1、题题 纲纲1.结核与肺癌鉴别诊断相关实验室检测结核与肺癌鉴别诊断相关实验室检测2.结核与不典型肺部感染相关实验室检测结核与不典型肺部感染相关实验室检测3.结核与肺部真菌感染相关实验室检测结核与肺部真菌感染相关实验室检测4.结核与肺吸虫感染相关实验室检测结核与肺吸虫感染相关实验室检测5.T-SPOT技术在结核鉴别诊断中应用价值技术在结核鉴别诊断中应用价值第一第一.结核与肺癌鉴别诊断相关实结核与肺癌鉴别诊断相关实验室检测验室检测lSputum Cytology痰液脱落细胞学lFlexible Bronchoscopy and Biopsy纤维支气管检测lTTNA transthoracic nee
2、dle aspiration 经皮肺穿刺lCell Type Accuracy细胞分型准确性l中央的病变、支气管镜检查是确中央的病变、支气管镜检查是确定恶性肿瘤诊断的最灵敏的方法。定恶性肿瘤诊断的最灵敏的方法。小的(小的(ieie,2 cm,70单位单位-诊断诊断l如果胸膜液如果胸膜液干扰素高干扰素高-诊断诊断l胸膜活检肉芽肿胸膜活检肉芽肿-诊断诊断l如果淋巴细胞的渗出液和如果淋巴细胞的渗出液和PPDPPD阳性,如果胸阳性,如果胸膜液膜液ADAADA超出超出4040,对结核病胸膜炎治疗,对结核病胸膜炎治疗l如果淋巴细胞的渗出物和阴性的如果淋巴细胞的渗出物和阴性的PPDPPD,5 5周周后重新试
3、验后重新试验PPDPPD,如果阳性治疗,如果阳性治疗。第二,结核与不典型肺部感染相第二,结核与不典型肺部感染相关实验室检测关实验室检测 1.细菌细菌急性发作,高烧、咳嗽急性发作,高烧、咳嗽,脓性痰,脓性痰,CRP浓度高,典型临床的浓度高,典型临床的发现发现和和X ray2.非典型非典型l细菌细菌肺炎链球菌,嗜血杆菌、莫拉氏菌属、革兰肺炎链球菌,嗜血杆菌、莫拉氏菌属、革兰氏阴性杆菌,其它氏阴性杆菌,其它l非典型非典型“lMycoplasma pneumoniae肺炎支原体lChlamydia pneumoniae肺炎衣原体lLegionella sp.军团菌lViruses病毒l每每45年爆发流
4、行年爆发流行l可检测散在病例可检测散在病例l病原体直接检测培养抗原检测DNA 检测(PCR)l抗体检测l培养慢,敏感性低l抗原检测未广泛使用,敏感性低lDNA 检测(PCR)非常有希望l主要问题是符合要求标本l补体结合反应(CBR)抗体滴度4倍升高最灵敏和最特异l酶联免疫检测(EIA)IgG,IgA,IgM 种类根据不同试验厂家,结果有差异。l不同的厂商5种试剂盒l所有血清检测IgG、IgA,IgM抗体l一组CBR阳转和CBR阴性的血清l敏感性IgA 68-97%,IgM 87-97%l特异性IgA 76-100%,IgM 60-99%l阳性预测值PPVIgA 91-99%,IgM 90-99
5、%l阴性预测值NPVIgA 50-90%,IgM 78-91%l高灵敏度结合低特异性,反之亦然高灵敏度结合低特异性,反之亦然l没有一个厂家没有一个厂家IgA和和IgM两者检测都两者检测都具有高品质具有高品质l仔细的选择厂商并且使用试剂是非常重仔细的选择厂商并且使用试剂是非常重要。要。没有一种方法是十全十美没有一种方法是十全十美,高灵敏度具高灵敏度具有低特异性有低特异性。l常见于老年人,导致其它的疾病患常见于老年人,导致其它的疾病患者并发症。者并发症。局部地爆发,没有典型的周期性。局部地爆发,没有典型的周期性。l病原体直接检测培养抗原检测DNA 检测(PCR)l抗体检测l培养困难l抗原检测特异性
6、和敏感性低lDNA 检测(PCR)非常有希望l主要问题是符合要求标本lEIA酶免疫属特异的、在感染初期灵敏较差、疾病痊愈后一段时间检出抗体lImunofluorescent test(MIF)免疫荧光金标准,耗时间和费力lImmunoblott免疫印迹l一组有临床的和微生物学的标志,急性的肺炎衣原体感染患者43份血清l一致结果(MIF and IB)63%l免疫印迹阴性或临界IgA21%lIB 阴性,MIF 阳性16%l恢复期患者血样结果证明诊断lC.trachomatis 呼吸道感染患儿(6)100%l检测一组80份若干月持续IgG和IgA MIF肺炎衣原体抗体血清lIB 阳性 IgG an
7、d IgA31%lIB 阳性 仅仅IgG 51%lIB 阴性 18%lIB免疫印迹是一种验证方法免疫印迹是一种验证方法。lIB 敏感性比敏感性比MIF低(急性感染早期低(急性感染早期可能为阴性可能为阴性)。结果的解释应该根据实验室和临床结果的解释应该根据实验室和临床资料以及患者病史。资料以及患者病史。所谓持续感染是诊断的问题。所谓持续感染是诊断的问题。只有只有l肺炎支原体和肺炎衣原体的诊断主要依肺炎支原体和肺炎衣原体的诊断主要依靠抗体检测试验。靠抗体检测试验。l培养和培养和 PCR有其各自局限性有其各自局限性(符合要求符合要求标本标本)l仔细选择试验以及利用临床资料合理解仔细选择试验以及利用临
8、床资料合理解释结果似乎是主要的。释结果似乎是主要的。l没有解释,结果造成误导。没有解释,结果造成误导。第三,结核与肺部真菌感染鉴别第三,结核与肺部真菌感染鉴别诊断相关实验室检测诊断相关实验室检测l形态学检查为检测真菌的重要手段形态学检查为检测真菌的重要手段l抗原检测适合血清和脑脊液中隐球菌、抗原检测适合血清和脑脊液中隐球菌、念珠菌、荚膜组织胞浆菌。念珠菌、荚膜组织胞浆菌。l血清学诊断适用于深部真菌感染血清学诊断适用于深部真菌感染。标本直接镜检抗原检出分离培养不染色乳酸酚棉蓝染色墨汁染色氢氧化钾消化后涂片镜检二相性真菌脑心浸液脑心浸液沙氏培养基病原性真菌血琼脂平板观察菌落性状和菌丝孢子形态l 真
9、菌的真菌的菌落菌落一般是指在一定基质上,接种某一般是指在一定基质上,接种某种真菌的一个孢子或一段菌丝,经过培养,向种真菌的一个孢子或一段菌丝,经过培养,向四周蔓延生长出丝状的群体称为真菌菌落。菌四周蔓延生长出丝状的群体称为真菌菌落。菌落呈放射状生长,因而菌落外周的生命力最旺落呈放射状生长,因而菌落外周的生命力最旺盛。在不同成分的培养基上和不同条件下培养,盛。在不同成分的培养基上和不同条件下培养,同一种真菌,形成的菌落也有差别。因此,同一种真菌,形成的菌落也有差别。因此,菌菌落的形态观察是指在固定的条件下,菌落所表落的形态观察是指在固定的条件下,菌落所表现的形状、大小、色泽和结构等。不同的真菌现
10、的形状、大小、色泽和结构等。不同的真菌菌落所表现特征差别显著,它为真菌分类工作菌落所表现特征差别显著,它为真菌分类工作提供了重要的依据。提供了重要的依据。l除酵母菌的菌落比较简单,丝状真菌的除酵母菌的菌落比较简单,丝状真菌的菌落形态各种各样。常以下述特征加以菌落形态各种各样。常以下述特征加以描述。描述。l其其颜色颜色的多样很难用色泽描述,常借助的多样很难用色泽描述,常借助于色谱加以鉴别。很多真菌产生多种颜于色谱加以鉴别。很多真菌产生多种颜色的色素,使菌落的背面染有颜色,有色的色素,使菌落的背面染有颜色,有的甚至分泌可溶性色素,扩散到全部基的甚至分泌可溶性色素,扩散到全部基质中去。质中去。l气生
11、菌丝构成气生菌丝构成表面表面菌丝体菌丝体质地质地。底部菌丝体埋伏于培养基。底部菌丝体埋伏于培养基中或紧贴培养基表面向四周蔓延,中或紧贴培养基表面向四周蔓延,l由底部体直接生出分生孢子梗,菌落外观呈由底部体直接生出分生孢子梗,菌落外观呈短茸毛短茸毛状,状,l由底部菌丝体生出气生菌丝,再由它生出分生孢子梗,因由底部菌丝体生出气生菌丝,再由它生出分生孢子梗,因而往往有缠绕的气生菌丝团,一般菌落而往往有缠绕的气生菌丝团,一般菌落较厚,呈絮状较厚,呈絮状。l也有部分气生菌丝扭结成绳索、还有分生孢子梗自底部菌也有部分气生菌丝扭结成绳索、还有分生孢子梗自底部菌丝成束地生长,在菌落的外观上丝成束地生长,在菌落
12、的外观上成粒状或粉状成粒状或粉状。l有些真菌产生子实体或菌核,则菌落表面呈有些真菌产生子实体或菌核,则菌落表面呈颗粒结构颗粒结构。l有的菌落出现有的菌落出现同心环同心环或或辐射状沟纹辐射状沟纹。l有的真菌只在菌落中间区域生出分生孢子头,边缘菌丝则有的真菌只在菌落中间区域生出分生孢子头,边缘菌丝则不生育。不生育。l菌落的大小也大有不同,有些种的菌落可蔓延扩展到整个菌落的大小也大有不同,有些种的菌落可蔓延扩展到整个培养基,而另一些种的菌落则局限生长。培养基,而另一些种的菌落则局限生长。l菌落表面菌落表面平滑或具皱纹、致密或疏平滑或具皱纹、致密或疏松、同心环或辐松、同心环或辐 射状沟纹等;射状沟纹等
13、;菌落质菌落质地地绒毛状、毡状、棉絮状、羊毛状、绒毛状、毡状、棉絮状、羊毛状、束状、绳索状、粉粒状、明胶状或皮革束状、绳索状、粉粒状、明胶状或皮革状等;状等;菌落的边缘菌落的边缘可呈全缘、锯齿可呈全缘、锯齿状、树枝状或纤毛状等;状、树枝状或纤毛状等;菌落高度菌落高度扁平、丘状隆起、中心部分突起或凹陷扁平、丘状隆起、中心部分突起或凹陷等。等。193 patients(392 samples);43 with ICSensitivity SpecificityMannan(ag)40%98%Antimannan(ab)53%94%ag and/or ab80%93%Sendid B et al,J
14、 Clin Microbiol 1999;37:1510-7n=362 high-risk neutropenic patientsSandwich ELISA 2 times weekly,11.7%positiven=30 proven IAn=9 probable IAn=264 with no IASensitivity89.7%Specificity98.1%PPV87.5%NPV98.4%Maertens J et al,Blood 2001;97:1604-10l与临床诊断和疗效反应有良好的一致性。与临床诊断和疗效反应有良好的一致性。l检测方法有检测方法有ELISAELISA、放
15、射免疫分析(、放射免疫分析(RIARIA)和乳胶凝)和乳胶凝集试验等,但敏感性低。集试验等,但敏感性低。lELISAELISA检测检测2424只兔只兔(王莉,等。王莉,等。2003)2003)敏感性敏感性和和特异性特异性:血清血清 95%78%95%78%尿液尿液 90%51.4%90%51.4%l使用仪器及配套试剂盒能快速地检测出使用仪器及配套试剂盒能快速地检测出血液和体液中真菌血液和体液中真菌-1,3-1,3葡聚糖的实际葡聚糖的实际含量,对真菌的早期诊断具有重要意义。含量,对真菌的早期诊断具有重要意义。FuruyaFuruya的报道即使是的报道即使是确诊确诊的深部真的深部真菌感染患者菌感染
16、患者,-1,3-D-,-1,3-D-葡聚糖检测葡聚糖检测也有可能是阴性也有可能是阴性,因此单次因此单次-1,3-1,3-D-D-葡聚糖检测阴性并不能排除深部葡聚糖检测阴性并不能排除深部真菌感染的可能真菌感染的可能,必須在必須在疾病的过疾病的过程中重复进行程中重复进行-1,3-D-1,3-D-葡聚糖检测葡聚糖检测。Furuya T et al.Usefulness of-D-glucan measurement for diagnosis of deep mycosis,Jnp J Antibiot 1993;46(6):437-443临床表现及影像学检查临床表现及影像学检查:1)1)发热、咳嗽
17、、痰血发热、咳嗽、痰血1010余天余天 2)2)抗生素治疗效果不佳抗生素治疗效果不佳 3)3)胸部胸部CTCT检查检查,发现左肺阴影发现左肺阴影 支氣管鏡活組織檢查支氣管鏡活組織檢查:找見真菌找見真菌l核酸碱基GC比分析l限制性片段长度多态性lSouthern印迹分析l脉冲场凝胶电泳(PFGE)lPCRl随机扩增多态性(RAPD)lDNA片段测序等Yu J,et al.Mycopathologia,2004.引物OPK20 RAPD扩增结果l浅部真菌直接显微镜检查l深部真菌标本培养、观察培养物性状并借助理化特性作鉴别。l It is highly recommended that a dire
18、ct microscopic examination be made on most this provide an immediate presumptive diagnosis for the physician,but it may also aid in the selection of an appropriate culture medium.l A phase-contrast microscope is a valuable adjunct in the direct examination of specimens.The advantages include the fol
19、lowing:1)mounts can be made and examined quickly;2)there is no need for direct staining;and3)the objects can be clearly visualized.lDetermination of antibody and/or antigen titers may be useful in diagnosing fungal infections and when performed in a serial fashion also provide a means of monitoring
20、the progression of disease and the patients response to therapy.lWith the exceptionof antibody tests for l histoplasmosis and occidioidomycosis,l however,most tests designed to detect an antibody response as a means of diagnosing invasive fungal infections lack sensitivity and specificity,are poorly
21、 standardized and are not widely availableTests for detection of fungal antibodies(2)lAntibody tests for Candida and Aspergillus.Are often unable to distinguish active from past infection and Colonization from transient fungemia In addition,a negative test for fungus-specific antibodies does not rul
22、e out infection because imunocompromised patients,and some individuals with disseminated infection may not mount an antibody response to the infecting organism.lDetection of fungal antigens or metabolites in serum or other body fluids represents the most direct means of providing a serologic diagnos
23、is of invasive fungal infection.lBoth the RIA and the EIA tests have been shown to be rapid,sensitive,specific,rapid,and reproducible.lAlthough significant advances have been made in recent years,most methods for rapid detection of fungal antigens are available only in research laboratories.lNotable
24、 exceptions are the tests for detection of the polysaccharid ride antigens of C.neoformans and H.capsulatumd.lThe use of the PCR to detect fungal nucleic acids directly in clinical material offers great promise for the rapid diagnosis of fungal infections.lIn addition to detection of fungal pathogen
25、s in clinical terid,immunologic and molecular approaches have been applied successfully to the identification of fungi in culture.第四,结核与肺吸虫感染相关实第四,结核与肺吸虫感染相关实验室检测验室检测卫氏并殖吸虫卫氏并殖吸虫Paragonimus westermaniParagonimus westermani (肺吸虫)(肺吸虫)一一.形形 态态(一一)成虫形态特征成虫形态特征:1.1.外部形态外部形态:(1 1)形状)形状 椭圆形椭圆形 肥厚肥厚 背隆起背隆起
26、 腹扁平腹扁平 半粒黄豆状半粒黄豆状 (2 2)大小)大小 长长7.5 7.5 12 mm 12 mm 宽宽4 46mm6mm (3 3)颜色)颜色 活时半透明肉红色活时半透明肉红色 固定后灰白色固定后灰白色 (4 4)口、腹吸盘位置及大小比例)口、腹吸盘位置及大小比例 :口吸盘:前端口吸盘:前端 腹面腹面 与腹吸盘大小相仿与腹吸盘大小相仿 腹吸盘:腹中横线稍前腹吸盘:腹中横线稍前2.2.内部结构内部结构:(1)(1)生殖系统生殖系统 雌雄同体雌雄同体 特征特征 “并列排列并列排列”雄性生殖系统雄性生殖系统 1 1对睾丸边缘分支对睾丸边缘分支 左右并列左右并列于于 虫体后虫体后1/31/3处处
27、 雌性生殖系统雌性生殖系统 卵巢分叶卵巢分叶 子宫管状弯曲盘绕内子宫管状弯曲盘绕内 含虫卵含虫卵 二者二者左右并列左右并列 (2)(2)消化系统消化系统 同概论同概论 但但2 2支肠管呈螺旋状弯曲支肠管呈螺旋状弯曲肺肺 吸吸 虫虫 成成 虫虫肺肺 吸吸 虫虫 虫虫 卵卵二二.生活史生活史(一一)发育过程发育过程:虫虫卵卵粪便入水川卷螺毛毛蚴蚴胞胞蚴蚴母母子子 雷雷蚴蚴尾尾蚴蚴出螺入水淡水蟹、喇蛄囊囊蚴蚴(肺)肺)成成 虫虫人食入 童虫童虫成虫成虫 第一中间宿主(无性增殖)第二中间 宿主 终宿主(有性生殖)肺吸虫囊蚴脱囊而出肺吸虫囊蚴脱囊而出 川川 卷卷 螺螺1.宿主关系:第一中间宿主:川卷螺
28、第二中间宿主:淡水蟹 喇蛄 终宿主:人 保虫宿主:食肉动物如猫、犬、虎、豹、狼、狐等 转续宿主:野猪等2.感染阶段:囊蚴 感染途径与方式:经口感染,食入含囊蚴的淡水蟹、喇蛄而感染3.寄生部位(成虫):肺 异位寄生部位:皮下组织 肝 脑 脊髓等处 成虫寿命:一般56年 三三.致致 病病v临床分型:1.胸肺型肺吸虫病 似肺结核症状 2.腹型肺吸虫病 3.脑型肺吸虫病 4.皮下型肺吸虫病 皮下多处结节 5.肝型肺吸虫病 肺吸虫寄生于肺肺吸虫寄生于肺四四.实验诊断实验诊断 v病原检查:病原检查:1.检查阶段:虫卵或童虫2.取材:粪便 痰液3.方法:查虫卵 (1)生理盐水直接涂片法 (2)集卵法 氢氧化
29、钠消化法 查童虫 皮下结节活组织检查v免疫学诊断免疫学诊断五五.流行及防治流行及防治v关键因素:当地人群有生食或半生食含囊蚴的 淡水蟹、喇蛄的习惯v防治关键:勿生食淡水蟹、喇蛄 生、熟食菜板要分开第五,第五,T-SPOT技术在结核鉴技术在结核鉴别诊断中应用价值别诊断中应用价值全球最准确的快速结核感染检测l原理:结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞,效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子(IFN-)。因此,检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。l由于效应T细胞存活时间很短,而且具有特异性,因此可以作为机体是否正处于被感染的指标,无论是否有临床症状。l利用结核杆菌
30、感染者外周血单核细胞中存在结核特异的效应T淋巴细胞,这些淋巴细胞在受到结核杆菌特异抗原刺激后分泌IFN-而设计的T细胞免疫斑点试验。l利用高灵敏的酶联免疫试验(ELISPOT)检测对结核菌特异的T淋巴细胞的方法,为结核病快速诊断开辟了一条新的思路。Mahairas等在1996年发现的一段存在结核分枝杆菌(简称结核杆菌)中名为“RD1”的基因序列,而在卡介苗菌株和大部分环境分枝杆菌的基因中则缺乏RD1序列。RD1编码产生2种蛋白:ESAT-6(early secreted antigenic target 6)和CFP-10(culture filtrate protein 10),ESAT-6
31、和CFP-10作为特异性抗原刺激机体特异性T细胞产生IFN-。lELISPOT的灵敏性决定了T SPOT-TB的灵敏性lESAT-6和CFP-10两个抗原的特异性决定了T SPOT-TB的特异性l特异性高:只针对结核分枝杆菌复合群敏感,对BCG和大多数环境分枝杆菌不敏感,特异性 99%。l灵敏度高:对活动性结核及肺外结核,敏感性96%。l快速简便:简单的实验室血液检查,24小时报告结果。ReferenceSensitivityJafari et al 2006 AJRCCM 174;9:1048-53100.0%(12/12)Ferrara et al Lancet 2006 376;1328
32、-34*83.3%(20/24)Lee et al Eur Respir J 2006 28;24-30*96.6%(84/87)Goletti et al Clin Microbiol Infect 2006 12;6:544-50*91.3%(21/23)Meier et al EJCMID 2005 24;529-53695.9%(70/73)Kang et al Chest.2007 Sep;132(3):959-65*92.2%(59/64)Janssens et al ERJ 2007 30(4):722-898.3%(57/58)Clarke et al Clin Exp Imm
33、unol 2007 150(2):238-44.90.0%(27/30)Detjen et al CID 2007 1;45(3):322-8*92.9%(26/28)Ozekinci et al J Int Med Res 2007;35:696-70392.9%(26/28)Soysal et al IJTLD 2008 12(1):50-56*80.8%(80/99)Dominguez et al Clin Vacc Immunol 2008 15(1);168-71*85.7%(36/42)Chee et al J Clin Microbiol.2008 Apr 9*94.1%(254
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36、62/63)Higuchi Med Microbiol Immunol.2008.Epub ahead of print*95.9%(47/49)TOTAL92.0%(1139/1238)GuidelinesSpecifically mentioned IGRAs for the following uses:Children(4 weeks to 2 years)NHS employees Contact tracing New Entrants lIn LTBI TST should be carried out first and those that are positive shou
37、ld be considered for IGRA testing if available.This would also apply to new entrant screening.lIGRAs should be the only test used in the following situations:Where TST may be falsely negative due to immunosuppressionWhen screening a large number of people as part of a public health investigations si
38、nce repeated visits would be impracticallSpecific applications of IGRAs were mentioned:New health care workers should be tested with IGRAsIn pre-TNF alpha screening IGRAs may be a suitable alternative in BCG vaccinated subjects.lThese guidelines were issued in November 2005:lConfirm positive Mantoux
39、 tests with a blood testlUse only a blood test in immunocompromised subjectslChildren are excluded from being tested with blood testslIn December 2007 guidelines for TNF screening were released:lAll patients being considered for TNF therapy should be screened for LTBIlScreening should be based on hi
40、story,chest x-ray and IGRAlTST is no longer recommendedlPatients with abnormal x-ray should further testing and be treated accordinglylPreventive treatment should be given where LTBI is suspected as a result of:Positive IGRAAbnormal x-ray suggesting TB which was not adequately treatedHistory of sign
41、ificant prior exposurelThe Gold version of the Cellestis ELISA can be used in all cases where the tuberculin skin test is recommendedlGold should be used instead of the tuberculin skin test and not in addition to itlConcern has been expressed that Gold is less sensitive than the skin test so a negat
42、ive Gold test should not be used alone to exclude LTBI in the immunosuppressed,children less than 5 years old,or patients about to undergo TNF alpha therapy.l112例结核病患者中,107例结核病患者T-SPOT.TB阳性,提示方法敏感度为95.5(其中4例骨结核患者均为阳性);l119例非结核样本中(30名健康对照,24例丙肝患者和65例非结核呼吸道疾病患者),2例健康体检者阳性,提示方法特异性为98.4;结果显示:T-SPOT.TB是较
43、灵敏和特异的快速检测结核菌 感染的方法,可用于结核病的快速诊断。l检测68例HIV感染者;l在HIV感染者总体、CD4200/ul各组中,T-SP0T.TB检测阳性率分别为67.65%,44.44%和70.69%;l结论:T-SPOT.TB检侧在我国HIV感染合并结核潜伏感染的早期快速诊断中有较大应用价值,尤其是在CD细胞计数200/ul的1HV感染人群中l患者,男,18岁l患者于两月前开始无诱因下出现咳嗽、咳痰,痰少,无发热,胸痛,无气急,气喘,无咯血,盗汗。l胸部CT示:两肺多发结节条索影及空洞 l痰AFB涂片(-),痰TBPCR(-),血TBAB(-),经皮肺条涂片:AFB(-),真菌培养(-)lElispot:阴性l血乳胶凝集试验:l 1:640l诊断:隐球菌肺炎l治疗:两性霉素5-FClT-SPOT.TB对于活动性结核,肺外结核、早期结核感染,和潜伏感染都有诊断价值l区分活动性结核和潜伏感染的能力有限,在实际应用中还需要根据患者情况进行分析。