶梭菌腐化梭菌等丁酸梭
44、菌、巴氏芽孢梭菌、魏氏梭菌等。中温性厌氧细菌另一类分解糖类主要有肉毒梭菌：分解蛋白质产硫化氢，氨，粪臭素等导致胖听，内容物呈现腐烂性败坏，产生毒素和恶臭味。肉毒毒素毒性强，不论罐头腐败程度如何，均必须用内容物接种小白鼠来检测毒素。二、引起罐头食品变质的原因污染低酸性罐头的主要微生物 芽胞杆菌属，许多细菌的芽胞在100或更低一些的温度下，短时间内就能被杀死。中温性需氧菌枯草芽胞杆菌巨大芽胞杆菌蜡样芽胞杆菌二、引起罐头食品变质的原因污染低酸性罐头的主要微生物如大肠杆菌，它们在罐内生长可造成胖听在火腿罐头中常可检出粪链球菌和尿链球菌等不产芽胞的细菌不产芽胞的细菌另一类主要是链球菌多见于蔬菜、水果罐头
45、中，它们生长繁殖会产酸并产生气体，造成胖听一类是肠道细菌二、引起罐头食品变质的原因污染低酸性罐头的主要微生物 酵母菌及霉菌：主要是由于漏罐造成，有时也因杀菌温度不够。酵母菌污染低酸性罐头的情况较少见，仅偶尔出现于果酱，果汁，甜炼乳罐头等含糖量高的罐头中。出现浑浊、沉淀、风味改变、爆裂膨胀等现象。二、引起罐头食品变质的原因污染低酸性罐头的主要微生物污染酸性罐头的主要微生物酵母菌的抗热能力很低，除了杀菌不足或发生漏罐，正常的杀菌处理，通常是不会发生酵母菌污染常见的黄色丝衣霉菌白色丝衣霉菌青霉曲霉等产生芽孢的细菌抗热性霉菌及酵母菌不产生芽孢的细菌污染酸性罐头的主要微生物常见于腐败变质的水果罐头中如：
46、如：凝结芽胞杆菌凝结芽胞杆菌丁酸梭菌丁酸梭菌巴氏芽胞梭菌巴氏芽胞梭菌多粘芽胞杆菌多粘芽胞杆菌浸麻芽胞杆菌浸麻芽胞杆菌等等主要是乳酸菌，如乳酸杆菌和明串珠菌，可引起水果及水果制品的酸败：又如乳酸杆菌的异型发酵菌种可造成蕃茄制品的酸败和水果罐头的产气性败坏二、引起罐头食品变质的原因抽样留样，至少30mL(g)置灭菌容器，25保藏开启包装物pH测定感官检查三、罐头检验的基本程序罐头检样对照361，10d保温，发现膨胀立即剔除，开启检查25，冰箱保藏涂片染色镜检符合商业无菌不符合商业无菌异常原因分析（选做项目）报告抽样取样数为1/6000，尾数超过2000者增取1罐，每班(批)每个品种不得少于3罐。某
47、些产品班产量较大，则以30000罐为基数，其取样数按1/6000；超过30000罐以上的按1/20000计，尾数超过4000罐者增取1罐。个别产品产量过小，同品种同规格可合并班次为一批取样，但并班总数不超过5000罐，每个批次取样数不得少于3罐。低酸性食品罐头：在杀菌冷却完毕后每杀菌锅抽样2罐,3kg以上的大罐每锅抽1罐；酸性食品罐头：每锅抽1罐，一般一个班的产品组成一个检验批（多锅），每批每个品种取样基数不得少于3罐。产品如按锅划分堆放，在遇到由于杀菌操作不当引起问题时，也可以按锅处理。按杀菌锅抽样按生产班(批)次抽样在检验大批罐头食品时：根据厂别、商标，按品种、来源及制造时间分类进行采样。
48、在仓库或商店贮存的成批罐头中：有变形，膨胀、凹陷、罐壁裂缝、生锈和破损等情况时，可根据情况决定抽样数量三、罐头检验的基本程序n精确度：用电子秤或台天平称重，1kg及以下的罐头精确到1g，1kg以上的罐头精确到2g，10kg以上的罐头精确到10g。n净重：各罐头的重量减去空罐的平均重量即为该罐头的净重。n编号：称重前对样品进行记录编号。三、罐头检验的基本程序称重目的：观察有否胖听或泄漏等情况。u每个批次取1个样品置25冰箱保存作为对照，将其余样品在361下保温10d。保温过程中应每天检查，如有膨胀或泄漏现象，应立即剔出，开启检查。u保温结束时，再次称重并记录，比较保温前后样品重量有无变化。如有变
49、轻，表明样品发生泄漏。将所有包装物置于室温直至开启检查。三、罐头检验的基本程序保温开 罐外观正常外观正常的罐头的罐头胖听罐头胖听罐头1.可用酒精棉球擦去开启端可能存在的污秽和油渍，含4碘的70酒精溶液消毒15min，用清洁的毛巾擦干，用火焰烧灼开启端，直至所附碘酒精全部蒸发。2.用灭菌的开罐器穿刺罐顶，(带汤汁的罐头开罐前适当振摇)，开罐时不能伤及卷边结构。3.无菌采取罐头中心部位的样品，取样量应充足以备复检之用。1.样品先置于2 5 冰箱内冷藏数小时后开启2.用含4碘的70酒精溶液消毒15min，30min后用灭菌毛巾擦干，不能用点燃或烧灼，以防内部气体受热而使罐听膨胀加剧，以致出现裂隙，内
50、容物喷出。3.用灭菌的开罐器穿刺罐顶，可设法捕获一些罐内气体，然后通过化学方法鉴定气体性质，其是否为二氧化碳、氢气或其它气体。4.再无菌采取罐头中心部位的样品，取样量应充足以备复检之用。三、罐头检验的基本程序n取保温过的全部罐头，冷却到常温后，胖听罐头应放冰箱冷却，按无菌操作开罐检验。n将样罐用温水和洗涤剂洗刷干净，用自来水冲洗后擦干。放入无菌室，以紫外光杀菌灯照射30min。n开罐后，用灭菌吸管或其他适当工具以无菌操作取出内容物30mL(g)，移入灭菌容器内，保存于2-4冰箱中。n留样用于比较微生物增殖情况。n待该批罐头检验得出结论后可随之弃去。三、罐头检验的基本程序留样n感官检查在光线充足
