1、.五、神经生物学常用的研究方法五、神经生物学常用的研究方法（一）形态学方法（一）形态学方法（二）生理药理学方法（二）生理药理学方法（三）生物化学方法（三）生物化学方法（四）电生理学方法（四）电生理学方法（五）（五）分子生物学方法分子生物学方法（六）脑成像（六）脑成像（Brain imaging）技术）技术.（一）形态学方法（一）形态学方法1、束路追踪法、束路追踪法2、免疫组织化学法、免疫组织化学法3、原位杂交法、原位杂交法4、受体定位法、受体定位法.束路追踪法束路追踪法 研究神经元之间的纤维联系是神经科学研究领域研究神经元之间的纤维联系是神经科学研究领域的一个基本问题，其研究方法主要有三：的一
2、个基本问题，其研究方法主要有三：（1）利用神经元轴浆运输现象的追踪法，是目前应用）利用神经元轴浆运输现象的追踪法，是目前应用最广者；最广者；（2）利用神经元胞体受损或轴突离断后远侧轴突的变）利用神经元胞体受损或轴突离断后远侧轴突的变性，或轴突切断后胞体的反应特性的变性追踪法；性，或轴突切断后胞体的反应特性的变性追踪法；（3）利用某些荧光染料在神经细胞质膜扩散的神经元）利用某些荧光染料在神经细胞质膜扩散的神经元质膜荧光追踪法。质膜荧光追踪法。.（1）轴浆运输追踪法）轴浆运输追踪法 轴浆运输：神经元有长短不等的轴突，由于轴突内缺轴浆运输：神经元有长短不等的轴突，由于轴突内缺乏参与蛋白质合成的核糖体
3、，所以需要从细胞体不断地将乏参与蛋白质合成的核糖体，所以需要从细胞体不断地将各种成分运输至轴突及其分支以维持其代谢；在神经末梢各种成分运输至轴突及其分支以维持其代谢；在神经末梢释放的神经肽及合成经典递质的酶也需在胞体合成；从末释放的神经肽及合成经典递质的酶也需在胞体合成；从末梢也有影响细胞代谢的物质如神经营养因子等逆向传送至梢也有影响细胞代谢的物质如神经营养因子等逆向传送至胞体。不同物质的运输速度不同。胞体。不同物质的运输速度不同。u顺行运输：从胞体向轴突及其终末的运输。顺行运输：从胞体向轴突及其终末的运输。u逆行运输：从轴突及其终末向胞体的运输。逆行运输：从轴突及其终末向胞体的运输。.常用方
4、法：常用方法：a 辣根过氧化物酶追踪法辣根过氧化物酶追踪法 1971年，年，Kristenson和和Olsson首先报道辣根过氧化物首先报道辣根过氧化物酶（酶（horseradish peroxidase，HRP）可被神经末梢摄取，）可被神经末梢摄取，经轴浆逆行运输至神经元胞体，然后用组织化学方法即可经轴浆逆行运输至神经元胞体，然后用组织化学方法即可显示出神经元的轮廓，从而创建了显示出神经元的轮廓，从而创建了HRP追踪神经元示踪技追踪神经元示踪技术，即术，即HRP法。法。HRP即可作逆行追踪剂使用，也可作顺行追踪剂使用。即可作逆行追踪剂使用，也可作顺行追踪剂使用。基本步骤：基本步骤：将将HRP
5、注射至实验动物中枢核团或周围器官、注射至实验动物中枢核团或周围器官、神经的一定部位；存活一定时间后灌注、固定动物，取材神经的一定部位；存活一定时间后灌注、固定动物，取材作冰冻切片；然后用双氧水（作冰冻切片；然后用双氧水（H2O2）及呈色剂四甲基联苯）及呈色剂四甲基联苯胺（胺（TMD）或二氨基联苯胺（）或二氨基联苯胺（DAB）显示）显示HRP反应产物。反应产物。.将将HRP注射于周围神经感觉末梢注射于周围神经感觉末梢或神经干逆向标记背根神经节细或神经干逆向标记背根神经节细胞后，胞后，HRP还可进一步沿背根节还可进一步沿背根节细胞的中枢突顺向标记其在脊髓细胞的中枢突顺向标记其在脊髓的中枢终止部位，
6、称作跨节标记的中枢终止部位，称作跨节标记。.HRP：1.游离游离HRP：通过非特异性整体胞饮的方式被摄入通过非特异性整体胞饮的方式被摄入 2.结合结合HRP：通过与细胞膜的特异性受体结合的介导进入神经元：通过与细胞膜的特异性受体结合的介导进入神经元 麦芽凝集素（麦芽凝集素（WGA）-HRP 霍乱毒素（霍乱毒素（CT）-HRP 优点：灵敏度高，用量较少，优点：灵敏度高，用量较少，HRP在胞内降解时间明显延长，在胞内降解时间明显延长，能清晰地显示包括细微分支在内的整个神经元的全貌。能清晰地显示包括细微分支在内的整个神经元的全貌。注意：因为注意：因为HRP到达预定部位的时间取决于运输速度和距离，运到
7、达预定部位的时间取决于运输速度和距离，运输速度因动物及纤维种类而异。同时输速度因动物及纤维种类而异。同时HRP被运至胞体后即被送入溶酶被运至胞体后即被送入溶酶体内水解。因此在聚集和降解两个相反的过程中求得最佳存活期必须体内水解。因此在聚集和降解两个相反的过程中求得最佳存活期必须具体测试。具体测试。呈色剂：呈色剂：1.二氨基联苯胺二氨基联苯胺(DAB):DAB作为供氢体，作为供氢体，HRP在在H2O2存存在的情况下，能使在的情况下，能使DAB发生氧化，生成不溶性棕褐色反应产物沉淀，发生氧化，生成不溶性棕褐色反应产物沉淀，定位在抗原所在处。定位在抗原所在处。2.二盐酸联苯胺二盐酸联苯胺(BDHC)
8、3.邻邻-联茴香胺联茴香胺(OD)4.四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)用途：用途：研究脏器的神经支配、中枢内核团间的联系等。还可与免疫组织研究脏器的神经支配、中枢内核团间的联系等。还可与免疫组织化学、电镜技术等结合。化学、电镜技术等结合。.HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat 10 40.HRP labelling neurons in dLGN40.b 荧光素追踪法荧光素追踪法-主要作逆向追踪主要作逆向追踪 1977年，荷兰著名神经解剖学家年，荷兰著名神经解剖学家Kuypers及其同事首及其同事首先发现部分荧光化合物可被神经纤
9、维的末梢摄取，并通过先发现部分荧光化合物可被神经纤维的末梢摄取，并通过轴浆流逆行运输到各自的神经元胞体，切片后在荧光显微轴浆流逆行运输到各自的神经元胞体，切片后在荧光显微镜下可直接观察到这些胞体的定位，从而建立了研究神经镜下可直接观察到这些胞体的定位，从而建立了研究神经纤维联系的荧光素逆行追踪法。纤维联系的荧光素逆行追踪法。原原 理：理：将荧光物质注射至神经元的轴突分布区将荧光物质注射至神经元的轴突分布区,经分支经分支的末梢吸收后，循轴突逆行输送至胞体。在荧光显微镜的末梢吸收后，循轴突逆行输送至胞体。在荧光显微镜 下可看到胞体内呈现荧光标记物。下可看到胞体内呈现荧光标记物。.荧光素追踪剂是一种
10、暴露在一定激发波长光照下，以一定荧光素追踪剂是一种暴露在一定激发波长光照下，以一定发射波长发出一定颜色荧光的化合物。每一种荧光素都有发射波长发出一定颜色荧光的化合物。每一种荧光素都有各自的激发波长和发射波长，不同的发射波长决定了这些各自的激发波长和发射波长，不同的发射波长决定了这些荧光素发出的荧光颜色各异。荧光素发出的荧光颜色各异。不同荧光素在神经元内的标记特征不同：不同荧光素在神经元内的标记特征不同：绝大多数标记细胞质，如荧光金（绝大多数标记细胞质，如荧光金（Furogold，灵敏度，灵敏度高，能较好显示树突分支，只标记胞浆；在胞体内分解慢，高，能较好显示树突分支，只标记胞浆；在胞体内分解慢
11、，甚至在注射后存活甚至在注射后存活2个月标记强度仍无明显变化；比较耐个月标记强度仍无明显变化；比较耐紫外线的照射，褪色比较缓慢；可以经受许多组织学染色紫外线的照射，褪色比较缓慢；可以经受许多组织学染色处理，因而可以和处理，因而可以和HRP、免疫组织化学等结合使用），、免疫组织化学等结合使用），fast bule（固蓝）等。（固蓝）等。只有少数仅标记细胞核，如只有少数仅标记细胞核，如nuclear yellow（核黄（核黄）,diamidino yellow（双脒基黄）等。（双脒基黄）等。.Fast blue labelling neuronsDRGSpinal cord2020.Fast Bl
12、ue LadellingGanglion Cells of Retina 20.优点：可靠性，灵敏性，优点：可靠性，灵敏性，利用其不同颜色可同时追踪和显示多重神经联系利用其不同颜色可同时追踪和显示多重神经联系。因此可选择一。因此可选择一种或两种以上的荧光素分别对神经元进行单标、双标或多重标记。种或两种以上的荧光素分别对神经元进行单标、双标或多重标记。双重标记和多重标记双重标记和多重标记可用来可用来研究神经元轴突的分支投射。研究神经元轴突的分支投射。若在脑若在脑内不同核团或区域分别注射两种（或三种）不同荧光，在同一神经元内不同核团或区域分别注射两种（或三种）不同荧光，在同一神经元胞体内能观察到两
13、种（或三种）不同颜色的荧光，即说明该神经元的胞体内能观察到两种（或三种）不同颜色的荧光，即说明该神经元的轴突分支分别投射到注射这些荧光剂的两个（或三个）脑内不同核团轴突分支分别投射到注射这些荧光剂的两个（或三个）脑内不同核团或区域。或区域。需要注意的是各种荧光素逆行运输的速度不同，所以动物存活时需要注意的是各种荧光素逆行运输的速度不同，所以动物存活时间也有差异。双重标记是，有时需要做两次手术先注射运输慢的荧光间也有差异。双重标记是，有时需要做两次手术先注射运输慢的荧光素，过一定的时间后，再注射运输较快的荧光素。素，过一定的时间后，再注射运输较快的荧光素。缺缺 点：激发光照射下很快褪灭，因此允许
14、观察的时间较短，保存时点：激发光照射下很快褪灭，因此允许观察的时间较短，保存时间也有限。间也有限。应应 用：研究神经元的轴突分支至不同部位的投射。可与免疫组织化用：研究神经元的轴突分支至不同部位的投射。可与免疫组织化学结合，研究投射神经元的化学性质。学结合，研究投射神经元的化学性质。.（2）变性束路追踪法）变性束路追踪法 利用神经元的轴突被损伤之后，在损伤的近利用神经元的轴突被损伤之后，在损伤的近侧端和远侧端分别发生逆行和顺行溃变；神经元侧端和远侧端分别发生逆行和顺行溃变；神经元胞体受损后，其发出的轴突从胞体向终末方向的胞体受损后，其发出的轴突从胞体向终末方向的远侧端发生顺行溃变，来研究纤维的
15、联系。远侧端发生顺行溃变，来研究纤维的联系。.损伤手段：损伤手段：物理性方法物理性方法 锐器的切割、电凝、电离破坏、超声破坏等锐器的切割、电凝、电离破坏、超声破坏等 特点：无选择性，除了损伤神经元和发出的纤维以外，特点：无选择性，除了损伤神经元和发出的纤维以外，也能破坏通过此损伤部位的纤维，导致非特异性标记。也能破坏通过此损伤部位的纤维，导致非特异性标记。化学性破坏化学性破坏 单胺类神经毒剂：单胺类神经毒剂：6-羟多巴胺（可选择性被儿茶酚胺羟多巴胺（可选择性被儿茶酚胺类神经元摄入，经过自氧化形成若干具有细胞毒性的产物。类神经元摄入，经过自氧化形成若干具有细胞毒性的产物。由于整个神经元的细胞膜均
16、可摄入由于整个神经元的细胞膜均可摄入6-羟多巴胺，故儿茶酚羟多巴胺，故儿茶酚胺类神经元的任何部位都可被胺类神经元的任何部位都可被6-羟多巴胺破坏。不易通过羟多巴胺破坏。不易通过血脑屏障，因此如欲造成中枢性破坏，需做脑室或脑内注血脑屏障，因此如欲造成中枢性破坏，需做脑室或脑内注射）、射）、6-羟多巴、羟多巴、5,6-双羟色胺和双羟色胺和5,7-双羟色胺（选择性双羟色胺（选择性破坏破坏5-羟色胺能神经元）羟色胺能神经元）胆碱类神经毒剂：乙基胆碱氮芥丙啶正离子胆碱类神经毒剂：乙基胆碱氮芥丙啶正离子 兴奋性氨基酸：海人酸和鹅高蕈氨酸（能够非选择性兴奋性氨基酸：海人酸和鹅高蕈氨酸（能够非选择性损伤神经元
17、的胞体，而不损伤轴突，故无过路纤维受损问损伤神经元的胞体，而不损伤轴突，故无过路纤维受损问题）题）.研究方法：研究方法：20世纪从世纪从40年代，镀银染色法，根据银染溃变纤维的形态年代，镀银染色法，根据银染溃变纤维的形态变化来判断、追踪溃变纤维的方法。变化来判断、追踪溃变纤维的方法。20世纪从世纪从50年代，年代，Nauta法，一种改进的溃变镀银法，能抑法，一种改进的溃变镀银法，能抑制正常纤维的染色而制正常纤维的染色而仅染出溃变纤维仅染出溃变纤维。20世纪世纪70年代，变性束路追踪法逐渐被轴浆运输追踪法所年代，变性束路追踪法逐渐被轴浆运输追踪法所代替。代替。可与逆行标记法、顺行标记法、免疫组织
18、化学、原位杂交等技可与逆行标记法、顺行标记法、免疫组织化学、原位杂交等技术结合运用。术结合运用。.（3）神经元质膜荧光染色法）神经元质膜荧光染色法 这类染料是利用它们能溶于细胞膜脂层内并在膜内扩散的这类染料是利用它们能溶于细胞膜脂层内并在膜内扩散的特点。可用在活体或固定的标本上追踪纤维联系。特点。可用在活体或固定的标本上追踪纤维联系。这类染料中这类染料中DiI、DiA和和DiO最常用。最常用。主要优点是可用于固定标本，一些难以在活体注射的小核主要优点是可用于固定标本，一些难以在活体注射的小核团在固定标本上常比较容易做到。团在固定标本上常比较容易做到。缺点是其在膜内扩散的速度很慢，而且有效距离比
19、较短，缺点是其在膜内扩散的速度很慢，而且有效距离比较短，因此最适用于胚胎或小动物。因此最适用于胚胎或小动物。.免疫组织（细胞）化学法免疫组织（细胞）化学法 20世纪世纪70年代，免疫组织化学技术被引入脑研究领域，年代，免疫组织化学技术被引入脑研究领域，它以特异性强、灵敏度高的特点，使神经元内所含的神经它以特异性强、灵敏度高的特点，使神经元内所含的神经活性物质、受体和转运体可视化，给形态学研究开辟了新活性物质、受体和转运体可视化，给形态学研究开辟了新的途径。的途径。.基本原理基本原理 利用免疫学中利用免疫学中抗原与抗体特异性结合抗原与抗体特异性结合的特点的特点以及以及组织化学组织化学的原理，在组
20、织或细胞标本中加入的原理，在组织或细胞标本中加入特定的特定的标记抗体标记抗体，然后对标记物进行显示，从而，然后对标记物进行显示，从而对组织或细胞内的抗原物质进行定性、定位或定对组织或细胞内的抗原物质进行定性、定位或定量研究。量研究。免疫酶技术显示显示Caspase-3免疫荧光技术显示显示MOR.因为抗原与抗体的结合是高度特异的，所以免疫组织化学因为抗原与抗体的结合是高度特异的，所以免疫组织化学方法具有高度的特异性、灵敏性和精确性。方法具有高度的特异性、灵敏性和精确性。免疫组织化学的抗原通常是肽或蛋白，有数量不等的抗原免疫组织化学的抗原通常是肽或蛋白，有数量不等的抗原决定簇。抗原决定簇由暴露于抗
21、原表面、在空间上相邻的决定簇。抗原决定簇由暴露于抗原表面、在空间上相邻的3-8个氨基酸组成。一个抗原上可以有多个抗原决定簇。个氨基酸组成。一个抗原上可以有多个抗原决定簇。故由此而产生的抗血清中可能含有针对不同决定簇的多克故由此而产生的抗血清中可能含有针对不同决定簇的多克隆抗体。用杂交瘤技术可以制成针对单个决定簇的单克隆隆抗体。用杂交瘤技术可以制成针对单个决定簇的单克隆抗体。抗体。抗体仅识别特定的抗原决定簇，而不识别抗原本身，因此抗体仅识别特定的抗原决定簇，而不识别抗原本身，因此不同物质只要有相同的抗原决定簇，均可被同一抗体识别，不同物质只要有相同的抗原决定簇，均可被同一抗体识别，所以在免疫组织
22、化学法中应注意抗体的特异性及交叉反应。所以在免疫组织化学法中应注意抗体的特异性及交叉反应。.抗体（抗体（antibody,Ab）机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的终末机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的终末B 细胞细胞浆浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。是介导体液免疫的重要效应分子。能的球蛋白。是介导体液免疫的重要效应分子。典型的免疫球蛋白分子呈Y字型，由两条相同的重链（heavy chain,H）和两条相同的轻链（light chain,L）借二硫键连接而成。在氨基端，重链的1/4和轻链的1/2氨基
23、酸序列变化很大，为可变区（variable region,V）；其他部分氨基酸序列相对恒定，为恒定区（constant region,C）。.Fab即即抗原结合片段抗原结合片段（fragment antigen binding），由一条完整），由一条完整的轻链和部分重链（的轻链和部分重链（VH和和CH1）组）组成。该片段具有单价抗体活性，成。该片段具有单价抗体活性，能与能与一个相应的抗原决定族特异性结合一个相应的抗原决定族特异性结合。Fc即即可结晶片段可结晶片段（fragment crystalline），），Fc段含有两条重链段含有两条重链C端的一半，包含端的一半，包含CH2和和CH3两个两
24、个功能区，它无抗体活性。功能区，它无抗体活性。Ig在异种在异种间免疫所具有的抗原性主要存在于间免疫所具有的抗原性主要存在于Fc段段，同时，同时Fc段还具有活化补体、段还具有活化补体、亲细胞、通过胎盘和介导与细菌蛋白亲细胞、通过胎盘和介导与细菌蛋白结合等生物学活性。结合等生物学活性。用木瓜蛋白酶水解用木瓜蛋白酶水解IgG分子，可将其分子，可将其裂解为两个完全相同的裂解为两个完全相同的Fab和一个和一个Fc片段。片段。.多克隆抗体多克隆抗体（polyclonal antibody,PcAb）大多数天然抗原物质(如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等)往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可
25、刺激机体产生一种特异性抗体。多克多克隆抗体是多个抗原决定簇刺隆抗体是多个抗原决定簇刺激机体后，由多个免疫淋巴激机体后，由多个免疫淋巴细胞分泌的细胞分泌的多种抗体的混多种抗体的混合物合物。PcAb 特异性差，易出现交叉反应。.由单一克隆由单一克隆B B细胞杂交骨髓瘤细胞产生的，只细胞杂交骨髓瘤细胞产生的，只识别一种抗原表位的具有高度特异性的抗体。识别一种抗原表位的具有高度特异性的抗体。优点：结构均一、纯度高、特异性强、效价高、易大量制备。制备单一表位特异性抗体的理想方法是获得针对单一表位的浆细胞克隆，使其在体外扩增并分泌抗体。但浆细胞在体外的寿命较短，也难以培养。于是，将可产生特异性抗体但短寿的
26、浆细胞与无抗原特异性但长寿的恶性浆细胞瘤细胞融合，建立了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞和单克隆抗体技术。单克隆抗体单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）.组织（细胞）化学是介于细胞学与化学之间的一门科组织（细胞）化学是介于细胞学与化学之间的一门科学。细胞化学的目的是使用细胞学和化学的方法使细胞学。细胞化学的目的是使用细胞学和化学的方法使细胞（组织）内的某些化学成分发生反应，在局部形成有色反（组织）内的某些化学成分发生反应，在局部形成有色反应物，藉此对各种活性物质在显微镜水平进行定性、定位应物，藉此对各种活性物质在显微镜水平进行定性、定位和定量分析。和定量分析。酶组织化学：
27、利用酶对底物的催化作用，使底物发生颜色酶组织化学：利用酶对底物的催化作用，使底物发生颜色变化，其次对该酶进行定位、定量分析。变化，其次对该酶进行定位、定量分析。.在应用组织化学技术显示组织和细胞内化学物质及定位在应用组织化学技术显示组织和细胞内化学物质及定位和定量以及代谢状态时，需要满足以下要求：和定量以及代谢状态时，需要满足以下要求：保持组织和细胞形态结构的良好状态，以便反应产物的定保持组织和细胞形态结构的良好状态，以便反应产物的定位精确。如果形态结构破坏而失真，则定位困难。位精确。如果形态结构破坏而失真，则定位困难。具备一定的特异性，以便获取正确的实验结果。具备一定的特异性，以便获取正确的
28、实验结果。具备一定的灵敏性，以便含量极微的物质也能被显示出来。具备一定的灵敏性，以便含量极微的物质也能被显示出来。生成的反应产物必须是有色沉淀，颗粒微细不溶，定位于生成的反应产物必须是有色沉淀，颗粒微细不溶，定位于原位。反应物沉淀的颜色深度与相应物质含量或酶的活性原位。反应物沉淀的颜色深度与相应物质含量或酶的活性具有一定的量效关系。具有一定的量效关系。反应产物具有稳定性，以便于重复观察反应产物具有稳定性，以便于重复观察要有重复性。要有重复性。选择的试剂必须是分析纯，对被检测物质或酶应无任何影选择的试剂必须是分析纯，对被检测物质或酶应无任何影响；实验所用器皿必须清洁无污染杂质，使用的蒸馏水应响；
29、实验所用器皿必须清洁无污染杂质，使用的蒸馏水应为双蒸水。为双蒸水。为了保证实验的可靠性、科学性，防止假阳性的发生，必为了保证实验的可靠性、科学性，防止假阳性的发生，必须同时作对照实验。须同时作对照实验。.免疫组织化学的技术分类免疫组织化学的技术分类 根据根据AgAb结合方式分成：结合方式分成：直接法直接法 间接法间接法 多层法多层法 根据染色方式分成：根据染色方式分成：贴片染色贴片染色 漂浮染色漂浮染色.按标记物的性质分成：按标记物的性质分成：u免疫荧光技术（免疫荧光法）免疫荧光技术（免疫荧光法）u免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、法、ABC法）法）u免疫金
30、属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）金法）标记物标记物 必要性：组织细胞内必要性：组织细胞内AgAb结合反应一般是不可见的，若结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。所以需要用标记的在镜下检测，则必须具有可视性标记物。所以需要用标记的方法将某种标记物（如酶、荧光素）结合到抗体上，再用组方法将某种标记物（如酶、荧光素）结合到抗体上，再用组织化学方法显示此标记物或在荧光显微镜下观察荧光素发出织化学方法显示此标记物或在荧光显微镜下观察荧光素发出的荧光。的荧光。.常用标记物常用标记物 荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（荧
31、光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate,FITC）荧光显微镜下呈绿色荧光；荧光显微镜下呈绿色荧光；Texas red 荧光显微镜下发红色荧光荧光显微镜下发红色荧光 酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。生物素：生物素：Biotin 铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）.应应 用用 凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原
32、等等均可用免疫组织化经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。最学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来。用免疫组织化学方法对所研究的大分子分子进行定位，来。用免疫组织化学方法对所研究的大分子分子进行定位，进而深入研究其功能。进而深入研究其功能。.免疫组织化学染色的基本过程免疫组织化学染色的基本过程 固定：由于在进行免疫组织化学反应时，蛋白质或肽类在固定：由于在进行免疫组织化学反应时，蛋白质或肽类在体内易分解，并从活体
33、存在的部位流失，而必须尽可能在体内易分解，并从活体存在的部位流失，而必须尽可能在接近活体的状态下，在尽可能短的时间内用固定剂将之交接近活体的状态下，在尽可能短的时间内用固定剂将之交联起来，在原位固定那些物质。常用的固定液包括甲醛、联起来，在原位固定那些物质。常用的固定液包括甲醛、多聚甲醛、戊二醛等。多聚甲醛、戊二醛等。制片：切片（冰冻切片对抗原保存性好，石蜡切片，树制片：切片（冰冻切片对抗原保存性好，石蜡切片，树脂切片，震动切片）、铺片（视网膜）、细胞爬片脂切片，震动切片）、铺片（视网膜）、细胞爬片 反应反应.固定固定方法：推注，滴注方法：推注，滴注滴注步骤：滴注步骤：1 1、开胸、开胸 2
34、2、暴露心脏、暴露心脏 3 3、自心尖剪开左心室、自心尖剪开左心室 4 4、插入灌流针至主动脉弓、插入灌流针至主动脉弓 5 5、固定灌流针、固定灌流针 6 6、快速注入冲洗液（有时可免）、快速注入冲洗液（有时可免）7 7、先快后慢注入固定液、先快后慢注入固定液 8 8、慢注毕，将动物装入含、慢注毕，将动物装入含 有少量固定液的塑料袋有少量固定液的塑料袋 置置4C4C冰箱内静置冰箱内静置2h2h后取材后取材.染色方法染色方法ABC法法PAP法法.荧光标记免疫组织化学荧光标记免疫组织化学酶联免疫组织化学酶联免疫组织化学.1 1、免疫荧光细胞化学染色方法、免疫荧光细胞化学染色方法（1 1）直接法）直
35、接法 荧光素直接标记在特异性第一抗体上，荧荧光素直接标记在特异性第一抗体上，荧光素标记的抗体直接与组织切片上相应的抗原光素标记的抗体直接与组织切片上相应的抗原结合，一次孵育成功，在荧光显微镜下观察结合，一次孵育成功，在荧光显微镜下观察检测抗原。检测抗原。优点：简单，时间短，特异性强。优点：简单，时间短，特异性强。缺点：灵敏度低，所需抗体量大缺点：灵敏度低，所需抗体量大（不经济）。（不经济）。应用：基本不用了应用：基本不用了.（2 2）间接法）间接法 先用第一抗体孵育组织切片，在第一抗体先用第一抗体孵育组织切片，在第一抗体与组织中的抗原结合后，再用荧光素标记的第与组织中的抗原结合后，再用荧光素标
36、记的第二抗体孵育，第二抗体是抗产生第一抗体的动二抗体孵育，第二抗体是抗产生第一抗体的动物（如兔、羊、小鼠等）的物（如兔、羊、小鼠等）的IgGIgG的抗体。通过上的抗体。通过上述步骤用荧光素标记的第二抗体与第一抗体结述步骤用荧光素标记的第二抗体与第一抗体结合的方法来间接显示抗原所在的部位。合的方法来间接显示抗原所在的部位。优点：较直接法灵敏，而且只需优点：较直接法灵敏，而且只需标记一种抗标记一种抗IgG抗体即可鉴定多种抗体即可鉴定多种抗原。抗原。.免疫荧光双标记法免疫荧光双标记法（1）直接法）直接法甲荧光甲荧光标记的标记的抗甲抗原抗体抗甲抗原抗体乙荧光乙荧光标记的标记的抗乙抗原抗体抗乙抗原抗体甲
37、抗原甲抗原乙抗原乙抗原.（2）间接法）间接法甲抗原甲抗原乙抗原乙抗原抗甲抗原抗体抗甲抗原抗体抗乙抗原抗体抗乙抗原抗体乙荧光乙荧光标记的标记的第第二抗体（二抗）二抗体（二抗）甲荧光甲荧光标记的标记的第第二抗体（二抗）二抗体（二抗）.两种第一抗体需来自不同种属的动物。将两种第一抗两种第一抗体需来自不同种属的动物。将两种第一抗体混合后与组织孵育，然后用不同荧光素（如体混合后与组织孵育，然后用不同荧光素（如FITC和和Texas Red）标记的二抗混合孵育，各自与其一抗结合。）标记的二抗混合孵育，各自与其一抗结合。两种荧光素在荧光显微镜下发出不同荧光，可以更换滤色两种荧光素在荧光显微镜下发出不同荧光，
38、可以更换滤色片系统分别进行观察。片系统分别进行观察。.免疫荧光双标记法免疫荧光双标记法的应用：的应用：1.1.将两种抗体分别用不同的荧光素加以标记，用来显示含有不同将两种抗体分别用不同的荧光素加以标记，用来显示含有不同成分的两种细胞在同一区域的定位模式成分的两种细胞在同一区域的定位模式激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜观察观察.免疫荧光双标记法免疫荧光双标记法的应用：的应用：2.2.将两种抗体分别用不同的荧光素加以标记，用来定位同一将两种抗体分别用不同的荧光素加以标记，用来定位同一细胞内存在的两种不同成分细胞内存在的两种不同成分.2 2、免疫酶组织化学染色方法、免疫酶组织化学染色方法 用
39、酶标记抗体和用组织化学方法显示结果，间接的用酶标记抗体和用组织化学方法显示结果，间接的对抗原物质进行定位。对抗原物质进行定位。酶类标记物满足的条件：酶类标记物满足的条件：酶催化底物必须是特异的，并容易被显示（产物易于镜酶催化底物必须是特异的，并容易被显示（产物易于镜下观察）；下观察）；酶反应形成的终产物必须是稳定的沉淀，不能从酶活性酶反应形成的终产物必须是稳定的沉淀，不能从酶活性部位向周围组织弥散；部位向周围组织弥散；容易获取（纯）；容易获取（纯）；中性中性pHpH值时，具有稳定性；值时，具有稳定性；酶标记至抗体上不影响酶和抗体的活性。酶标记至抗体上不影响酶和抗体的活性。.常用酶类标记物常用酶
40、类标记物 辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP），），H2O2和和DAB（diaminobenzidine,二氨基联苯胺）为其常用底物，二氨基联苯胺）为其常用底物，产物为稳定的棕黄色沉淀产物为稳定的棕黄色沉淀.碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AP）：）：BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate，5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-磷酸盐磷酸盐)和和 NBT（Nitro-Blue-Tetrazolium，四氮唑蓝），四氮唑蓝）是是AP的常用底物组合，其中，的常用底物组合，其中
41、，NBT作为氧化剂作为氧化剂,BCIP作作为为AP底物。底物。BCIPBCIP被AP水解成一种蓝色的中间物，后者然后被NBT氧化形成二聚体（不溶性紫蓝色沉淀）。.（1 1）PAPPAP法法 过氧化物酶过氧化物酶抗过氧化物酶（抗过氧化物酶（Peroxidase anti-peroxidase method,PAP）法）法PAP作为特异性显色基团。每个作为特异性显色基团。每个PAP复合物含个抗复合物含个抗HRP的的IgG分子及个分子及个HRP分子。分子。DAB作为供氢体，作为供氢体，HRP在在H2O2存在的情况下，能使存在的情况下，能使DAB发生氧发生氧化，生成不溶性棕褐色反应产物沉淀，定位在抗原
42、所在处。化，生成不溶性棕褐色反应产物沉淀，定位在抗原所在处。首先，特异性第一抗体（多为首先，特异性第一抗体（多为兔、羊或小鼠兔、羊或小鼠IgG）孵育组织）孵育组织切片。切片。其次用抗第一抗体的抗体（如其次用抗第一抗体的抗体（如羊抗兔羊抗兔IgG 或驴抗小鼠或驴抗小鼠IgG）作）作桥接。桥接。然后用然后用PAP复合物与桥抗体结合。复合物与桥抗体结合。最后，用最后，用HRP的底物来显示的底物来显示PAP复合物。复合物。.优点：灵敏度高，所用第一抗体的浓度可低于间接荧光法优点：灵敏度高，所用第一抗体的浓度可低于间接荧光法倍左右，并可长期保存。倍左右，并可长期保存。注意：桥抗体注意：桥抗体IgG分子有
43、两个分子有两个Fab段，一个与第一抗体结段，一个与第一抗体结合，另一个与合，另一个与PAP复合物结合。桥抗体的两个复合物结合。桥抗体的两个Fab段是相段是相同的，因此第一抗体及同的，因此第一抗体及PAP复合物中的抗复合物中的抗HRP抗体必须来抗体必须来自同一种动物。自同一种动物。.（2 2）ABC法法卵白素卵白素-生物素生物素-HRP复合物染色法复合物染色法（Avidinbiotinylated horeseradish peroxidase complex method，ABC法法）Avidin：卵白素卵白素，一种糖蛋白，每个分子上有，一种糖蛋白，每个分子上有4个与生物素亲个与生物素亲和力极
44、高的结合位点，可以结合和力极高的结合位点，可以结合4个生物素。个生物素。Biotin：生物素，为一小分子维生素，易于很多生物分子交：生物素，为一小分子维生素，易于很多生物分子交联。联。ABC是卵白素是卵白素-生物素结合的生物素结合的 HRP复合物的简称，每一个卵复合物的简称，每一个卵白素分子上结合个带白素分子上结合个带HRP 的生物素，留出一个能与其的生物素，留出一个能与其他生物素结合的空位。他生物素结合的空位。ABC复合物复合物HRP卵白素卵白素生物素生物素.ABC法是在第一抗体反应后，用生物素结合的法是在第一抗体反应后，用生物素结合的IgG抗体抗体（biotinylated IgG）桥接。
45、然后用）桥接。然后用ABC孵育，使桥抗上孵育，使桥抗上的生物素与的生物素与ABC中卵白素上的空位结合。最后仍用中卵白素上的空位结合。最后仍用HRP的的底物呈色。底物呈色。B-IgGABCHRP卵白素卵白素生物素生物素 优点：由于生物素与卵白素间的亲和力极强，故优点：由于生物素与卵白素间的亲和力极强，故ABC法法比比PAPPAP法灵敏度更高法灵敏度更高。操作时间短，可长期保存。操作时间短，可长期保存。注意：注意：ABC复合物与桥抗体之间是通过生物素结合的，复合物与桥抗体之间是通过生物素结合的，因此因此ABC复合物没有种属特异性，可适合于任何种类的第复合物没有种属特异性，可适合于任何种类的第一抗体
46、。当然生物素结合的第二抗体必须是针对第一抗体一抗体。当然生物素结合的第二抗体必须是针对第一抗体属性的。属性的。.荧光显微镜荧光显微镜在照明系统的光源中使用高压汞灯提供全波段激发光为延长汞灯寿命，打开后不可立即关闭（至少15min），以免水银蒸发不完全而损坏电极；汞灯关闭后则不可马上打开（至少30min），否则灯内汞蒸汽尚未恢复液态，内阻极小，再次施加电压会引起短路，导致汞灯爆炸。.激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜 用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。分辨率，是普通光学显微镜的3倍。用于观察细胞形态、
47、细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。.http:/ PBS替代一抗替代一抗，反应应呈阴性；检查显示系统本身能否使组织染色。，反应应呈阴性；检查显示系统本身能否使组织染色。替代试验：正常兔血清或替代试验：正常兔血清或 正常羊血清代替兔抗血清或羊抗兔正常羊血清代替兔抗血清或羊抗兔IgG，反应应呈，反应应呈阴性；阴性；吸附实验：先将抗体与过量的与其针对的抗原（通常用吸附实验：先将抗体与过量的与其针对的抗原（通常用10-6M）混合孵育，两）混合孵育，两者形成特异性结合，再用结合后的混合物孵育切片，染色结果应为阴性。若者形成特异性结合，再用结合后的混合物孵育切片，染色结果应为阴性。若
48、染色结果仍为阳性，则为非特异性染色。此法可证明待检组织切片的阳性结染色结果仍为阳性，则为非特异性染色。此法可证明待检组织切片的阳性结果是该抗体与组织内靶抗原特异性反应的结果。果是该抗体与组织内靶抗原特异性反应的结果。.免疫组织化学法中的交叉反应免疫组织化学法中的交叉反应 抗体仅识别特异的抗原决定簇而不识别抗原本身，具有相抗体仅识别特异的抗原决定簇而不识别抗原本身，具有相同抗原决定簇的不同物质可以和同一种抗体结合。解决的同抗原决定簇的不同物质可以和同一种抗体结合。解决的最可靠的方法是将抗体用可能与之有交叉反应的抗原吸收，最可靠的方法是将抗体用可能与之有交叉反应的抗原吸收，去除有交叉反应的抗体后，
49、再用作免疫染色，或用已证明去除有交叉反应的抗体后，再用作免疫染色，或用已证明没有交叉反应的单克隆抗体。没有交叉反应的单克隆抗体。制成针对抗原不同片段的抗体，如各抗体均得出相同的染制成针对抗原不同片段的抗体，如各抗体均得出相同的染色结果，则存在交叉反应的可能性要小得多。色结果，则存在交叉反应的可能性要小得多。但是，无绝对对照实验，其结果也是相对的。但是，无绝对对照实验，其结果也是相对的。.原位杂交组织化学法原位杂交组织化学法 原位杂交组织化学（原位杂交组织化学（In situ hybridization histochemistry，ISHH）是应用已知碱基顺序并带有标记）是应用已知碱基顺序并带
50、有标记物的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，物的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统通过组织化学或免疫然后再应用与标记物相应的检测系统通过组织化学或免疫组织化学在核酸原有的位置进行细胞内定位。组织化学在核酸原有的位置进行细胞内定位。.原位杂交组织化学法创于原位杂交组织化学法创于1969年。在神经形态学研究中，年。在神经形态学研究中，ISHH法主要用于显示细胞内的法主要用于显示细胞内的mRNA。此法目前很成熟，。此法目前很成熟，其灵敏度已达到可以显示细胞内仅几个拷贝的其灵敏度已达到可以显示细胞内仅几个拷贝的mRNA的程的程度。度。ISHH
