1、生物化学生物化学Biochemistry第第三三章章酶酶 第一节 酶的通论 第二节 酶促反应动力学 第三节 酶的作用机理和酶的调节 第四节 维生素与辅酶 第一节 酶的通论 一 酶催化作用的特点 二 酶的化学本质和组成 三 酶的命名和分类 四 酶的专一性 五 酶活力测定 六 核酶 七 酶分子工程一 酶催化作用的特点 (一)、概念 (二)、酶和一般生物催化比较 (一)、酶的概念 酶是酶是活细胞活细胞产生的一类产生的一类具有催化功能具有催化功能的的生生物分子物分子，所以又称为生物催化剂，所以又称为生物催化剂(b(biocatalysts）(二)、酶和一般催化剂一般催化剂的比较 1 1、相同点、相同点
2、 反应前后质与量不变，且用量少反应前后质与量不变，且用量少 只是缩短到达平衡的时间，不改变平衡点只是缩短到达平衡的时间，不改变平衡点 只能催化本来进行的反应。只能催化本来进行的反应。一般催化一般催化剂反应活剂反应活化能化能反应总能量变化反应总能量变化酶促反应活化能酶促反应活化能非催化反应活化能非催化反应活化能初初 态态终终 态态酶促反应活化能的改变酶促反应活化能的改变过渡态过渡态v酶易失活酶易失活 反应条件温和引起生物大分反应条件温和引起生物大分子变性的因素都能使酶失活子变性的因素都能使酶失活v高效性高效性 比一般催化剂高比一般催化剂高10107 7-10-101313倍倍v专一性专一性 酶在
3、催化生化反应时对底物的酶在催化生化反应时对底物的选择性。选择性。v 酶的催化活性可调节控制酶的催化活性可调节控制v 常需要辅助因子常需要辅助因子2 2、与一般催化剂的不同点、与一般催化剂的不同点-酶作为生物酶作为生物 催化剂的特点催化剂的特点调节酶的浓度调节酶的浓度通过激素调节通过激素调节反馈抑制调节酶的反馈抑制调节酶的活性活性抑制剂和激活剂调抑制剂和激活剂调节酶的活性节酶的活性其他调节方式如别其他调节方式如别构调节构调节1 1、酶的化学本质酶的化学本质-蛋白质或核酸蛋白质或核酸 19261926年年,James Summer,James Summer由刀豆中提取出脲酶得到结由刀豆中提取出脲酶
4、得到结晶，证明是蛋白质。晶，证明是蛋白质。此后，此后，J.NorthopJ.Northop等又连续获得胃蛋白酶、胰蛋白等又连续获得胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶结晶，并证明是蛋白质。酶和胰凝乳蛋白酶结晶，并证明是蛋白质。19831983年年Thomas R.Cech Thomas R.Cech 发现某些发现某些RNARNA分子具有催化分子具有催化活性，对有催化活性的活性，对有催化活性的RNARNA，命名为核酶（，命名为核酶（RibozymeRibozyme）二 酶的化学本质和组成 2 2、根据酶的化学组成可将酶分为、根据酶的化学组成可将酶分为单纯蛋白酶类：单纯蛋白酶类：在已发现的酶中在已发现
5、的酶中脲酶、蛋白酶、脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等一般水解酶都属于简淀粉酶、核糖核酸酶等一般水解酶都属于简单蛋白质，单蛋白质，这些酶只由氨基酸组成，此外不这些酶只由氨基酸组成，此外不含其他成分，含其他成分，其活性仅仅决定于它的蛋白质其活性仅仅决定于它的蛋白质结构。结构。结合结合(缀合缀合)蛋白酶类：蛋白酶类：另一些酶另一些酶如转氨酶、脱如转氨酶、脱氢酶等属于结合蛋白质，氢酶等属于结合蛋白质，这些酶其蛋白质部这些酶其蛋白质部分称为分称为酶蛋白，酶蛋白，非蛋白质部分称非蛋白质部分称为辅因子为辅因子（或辅助因子），（或辅助因子），酶蛋白或辅因子单独存在酶蛋白或辅因子单独存在时，均无催化活性，或活
6、性很弱，结合到一时，均无催化活性，或活性很弱，结合到一起形成起形成全酶全酶后，后，才表现出明显的催化能力。才表现出明显的催化能力。全酶全酶（有活性）（有活性）=酶蛋白酶蛋白（无活性）（无活性）+辅因子辅因子（无活性）（无活性）辅因子：辅因子：辅酶、辅基、金属离子辅酶、辅基、金属离子 辅酶：辅酶：与酶蛋白结合较松，可透析除去与酶蛋白结合较松，可透析除去 的小分子有机物的小分子有机物 辅基：辅基：与酶蛋白结合较紧，不能透析除与酶蛋白结合较紧，不能透析除 去的小分子有机物去的小分子有机物 金属离子：金属离子：与酶的结合，有的紧与酶的结合，有的紧（金属酶类）（金属酶类）有的松有的松（金属激活酶类）（金
7、属激活酶类）辅酶、辅基往往是由辅酶、辅基往往是由维生素参与形成的维生素参与形成的 小分子有机物小分子有机物。3 3、根据酶蛋白分子特点可将酶分为、根据酶蛋白分子特点可将酶分为单体酶：单体酶：一般一般由一条肽链组成，相对分由一条肽链组成，相对分子量在子量在1.3-3.51.3-3.5万。万。寡聚酶：寡聚酶：由两个或两个以上亚基组成的酶由两个或两个以上亚基组成的酶,这些亚基可以是相同的这些亚基可以是相同的,也可以是不同也可以是不同的的,相对分子量一般大于相对分子量一般大于3.53.5万。万。多酶复合体：多酶复合体：由几种酶靠非共价键彼此嵌由几种酶靠非共价键彼此嵌和而成和而成,催化连续的一系列相关反
8、应催化连续的一系列相关反应,相相对分子量在几百万以上。对分子量在几百万以上。三 酶的命名和分类 1 1、习惯命名法、习惯命名法 2 2、系统命名法、系统命名法 3 国际系统分类法和酶的编号国际系统分类法和酶的编号(1)(1)、根据其催化底物来命名、根据其催化底物来命名；催化水解蛋白质的酶叫蛋白酶；淀粉酶催化水解蛋白质的酶叫蛋白酶；淀粉酶(2)(2)、根据所催化反应的性质和类型来、根据所催化反应的性质和类型来命名命名；如：氧化酶，转移酶，水解酶如：氧化酶，转移酶，水解酶(3)(3)、结合上述两个原则来命名；、结合上述两个原则来命名；如琥珀酸脱氢酶，乙醇脱氢酶如琥珀酸脱氢酶，乙醇脱氢酶(4)(4)
9、、有时在这些命名基础上加上酶的、有时在这些命名基础上加上酶的来源或性质来源或性质 如胃蛋白酶，胰蛋白酶如胃蛋白酶，胰蛋白酶1 1、习惯命名法、习惯命名法-19611961年前用的都是此法年前用的都是此法 国际系统命名法原则，国际系统命名法原则，是以酶所催化是以酶所催化的整体反应为基础，的整体反应为基础，规定每种酶的名规定每种酶的名称应当明确标明称应当明确标明酶的底物及催化反应酶的底物及催化反应的性质。的性质。如果一个酶如果一个酶催化两个底物起反应，催化两个底物起反应，应应在他们的系统名称中在他们的系统名称中包含两种底物的包含两种底物的名称，名称，并以并以“：”将他们隔开。若底将他们隔开。若底物
10、之一是水，可将水略去不写。物之一是水，可将水略去不写。2 2、国际系统命名法、国际系统命名法-国际酶学委员会国际酶学委员会19721972年提出的年提出的习惯命名法习惯命名法 乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶系统名称：系统名称：乙醇：乙醇：NADNAD+氧化还原酶氧化还原酶催化的反应是催化的反应是 乙醇乙醇 +NAD+NAD+乙醛乙醛 +NADH+NADH 3 国际系统分类法和酶的编号国际系统分类法和酶的编号 每一个酶的分类编号由每一个酶的分类编号由四个数字四个数字组成，数组成，数字间用字间用 隔开。编号之前隔开。编号之前ECEC（Enzyme Enzyme CommisionCommision）第一个数
11、字第一个数字-大类大类（根据反应性质将酶分为根据反应性质将酶分为6 6大类酶，分别用大类酶，分别用1 1、2 2、3 3、4 4、5 5、6 6表示）表示）第二个数字第二个数字-亚类亚类 （再根据（再根据底物中底物中被作用的被作用的基团或键的特点基团或键的特点将每一大类分为若干将每一大类分为若干亚类亚类，每个亚类，每个亚类又按顺序编成又按顺序编成1 1、2 2、3 3、4 4、等数字）等数字）第三个数字第三个数字-亚亚类亚亚类（每个亚类可再分为（每个亚类可再分为亚亚亚亚类类，仍用，仍用1 1、2 2、3 3、4 4、编号编号 ）第四个数字第四个数字-该酶在亚亚类的排号该酶在亚亚类的排号这种系统
12、命名和系统编号是相当严格这种系统命名和系统编号是相当严格的，的，一种酶只可能有一个名称和一个一种酶只可能有一个名称和一个编号，编号，一切新发现的酶，都能按此系一切新发现的酶，都能按此系统得到适当的编号。从编号可以了解统得到适当的编号。从编号可以了解到该到该酶的类型和反应性质酶的类型和反应性质。乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 EC EC（1.1.1.271.1.1.27）第第1大类，氧化还原酶大类，氧化还原酶第第1亚类，氧化基团亚类，氧化基团CHOH第第1亚亚类，亚亚类，H受体为受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号该酶在亚亚类中的流水编号 根据反应性质将酶分为根据反应性质将酶分为6 6大类大类 (1)1
13、)氧化还原酶类氧化还原酶类 (2)(2)转移酶类转移酶类 (3)(3)水解酶类水解酶类 (4)(4)裂合酶类裂合酶类 (5)(5)异构酶类异构酶类 (6)(6)连接酶类连接酶类 氧化氧化-还原酶催化还原酶催化氧化氧化-还原还原反应。反应。主要包括主要包括氧化酶氧化酶(Oxidase)(Oxidase)和和脱氢酶脱氢酶(dehydrogenase)(dehydrogenase)如，乳酸如，乳酸(-羟基丙酸羟基丙酸，Lactate)Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。脱氢反应。CH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOOHONADH(1)氧化氧化-还原酶还原酶 Oxido
14、reductase丙酮酸丙酮酸A.2H+B（O2）+B.2H（H2O2，H2O）A 转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。基团或原子转移到另一个底物的分子上。(2)转移酶转移酶 Transferase谷丙转氨酶谷丙转氨酶vAX+BA+BXCOOHO HCNH2COOHCOOH（CH2）2+CCH3谷氨酸谷氨酸丙酮酸丙酮酸COOH HCCOOH（CH2）2O+CCH3NH2COOH H 酮戊二酮戊二酸酸丙氨酸丙氨酸 水解酶催化底物的加水分解反应。水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。
15、主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶例如，脂肪酶(Lipase)(Lipase)催化的脂的水解反应：催化的脂的水解反应：(3)水解酶水解酶 hydrolaseH2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OHAOH+BHAB+HOH脂肪酶脂肪酶 裂合酶催化从底物分子中裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原移去一个基团或原子形成双键的反应子形成双键的反应及其逆反应。包括最常见及其逆反应。包括最常见的的C-CC-C、C-NC-N、C-OC-O、C-SC-S裂解酶亚类。裂解酶亚类。(4)裂合酶裂合酶 LyaseABA+BOHCH2OPO3 2-醛缩酶醛缩酶CH2OPO3 2-HCO
16、HC CO H HCOHCH2OPO3 2-CO CH2OHCH2OPO3 2-HC-O HCOH+果糖果糖-1，6-二磷酸二磷酸磷酸二羟丙酮磷酸二羟丙酮甘油醛甘油醛-3-磷酸磷酸 异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。分子内基团或原子的重排过程。例如，例如，D-氨基酸消旋酶可使氨基酸消旋酶可使D-氨基酸变成氨基酸变成L-氨氨基酸。基酸。(5)异构酶异构酶 IsomeraseAB常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。连接酶连接酶，又称为合成酶，能够催化有腺苷三磷
17、酸，又称为合成酶，能够催化有腺苷三磷酸（ATPATP）参加的反应，即两种物质合成一种新的物质。）参加的反应，即两种物质合成一种新的物质。A+B+ATP=A A+B+ATP=A B+ADP+Pi B+ADP+Pi (6)连接酶连接酶Ligase or Synthetase v四四 酶的专一性酶的专一性 酶对酶对底物底物（被作用的反应物）和（被作用的反应物）和催化的反催化的反应应有严格的选择性。有严格的选择性。一种酶仅能作用于一种底物或结构上相似的一类一种酶仅能作用于一种底物或结构上相似的一类物质，使其发生一定的化学反应物质，使其发生一定的化学反应。绝对专一绝对专一基团专一基团专一键专一键专一顺反
18、异构顺反异构旋光异构旋光异构专一性专一性相对专一相对专一结构专一结构专一立体或异构专一立体或异构专一绝对专一性绝对专一性：一种酶只作用于：一种酶只作用于一种底物一种底物 O NH2 H2N C H20 +脲酶脲酶 2NH3 CO2 +过氧化氢酶过氧化氢酶 底物是底物是H H2 2O O2 2O NHCl H2N C H20 +脲酶脲酶 相对专一性相对专一性：一种酶能够作用于：一种酶能够作用于结构上类似结构上类似的一系列化合物的一系列化合物 键专一：键专一：只要求合适的化学键，对键只要求合适的化学键，对键两端的基团并无严格要求。两端的基团并无严格要求。O OR C R 如：酯酶如：酯酶 酯键酯键
19、二肽酶二肽酶COOH O NHCH C CH H2N R1 R2 肽键肽键相对专一性相对专一性 基团专一：基团专一：不但要求一定的化学键，不但要求一定的化学键，还要求键一端的基团是一定的。还要求键一端的基团是一定的。如：如：-葡萄糖苷葡萄糖苷酶酶-糖苷糖苷键键糖苷糖苷键的一端是葡萄糖键的一端是葡萄糖底物底物 ：麦芽糖麦芽糖 蔗糖蔗糖v 专一性专一性 酶对酶对底物底物（被作用的反应物）和（被作用的反应物）和催化的反催化的反应应有严格的选择性。有严格的选择性。一种酶仅能作用于一种底物或结构上相似的一类一种酶仅能作用于一种底物或结构上相似的一类物质，使其发生一定的化学反应物质，使其发生一定的化学反应
20、。绝对专一绝对专一基团专一基团专一键专一键专一顺反异构顺反异构旋光异构旋光异构专一性专一性相对专一相对专一结构专一结构专一立体或异构专一立体或异构专一立体异构专一性立体异构专一性：-可以分离不同构型可以分离不同构型 旋光异构旋光异构 H2NCHCOOHRL-氨基氧化酶氨基氧化酶+O2+H2O-酮酸酮酸+NH3+H2OL-型型L-氨基氧化酶氨基氧化酶+O2+H2O HCNH2COOHRD-型型立体异构专一性立体异构专一性：顺反异构专一性顺反异构专一性C CH COOH COOH H 延胡索酸水合酶延胡索酸水合酶+H2O苹果酸苹果酸C CCOOH H COOH H 延胡索酸水合酶延胡索酸水合酶+H
21、2O反丁烯二酸反丁烯二酸顺丁烯二酸顺丁烯二酸CH CHOH COOH COOH H v 专一性专一性 酶对酶对底物底物（被作用的反应物）和（被作用的反应物）和催化的反催化的反应应有严格的选择性。有严格的选择性。绝对专一绝对专一基团专一基团专一键专一键专一顺反异构顺反异构旋光异构旋光异构专一性专一性相对专一相对专一结构专一结构专一立体或异构专一立体或异构专一锁钥假说：锁钥假说：认为整个酶分子的天然构象是具认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样是完全吻合把钥匙对一把锁一样是完全吻
22、合的。的。酶作用专一性的假说酶作用专一性的假说该学说的该学说的局限性局限性不能解释酶的不能解释酶的逆逆反应反应，如果酶的活性中心是，如果酶的活性中心是“锁和锁和钥匙钥匙”学说中的锁，那么，这种结学说中的锁，那么，这种结构不可能即适合于可逆反应的底物，构不可能即适合于可逆反应的底物，又适合于可逆反应的产物。又适合于可逆反应的产物。诱导契合假说：诱导契合假说：该学说认为酶表面并没有一种与底物该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，二者靠近时，酶受互补的固定形状，二者靠近时，酶受底物的诱导，酶蛋白构象发生变化，底物的诱导，酶蛋白构象发生变化，使酶与底物契合而形成中间产物，并使酶与底物契合而形
23、成中间产物，并引起底物的变化。引起底物的变化。酶作用专一性的假说酶作用专一性的假说过渡态互补过渡态互补非常多的实验证据非常多的实验证据,完完善的解释善的解释酶变化，底物也变化酶变化，底物也变化 第一节 酶的通论 一 酶催化作用的特点 二 酶的化学本质和组成 三 酶的命名和分类 四 酶的专一性 五五 酶活力测定酶活力测定 六 核酶 七 酶分子工程(一一)、酶活力的测定酶活力的测定 1 1 酶活力酶活力v(v(酶不易制成纯品，其中含有很多杂质，所酶不易制成纯品，其中含有很多杂质，所以酶制剂中酶的含量都用酶活力来表示。以酶制剂中酶的含量都用酶活力来表示。)是指酶催化某一化学反应的能力，其大是指酶催化
24、某一化学反应的能力，其大小可以用一定条件下所催化的某一化学反小可以用一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示。应的反应速率来表示。测定酶活力就是测定酶活力就是测定酶促反应的速度测定酶促反应的速度（单位（单位时间内单位体积中底物的减少量或时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量产物的增加量表表示，示，单位为单位为mol/minmol/min）。(一一)、酶活力的测定酶活力的测定 2 2 酶的活力单位酶的活力单位 酶活力的大小，即酶含量的多少，用酶活力的大小，即酶含量的多少，用酶的活力单位表示，酶单位；酶的活力单位表示，酶单位；U U-一定一定条件下，条件下，一定时间内将一定量一定时间内将
25、一定量的底物转变为产物所需要的酶量。的底物转变为产物所需要的酶量。2 2 酶的活力单位酶的活力单位 19611961年，国际生物化学协会酶学委员会及国年，国际生物化学协会酶学委员会及国际纯化学和应用化学协会临床化学委员会提际纯化学和应用化学协会临床化学委员会提出采用统一的国际单位来表示酶活力单位。出采用统一的国际单位来表示酶活力单位。-标准化标准化 在最适反应条件下（温度在最适反应条件下（温度2525度）度），每分钟内催化每分钟内催化1 1molmol(小小)底物转化为产底物转化为产物所需的酶量，物所需的酶量，定为一个酶活力单位定为一个酶活力单位（1U=1umol/min1U=1umol/mi
26、n）。1972 1972年，国际生物化学协会酶学委员会年，国际生物化学协会酶学委员会又推荐一种又推荐一种新的酶活力国际单位新的酶活力国际单位，KatalKatal（KatKat）规定：在最适条件下，规定：在最适条件下，1 1秒钟内秒钟内催化催化1 1molmol底物转变为产物所需的酶量，定底物转变为产物所需的酶量，定为为1 Kat 1 Kat 单位（单位（1 Kat=1mol/s 1 Kat=1mol/s）。）。1 Kat=601 Kat=6010106 6 U U，1U=1U=（1/601/60）u Kat=16.7 n Katu Kat=16.7 n Kat3 3 比活力比活力代表酶的纯度
27、代表酶的纯度单位质量样品（一般是单位质量样品（一般是mgmg）所具有的酶）所具有的酶活力单位数。活力单位数。（单位（单位/mg/mg）有时也用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有时也用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位来表示。有多少个活力单位来表示。对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度越高（含杂质越少），越高（含杂质越少），所以比活力是评价酶纯所以比活力是评价酶纯度高低的一个指标。度高低的一个指标。(二二)、测定方法、测定方法测定酶活力就是测定酶活力就是测定产物增加量或底物测定产物增加量或底物减少量减少量,主要根据产物或底物的物理主要根据产物或底物的
28、物理或化学特性决定具体酶促反应的测定或化学特性决定具体酶促反应的测定方法方法.(1)(1)分光光度法分光光度法(2)(2)荧光法荧光法(3)(3)同位素测定方法同位素测定方法(4)(4)电化学方法电化学方法测定时测定时酶促反应限定在一个特定的时酶促反应限定在一个特定的时间段内间段内,这时测定的才是速率这时测定的才是速率,限定时间限定时间符合两个原则：符合两个原则：在零级反应期测定在零级反应期测定，酶的催化反应，酶的催化反应速度不随底物浓度的变化而变化速度不随底物浓度的变化而变化,要求要求底物浓度足够高底物浓度足够高即即-s s或或p p与反应时间与反应时间t t成正比；成正比；反应速度与酶量成
29、线性关系反应速度与酶量成线性关系，底物，底物浓度大浓度大,酶量少酶量少,即即E E=k(-=k(-s s/t)=k/t)=kp p/t/t 第一节 酶的通论 一 酶催化作用的特点 二 酶的化学本质和组成 三 酶的命名和分类 四 酶的专一性 五 酶活力测定 六六 核酶核酶 七 酶分子工程六 核酶核酶ribozymeribozyme 具有催化活性的具有催化活性的RNARNA称为核酶称为核酶19821982年发现年发现四膜虫四膜虫rRNArRNA成熟中成熟中RNARNA的剪接由鸟的剪接由鸟苷介导苷介导四膜虫四膜虫rRNArRNA前体前体(约约64006400个个nt)nt)很不稳定，很不稳定，在鸟苷
30、在鸟苷(或或5 5GMP)GMP)和和Mg2Mg2+存在下切除自身存在下切除自身的的413413个核苷酸的内含子个核苷酸的内含子(intron)(intron)，使两，使两个外显子个外显子(exon)(exon)拼接起来，变成成熟的拼接起来，变成成熟的rRNArRNA分子，自我剪接分子，自我剪接(self-splicing)(self-splicing)，证明了证明了RNARNA具有催化功能具有催化功能L19 RNAL19 RNA四膜虫四膜虫rRNArRNA内含子的内含子的55端切除端切除1919个核个核苷酸即为苷酸即为L19RNAL19RNA，是最早发现的核酶。，是最早发现的核酶。Cech和
31、和Altman共同获得了共同获得了1989年的诺贝尔化学奖年的诺贝尔化学奖 催化多催化多核苷酸核苷酸链的链的延延长长或或缩缩短短酯酯酶酶活活性性嘌呤霉素嘌呤霉素催催化化肽肽键键的的生生成成 核酶的二级结构核酶的二级结构（槌头结构）（槌头结构）RNA功能的多样性功能的多样性1).1).遗传物质遗传物质;2).2).控制蛋白质的合成控制蛋白质的合成;3).3).遗传信息的加工遗传信息的加工;4).4).基因表达和细胞功能的调控基因表达和细胞功能的调控;5).5).催化功能催化功能;6).6).在生命起源中可能有重要作用。在生命起源中可能有重要作用。第一节 酶的通论 一 酶催化作用的特点 二 酶的化
32、学本质和组成 三 酶的命名和分类 四 酶的专一性 五 酶活力测定 六 核酶 七七 酶分子工程酶分子工程八、八、酶分子工程酶分子工程(一一)、固定化酶固定化酶 吸附法；偶联法；交联法；包埋法；固定化细胞；酶电极和传感器(临床上)化学酶化学酶 (二二)化学修饰酶化学修饰酶-复杂但有一些结果复杂但有一些结果 酶功能基的化学修饰酶功能基的化学修饰，如酰化反应修饰天冬酰胺酶（抗白血病）可提高其稳定性。修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，增强其亲水性，可提高其热稳定性；交联反应交联反应，如半乳糖苷酶A经交联修饰后稳定性增强；大分子修饰作用大分子修饰作用，如用葡聚糖修饰淀粉酶，用聚乙二醇修饰天冬酰胺酶，用肝素、葡聚
33、糖或聚乙二醇修饰尿激酶均可提高其热稳定性。对硝基苯酚磷酸胆碱酯对硝基苯酚磷酸胆碱酯为半抗原得到的单克隆抗体有酯酶活性为半抗原得到的单克隆抗体有酯酶活性(三三)抗体酶抗体酶又称为催化性抗体，具有催化功能的抗体又称为催化性抗体，具有催化功能的抗体.-.-它将抗体的结合部位赋予了酶的催化活性。它将抗体的结合部位赋予了酶的催化活性。吡啶甲酸的膦酸酯类似物为半抗原得到的吡啶甲酸的膦酸酯类似物为半抗原得到的单克隆抗体可以水解羧酸酯化合物；以单克隆抗体可以水解羧酸酯化合物；以N-N-甲基原卟啉为半抗原得到的单克隆抗体可甲基原卟啉为半抗原得到的单克隆抗体可以催化平面状卟啉的金属螯合反应。以催化平面状卟啉的金属
34、螯合反应。两个意义两个意义:说明过度态互补理论是正确的说明过度态互补理论是正确的;有好的临床应用前景有好的临床应用前景 (四四)酶的蛋白质工程酶的蛋白质工程 第一节 酶的通论 第二节 酶促反应动力学 第三节 酶的作用机理和酶的调节 第四节 维生素与辅酶第二节 酶促反应动力学 一一 化学动力学基础化学动力学基础 二二 底物浓度对酶反应速率的影响底物浓度对酶反应速率的影响 三三 pHpH对酶反应的影响对酶反应的影响 四四 温度对酶反应的影响温度对酶反应的影响 五五 激活剂对酶反应的影响激活剂对酶反应的影响 六六 酶的抑制作用酶的抑制作用 一一 化学动力学基础化学动力学基础 1 1 反应速率及其测定
35、反应速率及其测定 2 2 反应反应分子数分子数及及分子分子级数级数3 3 各级反应的特征各级反应的特征 一级反应一级反应:反应速率与反应物浓反应速率与反应物浓度的一次方成正比度的一次方成正比.-dc/dt=kclnc=-kt+B（直线）（直线）lnc=-kt+lnc0 K=(1/t)ln(c0/c)c=(1/2)c0时时k=(ln2)/t1/2t1/2=(ln2)/k半衰期与反应物的初浓度无关半衰期与反应物的初浓度无关二级反应二级反应:反应速率与反应物浓反应速率与反应物浓度的二次方度的二次方(或两种物质浓度乘积或两种物质浓度乘积)成正比成正比.半衰期与反应物的初浓度成反比半衰期与反应物的初浓度
36、成反比c/c0=1/2时，时，t1/2=1/(c0k)。-dc/dt=kc1/C-1/c0=ktc=(1/2)c0时时1/c0=k t1/22零级反应零级反应:反应速率与反应物浓反应速率与反应物浓度无关度无关 t1/2=C0/2k反应速率是个常数反应速率是个常数一般是一般是反应物浓度足够高反应物浓度足够高,增加反应物增加反应物的浓度的浓度,反应速率不会改变反应速率不会改变半衰期与反应物的初浓度成正比半衰期与反应物的初浓度成正比二、底物浓度对酶反应速率的影响二、底物浓度对酶反应速率的影响 SS与与v v关系：关系：当当SS很低时，很低时，SS 与与v v 成比例成比例-一级反应一级反应当当SS较
37、高时，较高时，SS 与与v v 不成比例不成比例比较复杂比较复杂当当SS很高时，很高时，SS，v v不变不变-零级反应零级反应 vVm0.30.2Vm 20.10 1 2 3 4 5 6 7 8 S (一一)：中间络合学说中间络合学说 E +S E +S E-SE-S P +E P +E S+E ES E+PS:substrateP:productE:enzyme (一一)：中间络合学说中间络合学说 E +S E +S E-SE-S P +E P +E 前提：前提：1 1）S S和和E E形成中间产物，且整个反应形成中间产物，且整个反应 速度取决于速度取决于 E-SE-S P +E P +E
38、2 2）产物浓度接近为）产物浓度接近为0 0（初速度）（初速度）3 3）SSEE 4 4）反应达到平衡）反应达到平衡(二二)酶促反应的动力学方程式酶促反应的动力学方程式 1 1 米氏方程米氏方程 推导：推导：E+SESP+EK1K-1KcatES VES V生成生成 =K1(Et-ESEt-ES)S)SES VES V分解分解 =K2 ESES+K3ESESEt-ES S Et-ES S ESES(若酶的浓度比底物的浓度低的多若酶的浓度比底物的浓度低的多,未经结合的底物的浓度与底物的总浓度未经结合的底物的浓度与底物的总浓度基本相等基本相等)K4 小达到平衡时达到平衡时:V V生成生成=V=V分
39、解分解K1(Et-ESEt-ES)S=)S=K-1 ESES+KcatESESK1(Et-ESEt-ES)S=)S=(K-1+Kcat)ESESK1(K-1 +Kcat)ESES(Et-ESEt-ES)S)S=K1(K-1 +Kcat)KmKm=K1(K-1 +Kcat)ESES(Et-ESEt-ES)S)S=KmESES(Et-ESEt-ES)S)S=ES ES=Et Et SSKm+SKm+SV=Kcat ESESE+SESP+EK1K-1KcatES ES=Et Et SSKm+SKm+SV=KcatEt Et SSKm+SKm+S当所有的当所有的 酶都以酶都以ES形形式存在时式存在时,
40、Et=ESVmax=Kcat EtV=Vmax SSKm+SKm+S 该方程式表明：当已知该方程式表明：当已知KmKm及及VmaxVmax时，酶时，酶反应速率与底物浓度之间的定量关系。反应速率与底物浓度之间的定量关系。若以若以SS作横坐标，作横坐标，v v作纵坐标作图，可作纵坐标作图，可得到一条双曲线得到一条双曲线 vVmax VmaxKmSV=Vmax SSKm+SKm+S米氏方程米氏方程 反映：反映：V=V m ax S K m +S当当SS很低时，很低时，KmKmSS，V=V=(Vmax/Km)(Vmax/Km)*SS,反反应速度只与底物浓度有关应速度只与底物浓度有关一级反应一级反应当当
41、SS很高时，很高时，SS Km,Km,V=V=VmaxVmax，v v不受底物不受底物浓度变化的影响浓度变化的影响-零级反应零级反应 当当SS较高时，较高时，SS 与与v v 不成比例不成比例比较复杂比较复杂米氏常数米氏常数-Km 意义意义V=V m ax S K m +S当当 V=Vmax 代入上式代入上式Km=SKmKm的物理意义：的物理意义：当反应速度为最当反应速度为最大速度的一半时底物浓度。大速度的一半时底物浓度。单位是单位是mol/L mol/L 或或 mmol/L mmol/L 2 2 动力学参数的意义动力学参数的意义KmKm为为E E的特征常数，的特征常数，酶对一定的底物只有酶对
42、一定的底物只有一个特定的一个特定的Km,Km,在一定范围内为固定值在一定范围内为固定值KmKm与与酶的浓度无关。酶的浓度无关。KmKm可可近似表示酶与底物的亲和力。近似表示酶与底物的亲和力。KmKm越越大，大，ESES越容易解离，亲和力越小。越容易解离，亲和力越小。（若（若一种酶可催化几种底物，这个酶对每一个底物都一种酶可催化几种底物，这个酶对每一个底物都有一个特定的有一个特定的KmKm值，其中值，其中KmKm值最小的为该酶的最值最小的为该酶的最适底物或天然底物）适底物或天然底物）KmKm愈小，达到最大反应速率愈小，达到最大反应速率一半所需要的底物浓度就愈小一半所需要的底物浓度就愈小 ，底物最
43、适。，底物最适。V=V m ax S K m +SK1(K-1+Kcat)KmKm=E+SESP+EK1K-1Kcat假定假定KcatKcat绝对小于绝对小于K K-1-1酶酶底物底物Km(mmol/L)Km(mmol/L)脲酶脲酶尿素尿素2525溶菌酶溶菌酶6-N-6-N-乙酰葡萄糖乙酰葡萄糖胺胺0.0060.006葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸磷酸脱氢酶脱氢酶6-6-磷酸磷酸-葡萄糖葡萄糖0.0580.058胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶苯甲酰酪氨酰胺苯甲酰酪氨酰胺2.52.5甲酰酪氨酰胺甲酰酪氨酰胺12.012.0乙酰酪氨酰胺乙酰酪氨酰胺32.032.0计算计算判断反应速率判断反应速率v v和和V
44、maxVmax之间的关系之间的关系 已知已知S=nKmS=nKm，则，则v v=n/(1+n)Vmax=n/(1+n)Vmax；判断底物浓度与判断底物浓度与KmKm之间的关系之间的关系-已知已知v v=nVmax=nVmax，则，则S=n/(1-n)KmS=n/(1-n)Km；(希望希望0.9,)0.9,)这样反应浓度这样反应浓度9 Km,9 Km,再增再增加其反应速度增加不明显加其反应速度增加不明显;0.99-99 Km 0.99-99 KmV=V m ax S K m +S KmKm可用于判断反应的方向可用于判断反应的方向(底物浓度高底物浓度高,Km,Km 低低-正向正向)及代谢途径的限速
45、步骤及代谢途径的限速步骤(Km比较高且比较高且底物浓度又比较低底物浓度又比较低),),生物体代谢在那种情况下生物体代谢在那种情况下走那种途径（走那种途径（一个底物可被三种酶催化，在底物浓度一个底物可被三种酶催化，在底物浓度低时是那一种途径低时是那一种途径）V=V m ax S K m +SK K3 3(K(Kcatcat)的意义的意义在一定的酶浓度下，在一定的酶浓度下，VmaxVmax为常数。为常数。底物浓度很大时，底物浓度很大时，VmaxVmax与酶浓度成与酶浓度成正比；正比；Vmax=Kcat EtE+SESP+EK1K-1KcatVmaxVmax和和K K3 3(K(Kcatcat)的意
46、义的意义 当底物浓度很高时，当底物浓度很高时，Vmax=kcatES=kcatE，kcat表示当酶被底物饱和时，表示当酶被底物饱和时，每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，这个常数又叫做这个常数又叫做转换数转换数(简称简称TN)，又称，又称为为催化常数催化常数(catalytic constant，kcat)。kcat值越大，表示酶的催化效率越高。值越大，表示酶的催化效率越高。E+SESP+EK1K-1KcatK Kcat cat/K Km m的意义的意义:Kcat/Km=kcat k Kcat/Km=kcat k1 1/(k/(k-1-1+kcat)+kcat)
47、。当当k k-1-1kcat kcat 时，时，Kcat/Km=k1Kcat/Km=k1。上限。上限 即即Kcat/KmKcat/Km表示表示k k-1-100时的时的k1k1，即，即k1k1的最大值的最大值,达到极限。达到极限。催化效率的参数催化效率的参数K1(K-1 +Kcat)KmKm=E+SESP+EK1K-1Kcat 、利用作图法测定、利用作图法测定KmKm和和maxmax值值 vVm0.30.2Vm 20.10 1 2 3 4 5 6 7 8 S不够准确不够准确即使使即使使用很高的底物浓度，用很高的底物浓度，也只能接近也只能接近Vmax的的反映速度反映速度米氏常数米氏常数-Km (
48、1)(1)、(Lineweaver-Burk)(Lineweaver-Burk)双倒数作图双倒数作图法法 最常用的方法最常用的方法,Km,Km值的求法值的求法V=Vmax SSKm+SKm+S Vmax SSKm+SKm+S=V1=Vmax SSKmKm+Vmax11y=ax+bax+by=ax+bax+b1/V-1/Km 0 1/S斜率斜率=Km/Vmax1/Vmax Vmax SSKm+SKm+S=V1=Vmax SSKmKm+Vmax11(三三)、多底物的酶促反应动力学、多底物的酶促反应动力学 草酰乙酸草酰乙酸酮戊二酸酮戊二酸S1S2P1P2序列反应序列反应乒乓式乒乓式(ping-pon
49、g)(ping-pong)双底物反应的动力学方程（乒乓式）：双底物反应的动力学方程（乒乓式）：（序列机制）（序列机制）第二节 酶促反应动力学 一一 化学动力学基础化学动力学基础 二二 底物浓度对酶反应速率的影响底物浓度对酶反应速率的影响 三三 pHpH对酶反应的影响对酶反应的影响 四四 温度对酶反应的影响温度对酶反应的影响 五五 激活剂对酶反应的影响激活剂对酶反应的影响 六六 酶的抑制作用酶的抑制作用 三、三、pHpH对反应速度的影响对反应速度的影响 在一定的在一定的pH pH 下下,酶具有酶具有最大的最大的催化催化活性活性,通常通常称此称此pH pH 为为最适最适 pHpH。A一般酶最适一般
50、酶最适pH pH 4-84-8（植物（植物5-6.5;5-6.5;动物动物6.5-6.5-8 8）最适最适pHpH与等电点不一定一致与等电点不一定一致酶有最适酶有最适pHpH的原因：的原因：pHpH影响酶的稳定性影响酶的稳定性,活性活性 pHpH影响酶分子上某些基团的解离状态影响酶分子上某些基团的解离状态 pHpH影响底物分子某些基团的解离状态影响底物分子某些基团的解离状态最适最适pHpH不是酶的特征常数，不是酶的特征常数，受缓冲受缓冲液种类、浓度的影响。液种类、浓度的影响。四、四、温度对反应速度的影响温度对反应速度的影响A在一定的条件下在一定的条件下,酶酶活性达到活性达到最大是最大是的温度，
