1、退出 Enzyme Engineering酶工程第五章第五章 固定化酶固定化酶n第一节第一节 概述概述 n第二节第二节 固定化酶的特点、性质及其评价指标固定化酶的特点、性质及其评价指标 n第三节第三节 固定化酶的制备原则、固定化方法及固定化酶的制备原则、固定化方法及特点特点n第四节第四节 固定化细胞固定化细胞 n第五节第五节 固定化原生质体和辅酶固定化原生质体和辅酶n第六节第六节 酶反应器酶反应器n第七节第七节 固定化酶（细胞）的应用固定化酶（细胞）的应用酶的缺陷酶的缺陷 稳定性差稳定性差 分离纯化困难分离纯化困难 回收困难回收困难1、为什么进行酶的固定化？、为什么进行酶的固定化？第一节第一节
2、 概述概述2、什么是固定化酶？、什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶 固相酶固相酶结合固定结合固定SEPSn固定化酶：被固定化酶：被局限局限在某一特定区域上的，在某一特定区域上的，并且保留了它们的并且保留了它们的催化活力催化活力，可以，可以反复、反复、连续使用连续使用的酶的酶2、发展历程、发展历程1916 发现酶被吸附在骨炭粉上仍具有活性发现酶被吸附在骨炭粉上仍具有活性1953 Grubohofer等将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋等将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶等结合固定在聚苯乙烯树脂重氮化载体上，白酶等结合固定在聚苯乙烯树脂重氮化载体上，在实验室实现了酶的固定化在
3、实验室实现了酶的固定化1969 日本日本 固定化氨基酰化酶固定化氨基酰化酶 国际上固定化酶国际上固定化酶应用于连续工业化生产的开端应用于连续工业化生产的开端1973 日本日本 固定化微生物细胞固定化微生物细胞我国我国1970 微生物所、上海生化所开始固定化酶研究微生物所、上海生化所开始固定化酶研究第二节第二节 固定化酶的特点、性质及其固定化酶的特点、性质及其 评价指标评价指标一、固定化酶的优缺点一、固定化酶的优缺点二、固定化酶的性质变化二、固定化酶的性质变化三、固定化酶的评价指标三、固定化酶的评价指标一、固定化酶的优缺点一、固定化酶的优缺点 多次使用多次使用 反应操作方式多样反应操作方式多样(
4、分批、连续分批、连续)提高了酶的稳定性提高了酶的稳定性 纯化简单、提高产物质量纯化简单、提高产物质量 反应过程可以严格控制反应过程可以严格控制 较游离酶更适合于多酶反应较游离酶更适合于多酶反应 降低酶活力降低酶活力 大分子底物较困难大分子底物较困难 首次投入成本高首次投入成本高 多酶反应不及完整菌株多酶反应不及完整菌株优点：优点：缺点：缺点：二、固定化酶的性质变化二、固定化酶的性质变化1、酶活力的变化、酶活力的变化2、酶稳定性的变化、酶稳定性的变化3、最适温度的变化、最适温度的变化4、最适、最适pH的变化的变化5、米氏常数、米氏常数(Km)的变化的变化1、酶活力的变化、酶活力的变化n酶活力降低
5、，专一性改变酶活力降低，专一性改变 例：羧甲基纤维素做载体固定的胰蛋白酶，对高分子底例：羧甲基纤维素做载体固定的胰蛋白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力的物酪蛋白只显示原酶活力的30%；而对低分子底物苯酞；而对低分子底物苯酞精氨酸对硝基酰替苯胺的活力保持精氨酸对硝基酰替苯胺的活力保持80%原因原因 (1)空间构象变化空间构象变化 (2)空间位阻空间位阻 (3)内扩散阻力内扩散阻力 (4)半透膜阻挡半透膜阻挡作用于低分子底物的酶，特异性没有明显变化作用于低分子底物的酶，特异性没有明显变化 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶，特既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶，特 异性往往
6、会变化异性往往会变化2、酶稳定性的变化、酶稳定性的变化表现表现n增加了酶的耐热性增加了酶的耐热性 氨基酰化酶氨基酰化酶 70 15min 游离游离 活力丧失活力丧失 DEAE纤维素纤维素 60%DEAE葡聚糖葡聚糖 80%n增大了酶对有机试剂、抑制剂等的抵抗能力增大了酶对有机试剂、抑制剂等的抵抗能力 脱乙酰酶脱乙酰酶 浆果赤霉素浆果赤霉素 DEAE纤维素纤维素 提高提高51%2、酶稳定性的变化、酶稳定性的变化n减轻了蛋白酶的破坏作用减轻了蛋白酶的破坏作用n增强对增强对pH的耐受范围的耐受范围 青霉素酰化酶青霉素酰化酶 37 16h 游离游离 pH 7.0-9.0 固定化固定化 pH 5.5-1
7、0.3氨氨基基酰酰化化酶酶胰蛋白酶胰蛋白酶蛋白酶蛋白酶Pronase P(保存酶活力保存酶活力)(保存酶活力保存酶活力)自然酶自然酶23%48%DEAE纤维素纤维素33%53%DEAE葡聚糖葡聚糖87%88%2、酶稳定性的变化、酶稳定性的变化原因原因n酶分子与载体多点连接，防止酶分子伸展变形酶分子与载体多点连接，防止酶分子伸展变形n酶活力缓慢释放酶活力缓慢释放n抑制酶的自降解抑制酶的自降解n阻挡外界不利因素的侵袭阻挡外界不利因素的侵袭最适温度提高最适温度提高例：壳聚糖固定胰蛋白酶，最适温度为例：壳聚糖固定胰蛋白酶，最适温度为80；比固定化前提高比固定化前提高30 3、最适温度的变化、最适温度的
8、变化最适最适pH、酶活力、酶活力pH曲线发生偏移曲线发生偏移带负电荷载体带负电荷载体(阴离子聚合物阴离子聚合物)，最适，最适pH偏高，偏高，向碱性偏移向碱性偏移4、最适、最适pH的变化的变化+-+H+H+H+H+-OH-OH-OH-OH-表观表观Km随载体的带电性能变化随载体的带电性能变化电中性载体，电中性载体，Km ；载体与底物电荷性质相；载体与底物电荷性质相反，反，Km ；相同，；相同，Km5、米氏常数、米氏常数(Km)的变化的变化-S+S+S+S+S+S+三、固定化酶的评价指标三、固定化酶的评价指标1、固定化酶的活力固定化酶的活力p每（毫克）干重固定化酶每分钟转化底物每（毫克）干重固定化
9、酶每分钟转化底物(或生成产物或生成产物)的量，的量，mol min-1 mg-1 p单位面积（单位面积（cm2）的反应初速度表示，）的反应初速度表示，mol min-1 cm-2（酶膜、酶管、酶板酶膜、酶管、酶板）须注明：须注明：温度、搅拌速度、固定化酶的干燥条件、固定化温度、搅拌速度、固定化酶的干燥条件、固定化的原酶含量或蛋白质含量、原酶的比活力的原酶含量或蛋白质含量、原酶的比活力测定方法：测定方法：间歇测定；连续测定间歇测定；连续测定三、固定化酶的评价指标三、固定化酶的评价指标2、蛋白质含量、蛋白质含量3、操作半衰期、操作半衰期u衡量稳定性的指标衡量稳定性的指标u连续测活条件下固定化酶活力
10、下降为最初活力一半所需连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（要的时间（t1/2）t1/2 0.693/KD 衰减常数：衰减常数：，是时间是时间t后酶活力残留的百分数后酶活力残留的百分数 02.303lg()DEKtE 0EE三、固定化酶的评价指标三、固定化酶的评价指标4、或称偶联效率，酶的固定化率。或称偶联效率，酶的固定化率。5、活力保留百分数。活力保留百分数。6、100固 定 化 酶 总 活 力活 力 回 收 率 加 入 酶 的 总 活 力100固定化酶总活力相对活力加入酶的总活力-上清液中未结合酶活力第二节结束第二节结束固定化酶的优缺点固定化酶的优缺点固定化酶的性质变化
11、固定化酶的性质变化固定化酶的评价指标固定化酶的评价指标酶活力的变化酶活力的变化酶稳定性的变化酶稳定性的变化最适温度的变化最适温度的变化最适最适pH的变化的变化米氏常数米氏常数(Km)的变化的变化固定化酶的特点、固定化酶的特点、性质及其评价指标性质及其评价指标固定化酶的活力固定化酶的活力蛋白质含量测定蛋白质含量测定操作半衰期操作半衰期酶结合效率酶结合效率活力回收率活力回收率相对活力相对活力优点优点缺点缺点第二节结束第二节结束n点击返回 第三节第三节 固定化酶的制备原则、固定化方固定化酶的制备原则、固定化方 法及特点法及特点一、一、固定化酶的制备原则固定化酶的制备原则二、二、固定化酶的制备方法及特
12、点固定化酶的制备方法及特点1.尽可能地保持自然酶的催化活性和专一性尽可能地保持自然酶的催化活性和专一性2.载体与酶结合牢固；不能与底物、产物等载体与酶结合牢固；不能与底物、产物等 发生化学反应；且具有一定的机械强度发生化学反应；且具有一定的机械强度3.空间位阻较小空间位阻较小4.成本尽可能低成本尽可能低一、固定化酶的制备原则一、固定化酶的制备原则1、一般方法及特点一般方法及特点2、各种固定化方法的比较各种固定化方法的比较3、固定化后酶的考察项目固定化后酶的考察项目二、固定化酶的制备方法及特点二、固定化酶的制备方法及特点1、一般方法及特点一般方法及特点u关键在于选择适当的固定化方法和必要的关键在
13、于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进载体以及稳定性研究、改进u四大类方法四大类方法 (1)吸附法吸附法（包括电吸附法）（包括电吸附法）(2)结合法结合法（无机多孔材料）（无机多孔材料）(3)交联法交联法（双功能试剂）（双功能试剂）(4)包埋法包埋法（微胶囊法）（微胶囊法）(1)吸附法吸附法n物理吸附法。利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附物理吸附法。利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上在其表面上 载体载体 无机：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、活性炭、微孔玻无机：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、活性炭、微孔玻 璃、多孔玻璃等璃、多孔玻璃等 有机：纤维素、胶原、火棉胶、树脂、
14、陶瓷等有机：纤维素、胶原、火棉胶、树脂、陶瓷等载体选择原则载体选择原则 a.要有巨大的比表面积；要有巨大的比表面积；b.要有活泼的表面；要有活泼的表面；c.结合牢固；结合牢固；d.便于装柱进行连续反应便于装柱进行连续反应酶活性中性不易被破坏，高级结构变化少，酶活损失少酶活性中性不易被破坏，高级结构变化少，酶活损失少酶与载体相互作用力弱，酶容易脱落酶与载体相互作用力弱，酶容易脱落(2)结合法结合法离子键结合法离子键结合法共价键结合法共价键结合法 离子键结合法离子键结合法n通过离子键使酶与载体结合的固定化方法，也称离子交通过离子键使酶与载体结合的固定化方法，也称离子交换吸附法换吸附法载体载体 DE
15、AE-纤维素、纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶、CMC-纤维素等纤维素等使用时注意使用时注意pH、离子强度、温度等的控制、离子强度、温度等的控制操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心不操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心不易被破坏，酶活回收率高易被破坏，酶活回收率高载体和酶结合力弱，易受缓冲液种类和载体和酶结合力弱，易受缓冲液种类和pH的影响，在离的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往从载体上脱落子强度高的条件下进行反应时，酶往往从载体上脱落 共价键结合法共价键结合法n借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功
16、能基团进行偶联的固定化方法团进行偶联的固定化方法n目前应用和报道最多的一类方法目前应用和报道最多的一类方法n参与共价结合的酶的氨基酸残基不应是酶催化活性所必参与共价结合的酶的氨基酸残基不应是酶催化活性所必需的，否则往往会造成固定后的酶的活力完全丧失需的，否则往往会造成固定后的酶的活力完全丧失可以形成共价键的基团可以形成共价键的基团游离氨基、游离羧基、巯基、咪唑基、酚基、羟基、游离氨基、游离羧基、巯基、咪唑基、酚基、羟基、甲硫基、吲哚基、二硫键甲硫基、吲哚基、二硫键 共价键结合法共价键结合法n常用载体常用载体 天然高分子衍生物天然高分子衍生物(纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖等纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂
17、糖等)人工合成高聚物人工合成高聚物(聚丙烯酰胶、多聚氨基酸、乙烯、尼聚丙烯酰胶、多聚氨基酸、乙烯、尼 龙、聚苯乙烯等龙、聚苯乙烯等)无机载体无机载体(多孔玻璃、陶瓷等多孔玻璃、陶瓷等)通常情况下，载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧通常情况下，载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团间不具有直接反应的能力。链基团间不具有直接反应的能力。活化载体有关基因活化载体有关基因 载体接一个双功能试剂载体接一个双功能试剂 共价键结合法共价键结合法n共价键结合法制备固定化酶的共价键结合法制备固定化酶的“通式通式”载体上引进活泼基团载体上引进活泼基团 关键关键 活化该活泼基团活化该活泼基团 此活泼基团再与酶
18、分子上某一基团形成共价键此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键 共价键结合法共价键结合法n载体活化方法载体活化方法 A重氮法重氮法 B叠氮法叠氮法 C烷基化反应法烷基化反应法 D硅烷化法硅烷化法 E溴化氰法溴化氰法 共价键结合法共价键结合法n 共价键结合法的特点共价键结合法的特点优点：优点：酶与载体结合牢固，稳定性好。一般不会因底物浓度酶与载体结合牢固，稳定性好。一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落，有利于连续使用。高或存在盐类等原因而轻易脱落，有利于连续使用。缺点：缺点：反应条件苛刻，操作复杂；可能引起酶蛋白高级结构反应条件苛刻，操作复杂；可能引起酶蛋白高级结构变化，破坏部分活性
19、中心，往往得不到比活力高的固变化，破坏部分活性中心，往往得不到比活力高的固定化酶定化酶。(3)交联法交联法n借助借助双功能试剂双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化用于含酶菌体或菌体碎片的固定化 n常用试剂常用试剂：戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双：戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。应用最广泛的是戊二醛偶氮苯等。应用最广泛的是戊二醛方法方法 酶直接交联法酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形在酶液中加入适量多功能试剂，使其形 成不溶性衍
20、生物成不溶性衍生物 依赖酶与试剂的浓度、溶液依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反和离子强度、温度和反 应时间之间的平衡应时间之间的平衡 酶辅助蛋白交联酶辅助蛋白交联：使用辅助蛋白使用辅助蛋白(白蛋白、明胶、血红蛋白蛋白、明胶、血红蛋 白等白等)来增加蛋白质浓度，使酶与惰来增加蛋白质浓度，使酶与惰 性蛋白质共交联性蛋白质共交联 可避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起可避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起 酶失活酶失活(3)交联法交联法（无载体固定化）（无载体固定化）（共交联法）（共交联法）双重固定法双重固定法 n通过酶分子间交联形成的固定化酶颗粒一般很通过酶分子间交联
21、形成的固定化酶颗粒一般很小，而且机械性能不是很好小，而且机械性能不是很好 吸附交联法吸附交联法 交联包埋法交联包埋法(3)交联法交联法(4)包埋法包埋法n将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法化的方法n常用载体常用载体：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、火棉胶等明胶、聚丙烯酰胺、火棉胶等n分类分类：网格型和微囊型：网格型和微囊型 网格型网格型 微囊型微囊型(4)包埋法包埋法 网格型网格型n n将酶或含酶菌体包埋在凝胶将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格细微网格中，制成一中，制成一定形状的
22、固定化酶，称为网格型包埋法。也称为定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法凝胶包埋法(4)包埋法包埋法 微囊型微囊型n是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球小球内，内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法(4)包埋法包埋法 微囊型微囊型n微囊化法制备固定化酶的方法微囊化法制备固定化酶的方法 界面沉淀法界面沉淀法：物理方法，利用某些高聚物在水相和有机相：物理方法，利用某些高聚物在水相和有机相 的界面上溶解度较低而形成的皮
23、膜将酶包埋的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋 界面聚合法界面聚合法：化学方法，利用油水界面上发生聚合反应形：化学方法，利用油水界面上发生聚合反应形 成聚合体而将酶包裹起来成聚合体而将酶包裹起来2、各类固定化方法的特点比较、各类固定化方法的特点比较比较项目比较项目 载体结合法载体结合法交联法交联法 包埋法包埋法 物理吸物理吸附附 离子键结合离子键结合 共价键结合共价键结合 制备难易制备难易 易易 易易 难难 较难较难 较难较难 固定化程度固定化程度 弱弱 中等中等 强强 强强 强强 活力回收率活力回收率 较高较高 高高 低低 中等中等 高高 载体再生载体再生 可能可能 可能可能 不可能不可能
24、 不可能不可能 不可能不可能 费用费用 低低 低低 高高 中等中等 低低 底物专一性底物专一性 不变不变 不变不变 可变可变 可变可变 不变不变 适用性适用性 酶源多酶源多 广泛广泛 较广较广 较广较广 小分子底小分子底物、药用物、药用酶酶 3、固定化后酶的考察项目、固定化后酶的考察项目（1）测定固定化酶的活力，以确定固定化过测定固定化酶的活力，以确定固定化过 程的活力回收率程的活力回收率 （2）考察固定化酶稳定性考察固定化酶稳定性 （3）考察固定化酶最适反应条件考察固定化酶最适反应条件第三节提要第三节提要固定化酶的制备原则固定化酶的制备原则固定化酶的制备方法固定化酶的制备方法及特点及特点尽可
25、能地保持自然酶的催化活性尽可能地保持自然酶的催化活性载体与酶结合牢固载体与酶结合牢固空间位阻较小空间位阻较小成本尽可能低成本尽可能低一般方法及特点一般方法及特点各种固定化方法的比较各种固定化方法的比较固定化后酶的考察项目固定化后酶的考察项目思考题思考题I1.什么是固定化酶？与游离酶相比，固定化酶有什么是固定化酶？与游离酶相比，固定化酶有哪些优缺点？哪些优缺点？2.制备固定化酶，需遵循哪些原则？固定化后，制备固定化酶，需遵循哪些原则？固定化后，需考察哪些项目？需考察哪些项目？3.简述酶固定化后，其稳定性得以提高的原因。简述酶固定化后，其稳定性得以提高的原因。4.试述酶进行固定化之后，酶的性质将有
26、何变化？试述酶进行固定化之后，酶的性质将有何变化？5.简述固定化酶制备的一般方法、基本原理以及简述固定化酶制备的一般方法、基本原理以及各自的优缺点。各自的优缺点。6.试述共价键结合法制备固定化酶的一般试述共价键结合法制备固定化酶的一般“通通式式”，及共价结合法的优缺点。，及共价结合法的优缺点。第三节结束第三节结束n点击返回 第五章第五章 固定化酶固定化酶n第一节第一节 概述概述 n第二节第二节 固定化酶的特点、性质及其评价指标固定化酶的特点、性质及其评价指标 n第三节第三节 固定化酶的制备原则、固定化方法及固定化酶的制备原则、固定化方法及特点特点n第四节第四节 固定化细胞固定化细胞 n第五节第
27、五节 固定化原生质体和辅酶固定化原生质体和辅酶n第六节第六节 酶反应器酶反应器n第七节第七节 固定化酶（细胞）的应用固定化酶（细胞）的应用第四节第四节 固定化细胞固定化细胞一、固定化细胞的概念和目的一、固定化细胞的概念和目的二、固定化细胞的特点二、固定化细胞的特点三、固定化细胞的分类三、固定化细胞的分类四、细胞固定化方法及特点四、细胞固定化方法及特点一、固定化细胞的概念和目的一、固定化细胞的概念和目的概念概念n细胞的固定化是利用物理、化学等因素将细胞约细胞的固定化是利用物理、化学等因素将细胞约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍能保留束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍能保留其催化活性，并具有
28、能被反复或连续使用的活力其催化活性，并具有能被反复或连续使用的活力目的目的n生产酶等各种代谢产物。可代替游离细胞进行酶生产酶等各种代谢产物。可代替游离细胞进行酶的发酵生产。具产酶率高、发酵周期短、可连续的发酵生产。具产酶率高、发酵周期短、可连续发酵等优点发酵等优点细胞特性比较细胞特性比较细胞种类细胞种类 植物细胞植物细胞 微生物细胞微生物细胞 动物细胞动物细胞 细胞大小细胞大小/um 20-300 1-10 10-100 倍增时间倍增时间/h 12 0.3-6 15 营养要求营养要求 简单简单 简单简单 复杂复杂 光照要求光照要求 大多数要光照大多数要光照 不要求不要求 不要求不要求 对剪切力
29、对剪切力 敏感敏感 大多数不敏感大多数不敏感 敏感敏感 主要产物主要产物 色素、药物、香色素、药物、香精、酶等精、酶等 醇、有机酸、氨基酸、醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、抗生素、核苷酸、酶酶 疫苗、激素、疫苗、激素、抗体、酶抗体、酶 微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成固定化细胞固定化细胞二、固定化细胞的特点二、固定化细胞的特点优点优点n省去了酶的分离过程，降低生产成本省去了酶的分离过程，降低生产成本n固定化细胞为多酶系统，无需辅因子再生固定化细胞为多酶系统，无需辅因子再生n对不利环境耐受性增加，细胞可重复使用，简化对不利环境耐受性增加，细胞可
30、重复使用，简化了细胞培养过程了细胞培养过程n保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定性保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定性二、固定化细胞的特点二、固定化细胞的特点缺陷缺陷n只适用于胞外酶，不适于胞内酶只适用于胞外酶，不适于胞内酶n多种酶存在，形成较多副产物多种酶存在，形成较多副产物n使用初期会有一些细胞组分渗出，影响产物质量使用初期会有一些细胞组分渗出，影响产物质量n有些细胞在条件不适宜的情况下易发生自溶有些细胞在条件不适宜的情况下易发生自溶三、固定化细胞的分类三、固定化细胞的分类细胞类型细胞类型 固定化微生物细胞固定化微生物细胞 固定化植物细胞固定化植物细胞 固定化动物细胞固定化动物细
31、胞形状形状 颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则形状颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则形状三、固定化细胞的分类三、固定化细胞的分类n生理状态生理状态 固定化死细胞固定化死细胞 固定化之前或之后细胞灭活处理，目的在于增加细胞膜的渗透固定化之前或之后细胞灭活处理，目的在于增加细胞膜的渗透 性或抑制副产物。比较适合于单酶催化反应性或抑制副产物。比较适合于单酶催化反应 固定化活细胞固定化活细胞(生长细胞、增殖细胞生长细胞、增殖细胞)将活细胞固定在载体上，并使其在连续反应过程中保持旺盛的将活细胞固定在载体上，并使其在连续反应过程中保持旺盛的 生长、繁殖能力生长、繁殖能力 固定化静止细胞固定化静止细胞(饥饿
32、细胞饥饿细胞)固定化后细胞是活的，但细胞并不生长繁殖，处于休眠状态或固定化后细胞是活的，但细胞并不生长繁殖，处于休眠状态或 饥饿状态饥饿状态四、细胞固定化方法及特点四、细胞固定化方法及特点1、直接固定法、直接固定法2、吸附法、吸附法3、包埋法、包埋法4、交联和共价偶联法、交联和共价偶联法1 1、直接固定法、直接固定法n不使用载体，借助不使用载体，借助物理、化学方法物理、化学方法将细胞直接固定将细胞直接固定 eg.微生物细胞：加热、冰冻、微生物细胞：加热、冰冻、-射线射线 柠檬酸、絮凝剂、交联剂、变性剂柠檬酸、絮凝剂、交联剂、变性剂作用作用使菌体内起破坏作用的蛋白酶等变性，防止目的酶蛋白使菌体内
33、起破坏作用的蛋白酶等变性，防止目的酶蛋白被水解被水解使细胞结构固定，避免目的酶的泄漏使细胞结构固定，避免目的酶的泄漏使菌体聚集，避免酶的流失，促进较大的菌体颗粒形成使菌体聚集，避免酶的流失，促进较大的菌体颗粒形成适用范围适用范围一般只能用于单酶或少数几种酶的催化反应一般只能用于单酶或少数几种酶的催化反应2、吸附法、吸附法定义定义n通过载体与细胞间的静电引力使细胞固定通过载体与细胞间的静电引力使细胞固定吸附剂吸附剂：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金 属丝网、微载体和中空纤维等属丝网、微载体和中空纤维等影响因素影响因素表面电荷密度的大小表面电荷密度
34、的大小电荷性质电荷性质载体的性质载体的性质2、吸附法、吸附法n条件温和，方法简单，可再生条件温和，方法简单，可再生n稳定性差稳定性差适用范围适用范围制备固定化动物细胞的主要方法制备固定化动物细胞的主要方法固定化植物细胞因成本高、难以大规模生产而固定化植物细胞因成本高、难以大规模生产而受限受限3、包埋法、包埋法 n包理法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情包理法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法定化方法优点优点操作简单操作简单包埋条件温和包埋条件温和能较好的保持细胞内多酶系统的活
35、力，可象游离细胞能较好的保持细胞内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产那样进行产物的发酵生产适用范围适用范围：固定活细胞、增殖细胞。主要利用菌体的单种固定活细胞、增殖细胞。主要利用菌体的单种 酶或极少数几种酶酶或极少数几种酶方法种类方法种类：凝胶包埋法；半透膜包埋法凝胶包埋法；半透膜包埋法3、包埋法、包埋法 凝胶包埋法凝胶包埋法载体载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺等琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺等举例举例 (1)琼脂凝胶包埋法琼脂凝胶包埋法 (2)海藻酸钙包埋法海藻酸钙包埋法4、交联和共价偶联法、交联和共价偶联法n交联剂和共价偶联试剂对细胞的毒性较大，
36、应用交联剂和共价偶联试剂对细胞的毒性较大，应用交联法和共价偶联法固定化细胞的报道较少交联法和共价偶联法固定化细胞的报道较少u操作稳定性高操作稳定性高n在温和条件下进行在温和条件下进行n开发新的温和的功能试剂及偶联试剂开发新的温和的功能试剂及偶联试剂第四节提要第四节提要固定化细胞的概念和目的固定化细胞的概念和目的固定化细胞的特点固定化细胞的特点固定化细胞的分类固定化细胞的分类细胞固定化方法及特点细胞固定化方法及特点细胞类型细胞类型形状形状生理状态生理状态直接固定法直接固定法吸附法吸附法包埋法包埋法交联和共价偶联法交联和共价偶联法第四节结束第四节结束n点击返回 第五节第五节 固定化原生质体和辅酶固
37、定化原生质体和辅酶一一、固定化原生质体固定化原生质体 二二、固定化辅酶固定化辅酶一一、固定化原生质体固定化原生质体原生质体的制备原生质体的制备收集对数生收集对数生长期的细胞长期的细胞悬浮在含有渗透压稳悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中定剂的高渗缓冲液中加细胞壁水加细胞壁水解酶破壁解酶破壁分离，除去细胞壁碎片、分离，除去细胞壁碎片、未作用的细胞以及酶未作用的细胞以及酶得到原生质体得到原生质体一一、固定化原生质体固定化原生质体原生质体的固定化方法原生质体的固定化方法 凝胶包埋法凝胶包埋法琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、光交联树琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、光交联树脂等脂等方法同细胞的固定化
38、方法同细胞的固定化一一、固定化原生质体固定化原生质体固定化原生质体的特点固定化原生质体的特点 增加细胞膜透性，利于氧气和营养物质的传递和增加细胞膜透性，利于氧气和营养物质的传递和吸收，以及胞内物质分泌，提高产率吸收，以及胞内物质分泌，提高产率操作与保存稳定性好操作与保存稳定性好利于产物的分离纯化利于产物的分离纯化需添加渗透压稳定剂需添加渗透压稳定剂二、固定化辅酶二、固定化辅酶原因原因n有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应的催化反应 n有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生再生 n有机辅因
39、子价格昂贵有机辅因子价格昂贵工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生再生二、固定化辅酶二、固定化辅酶方法方法(1)辅基的固定化辅基的固定化 共价偶联法。琼脂糖、纤维素、玻璃珠、高分子合共价偶联法。琼脂糖、纤维素、玻璃珠、高分子合成载体等成载体等(2)辅酶的固定化辅酶的固定化 溴化氰法、碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联；溴化氰法、碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联；或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中 琼脂糖、纤维素、合成高分子、微孔玻璃、水溶性琼脂糖、纤维素、合成高分子、微孔玻璃、水溶性葡聚糖、聚氨基酸等
40、葡聚糖、聚氨基酸等辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍(2)辅酶的固定化辅酶的固定化n辅酶固定化的形式辅酶固定化的形式第五节第五节 固定化原生质体和辅酶固定化原生质体和辅酶固定化原生质体固定化原生质体 固定化辅酶固定化辅酶原生质体的制备原生质体的制备原生质体的固定化方法原生质体的固定化方法固定化原生质体的特点固定化原生质体的特点原因原因 方法方法 辅酶固定化的形式辅酶固定化的形式第五节结束第五节结束n点击返回 第六节第六节 酶反应器酶反应器一、概述一、概述二、酶反应器的类型二、酶反应器的类型三、酶反应器的选择三、酶反应器的选择 四、酶反应器的
41、操作四、酶反应器的操作一、概述一、概述 酶反应器：利用生物化学原理使酶完成催化作用酶反应器：利用生物化学原理使酶完成催化作用的装置，它为酶促反应提供合适的场所和最佳的的装置，它为酶促反应提供合适的场所和最佳的反应条件，使底物最大限度的转化为物反应条件，使底物最大限度的转化为物 作用作用：为酶提供适当环境，以达到生物化学转化：为酶提供适当环境，以达到生物化学转化的目的，使底物生成所需产物的目的，使底物生成所需产物 特点特点：低温、低压下作用；不表现自催化方式，：低温、低压下作用；不表现自催化方式，即细胞的连续再生即细胞的连续再生二、酶反应器的类型二、酶反应器的类型 分类：分类：、等等结构结构反应
42、器类型反应器类型操作操作特点特点分批式分批式（间歇式、不连（间歇式、不连续式）续式）酶与底物一次性装入反酶与底物一次性装入反应器，经一定时间，取应器，经一定时间，取出反应物，进行下一轮出反应物，进行下一轮操作操作灵活性大；小批量、多品种生产；灵活性大；小批量、多品种生产；反应器结构简单，易控制。劳动反应器结构简单，易控制。劳动强度大，质量稳定，底物、产物强度大，质量稳定，底物、产物抑制抑制流加分批式流加分批式（补料（补料-分批式）分批式）连续补充底物，但不取连续补充底物，但不取出反应物出反应物对反应过程中发生底物抑制等情对反应过程中发生底物抑制等情况时比较有利况时比较有利连续式连续式连续加入底
43、物溶液，同连续加入底物溶液，同样流速排出反应液反应样流速排出反应液反应条件稳定条件稳定便于自动控制，劳动强度低，反便于自动控制，劳动强度低，反应条件恒定，产品质量稳定，适应条件恒定，产品质量稳定，适于大规模生产。但操作要求高，于大规模生产。但操作要求高，反应器不能它用，事故处理困难反应器不能它用，事故处理困难几何形状几何形状 操作方式操作方式二、酶反应器的类型二、酶反应器的类型 分类：分类：、几何形状、操作方式等、几何形状、操作方式等结构结构反应器类型反应器类型适用的操作方式适用的操作方式适用的酶适用的酶搅拌罐式反应器搅拌罐式反应器分批式、流加分批式、连续式分批式、流加分批式、连续式游离酶、固
44、定化酶游离酶、固定化酶填充床式反应器填充床式反应器连续式连续式固定化酶固定化酶流化床反应器流化床反应器分批式、流加分批式、连续式分批式、流加分批式、连续式固定化酶固定化酶鼓泡式反应器鼓泡式反应器分批式、流加分批式、连续式分批式、流加分批式、连续式游离酶、固定化酶游离酶、固定化酶膜反应器膜反应器连续式连续式游离酶、固定化酶游离酶、固定化酶喷射式反应器喷射式反应器连续式连续式游离酶游离酶二、酶反应器的类型二、酶反应器的类型1、搅拌罐式反应器、搅拌罐式反应器2、填充床式反应器、填充床式反应器3、流化床反应器、流化床反应器4、鼓泡式反应器、鼓泡式反应器5、膜反应器、膜反应器6、喷射式反应器、喷射式反应
45、器1、搅拌罐式反应器、搅拌罐式反应器n酶催化反应中最常用的反应器酶催化反应中最常用的反应器n反应罐、搅拌器和保温装置组成反应罐、搅拌器和保温装置组成 n分批搅拌罐式反应器分批搅拌罐式反应器(BSTR)、连续搅拌罐式反、连续搅拌罐式反应器应器(CSTR)1、搅拌罐式反应器、搅拌罐式反应器特点特点n酶与底物混合均匀，结构简单酶与底物混合均匀，结构简单n温度、温度、pH易控制，传质阻力低易控制，传质阻力低nBSTR可用于流加分批式反应，可用于流加分批式反应，CSTR只适用于只适用于固定化酶固定化酶n反应效率低，载体易被剪切力破坏反应效率低，载体易被剪切力破坏n搅拌动力消耗大搅拌动力消耗大2、填充床式
46、反应器、填充床式反应器n用于固定化酶用于固定化酶n固定化酶堆叠在一起，固定不动，底物溶液按一固定化酶堆叠在一起，固定不动，底物溶液按一定方向以一定速度流过反应床定方向以一定速度流过反应床 2、填充床式反应器、填充床式反应器特点特点n设备简单，操作方便设备简单，操作方便n固定化酶密度大，提高催化反应速度固定化酶密度大，提高催化反应速度n底层的固定化酶颗粒所受压力大，易变形或破碎底层的固定化酶颗粒所受压力大，易变形或破碎3、流化床反应器、流化床反应器n用于固定化酶用于固定化酶n固定化酶置于反应器内，底物溶液以一定流速由下而上固定化酶置于反应器内，底物溶液以一定流速由下而上流过，同时反应液连续排出，
47、酶颗粒在不断悬浮翻动状流过，同时反应液连续排出，酶颗粒在不断悬浮翻动状态下进行催化反应态下进行催化反应 3、流化床反应器、流化床反应器特点特点n混和均匀，传质和传热效果好混和均匀，传质和传热效果好n温度和温度和pH易控制易控制n不易堵塞，黏度较大反应液也可以进行反应不易堵塞，黏度较大反应液也可以进行反应n剪切力及碰撞可能使固定化酶颗粒破坏剪切力及碰撞可能使固定化酶颗粒破坏n流体动力学变化大，参数复杂，难于放大流体动力学变化大，参数复杂，难于放大 4、鼓泡式反应器、鼓泡式反应器n无搅拌装置无搅拌装置n利用从反应器底部通入的气体产生的大量气泡，利用从反应器底部通入的气体产生的大量气泡，在上升过程中
48、起到提供反应底物和混合两种作用在上升过程中起到提供反应底物和混合两种作用n三相流化床反应器三相流化床反应器4、鼓泡式反应器、鼓泡式反应器特点特点n结构简单，操作容易，剪切力小结构简单，操作容易，剪切力小n物质与热量传递效率高物质与热量传递效率高n有气体参与的酶催化反应中常用的反应器有气体参与的酶催化反应中常用的反应器n气体需通过分布器进行分布气体需通过分布器进行分布5、膜反应器、膜反应器n酶催化反应与半透膜分离作用组合在一起酶催化反应与半透膜分离作用组合在一起n固定化酶、游离酶固定化酶、游离酶5、膜反应器、膜反应器5、膜反应器、膜反应器n集反应与分离于一体，利于连续化生产集反应与分离于一体，利
49、于连续化生产n对于游离酶反应来说，酶可以回收循环使用，特对于游离酶反应来说，酶可以回收循环使用，特别使用于价格较高的酶别使用于价格较高的酶n能降低或消除产物抑制作用能降低或消除产物抑制作用n使用一段时间后，酶或其它杂质易吸附在膜上，使用一段时间后，酶或其它杂质易吸附在膜上，造成膜的透过性降低，而且清洗困难造成膜的透过性降低，而且清洗困难6、喷射式反应器、喷射式反应器n利用高压蒸汽的喷射作用，实现酶与底物的混合，利用高压蒸汽的喷射作用，实现酶与底物的混合，进行高温短时催化反应的一种反应器进行高温短时催化反应的一种反应器n游离酶游离酶6、喷射式反应器、喷射式反应器特点特点n结构简单，体积小，混合均
50、匀结构简单，体积小，混合均匀n温度高，反应速度快，催化效率高温度高，反应速度快，催化效率高n只适用于某些耐高温酶的反应只适用于某些耐高温酶的反应三、酶反应器选择三、酶反应器选择1、酶的应用形式、酶的应用形式2、底物或产物的物理性质、底物或产物的物理性质3、酶反应动力学、酶反应动力学4、酶的稳定性、酶的稳定性5、反应的操作要求、反应的操作要求6、反应器应用的可塑性及成本、反应器应用的可塑性及成本1、酶的应用形式、酶的应用形式n游离酶回收困难，只适于分批反应器游离酶回收困难，只适于分批反应器n颗粒状或片状固定化酶可用连续搅拌罐、填充床颗粒状或片状固定化酶可用连续搅拌罐、填充床反应器反应器n膜状和纤
