1、2015-10-30Page 2前言n 一般（基础）毒性（general/basic toxicity）n相对特殊毒性而言n是全身各系统对外源化学物的毒作用反应n 特殊毒性n致癌、致突变、生殖发育毒性、神经毒性.一般毒性作与特殊毒性之间相对应的关系？Page 3外源化学物毒性作用该研究哪些方面？.第六章 一般毒性作用第七章 外源化学物致突变作用第八章 外源化学物致癌作用第九章 发育毒性与致畸作用.Page 4Page 5 毒理学研究内容 安全限值 法规制定 剂量与毒性的关系？代谢/毒性评价作用靶点（机制）组学技术.研究方法 诊断&治疗 毒性监测&预防毒性靶器官？特定系统/靶器官毒理学？“三致”
2、作用？111267、8、915、16、17、18、19、20、21、22、23410吸收分布代谢排泄？3影响评价结果5上述评价体系不完全适用的物质：纳米材料、辐射13、146Page 6一般毒性研究的目的n 受试物毒作用的表现和性质n 剂量反应（效应）研究n 确定毒作用的靶器官n 确定损伤的可逆性Page 7No-Observed Adverse Effect Level(NOAEL)Lowest Observed Adverse Effect Level(LOAEL)基本概念Page 8NOAEL与LOAELPage 9例如OECD关于食品添加剂的要求ADI（Acceptable daily
3、 intake）：确定“未观察到反作用剂量”（NOAEL），也就是用最敏感的动物做实验，从而确定与人体健康相关的最敏感的不良作用。因此，NOAEL 值是指某一种添加剂在研究中未观察到不良反应的最大摄入量，以毫克添加剂每千克体重每天（mg/kg 体重/天）表示。NOAEL 值除以 一个系数，通常是 100，就得到一个相当低的 人体允许 摄取和很大的安全富余。NOAEL与LOAELPage 10 实验动物1 啮齿类（rodent species）小鼠：昆明种、C57、Balb/c、ICR 大鼠：Sprague-Dawley（SD）、Wistar2 非啮齿类（nonrodent species）：兔
4、、犬、猴3 实验动物的遗传均一性：近交系杂交群封闭群Page 11基本原则-实验动物-级别等级饲养环境要求I级普通动物开放系统应没有传染给人的疾病II级清洁级屏障系统种系清楚，没有该动物特有的疾病III级无特定病原体动物屏障或隔离系统没有致病病原体IV级无菌动物隔离系统在全封闭无菌条件下饲养的纯系动物，动物体外不带有任何微生物与寄生虫无特定病原体（Specific pathogen Free,SPF）Page 12基本原则-实验动物-级别Page 13 基本原则-动物选择-3R原则v 减少（Reduction）v 替代（Replacement）v 优化（Refinement）Page 14 基
5、本原则-染毒染毒途径：消化道、呼吸道、皮肤、注射 工业毒物：经呼吸道、皮肤 农用化学物：经口、皮肤、呼吸道 药品：经口、注射、皮肤 食品：经口 环境污染物：经口、呼吸道、皮肤与人群实际接触相似的途径！Page 15v经口染毒n途径：灌胃法、喂饲法、胶囊法n大小鼠建议灌胃，犬胶囊法或灌胃法n喂饲法：保证受试物均匀混合，且稳定，对掺入最大量有规定v经呼吸道v注射 基本原则-染毒方式毒代动力学血药浓度监测！Page 16第一节第一节急性毒性作用急性毒性作用Page 17急性毒性的概念n急性毒性（acute toxicity）n机体一次或24h内多次接触外源化学物后在短期内（最长14天）所产生的毒性效
6、应，包括一般行为和外观改变、大体形态变化以及死亡效应Page 18经典急性毒性试验的目的n 急性毒性试验的目的n求出半数致死剂量(LD50)及其他急性毒性参数n观察中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物的毒效应特征 n为其他毒理试验提供接触剂量和选择观察指标的依据Page 19vLD50的几种计算方法（经典的急性毒性试验）概率单位法 霍恩法（Horn）改进寇氏法急性毒性研究方法局限性 1.消耗的动物量大 2.获得的信息有限 3.测得的LD50仅仅是一个近似值 4.在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。Pag
7、e 20vOECD推荐的替代方法替代方法 固定剂量法 急性毒性分级法 上-下移动法 不以死亡为观察终点；不以死亡为观察终点；利用预先选定的或固定的一系列剂量染利用预先选定的或固定的一系列剂量染毒，从而观察化学物的毒性反应来对化学毒，从而观察化学物的毒性反应来对化学物毒性进行分级。物毒性进行分级。以死亡为观察终点；分阶段实验。以死亡为观察终点；分阶段实验。每阶段每阶段3只动物，根据死亡动物数，只动物，根据死亡动物数，判定毒性。判定毒性。多种观察终点；初步资料多种观察终点；初步资料第一只动物剂第一只动物剂量量毒性反应毒性反应第二只动物剂量第二只动物剂量Page 21LD50 Page 22第三节第
8、三节短期、亚慢性和慢性短期、亚慢性和慢性毒性作用毒性作用Page 23概述实际接触环境多是长期、重复、低水平长期重复剂量染毒和一次剂量染毒的毒作用可能完全不同(例如DMN,dimethylnitrosamine)根据重复接触时间的长短，分为重复剂量毒性作用（短期），亚慢性毒性作用，慢性毒作用Page 24蓄积作用v 蓄积作用(accumulation)具有蓄积作用是发生慢性毒性作用的前提具有蓄积作用是发生慢性毒性作用的前提外源化学物连续反复地进入机体，且吸收速度外源化学物连续反复地进入机体，且吸收速度或总量超过代谢转化排出的速度或总量，化学或总量超过代谢转化排出的速度或总量，化学物质可能在体内
9、逐渐增加并贮留，这种现象称物质可能在体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学物质的蓄积作用为化学物质的蓄积作用Page 25v 蓄积作用的种类物质蓄积物质蓄积(material accumulation):反复多次接反复多次接触化学毒物后，可以用分析方法测出体内物质的触化学毒物后，可以用分析方法测出体内物质的原型或其代谢产物原型或其代谢产物功能蓄积功能蓄积(functional/damage accumulation):长期接触某些化学毒物后，机体内虽不能测出其长期接触某些化学毒物后，机体内虽不能测出其原型或代谢产物，却出现了慢性毒性作用，也称原型或代谢产物，却出现了慢性毒性作用，也称损伤蓄积、机
10、制蓄积损伤蓄积、机制蓄积蓄积作用Page 26生物学标志（Biomarker）暴露标志效应标志易感标志DNA加合物DNA加合物I/II相代谢酶代谢产物微核/染色体畸变DNA修复酶基因突变Page 27基本概念短期重复剂量毒性作用：试验动物或人连续接触外源化学物14-30天所产生的中毒效应亚慢性毒性(subchronic toxicity):连续较长时间(相当于生命周期的1/10)接触外源性化学物所引起的毒性效应慢性毒性(chronic toxicity):实验动物长期染毒外源化学物所产生的毒性效应，长期没有统一、严格的时间界限，可以终生暴露时间Page 28基本概念v短期重复剂量毒性作用基本成
11、为一种初步估计长期接触可能引起的毒效应的经济实用的短期重复染毒试验列入我国食品、消毒剂、农药和新化学品的评价规范初步确定NOAEL和LOAELPage 29v亚慢性毒性试验亚慢性毒性试验结果判断慢性毒性效应基本得到认可现在亚慢性毒性试验为比较常用的长期重复染毒毒性试验，基本可以替代慢性毒性试验可基本确定外源化学物的NOAEL基本概念Page 30v慢性毒性试验实验动物或人长期（甚至终生）反复接触外源化学物所产生的毒性效应，一般2年，对大鼠相当于终生染毒耗费大量人力、物力和时间，一般只有必要时才做现在慢性多为2年，除非致癌试验，没有必要进行更长时间的染毒基本概念Page 31观察慢性毒性效应谱、
12、毒作用特点和毒作用靶器官，了解毒性机制观察慢性毒性作用的可逆性研究重复接触受试物毒性作用的剂量-反应(效应)关系，从而确定LOAEL,NOAEL,为毒性机制研究和将毒性结果外推到人提供依据研究目的Page 32一、实验设计 实验动物的选择实验动物的选择 染毒方式和染毒期限染毒方式和染毒期限 剂量选择和分组剂量选择和分组 观察指标观察指标二、长期毒性试验的注意事项基本原则Page 33基本原则-动物选择-种属 啮齿类通常选大鼠，非啮齿类首选犬，有条件选猴（P141）？全世界超过万人-沙利度胺药害事件Page 34 首先考虑代谢与毒性效应上与人一致ADMET的重要性Absorption,Distr
13、ibution,Metabolism,Excretion,Toxicity应在毒性试验进行前采用体内或体外代谢和生物转化试验，再基于研究数据和资料进行动物选择。基本原则-动物选择-种属Page 35个体选择：个体选择：性别-雌雄各半，或者单性别（生殖毒性相关）年龄和体重-离乳不久，相似体重 数量-满足统计学分析基本原则-动物选择-其他因素Page 36基本原则-受试物及处理n 受试物种类n水溶液、混悬液、油溶液n水溶性受试物，蒸馏水、去离子水、生理盐水，保持与体内渗透压一致 n水不溶性受试物，溶于或悬浮于适当的有机溶剂中n受试物一般应临用前新配n 纯度Page 37n 适宜容积染毒n毒性较大的
14、受试物给药量较小n毒性较低的受试物常需较大量的染毒n给药容积根据染毒途径和实验动物n经口：20ml/kg(空腹动物)n经皮：2ml/kgn静脉：1ml/kg(5min以上)基本原则-受试物及处理Page 38 基本原则-剂量选择与分组 非常重要，最困难，要得到准确的剂量反应关非常重要，最困难，要得到准确的剂量反应关系，充分观察毒作用系，充分观察毒作用 至少至少3个剂量组和个剂量组和1个阴性对照组个阴性对照组 高剂量组应能引起明显的毒性或少量动物的死高剂量组应能引起明显的毒性或少量动物的死亡（少于亡（少于10%）中剂量组约相当于观察到有害作用的最低剂量中剂量组约相当于观察到有害作用的最低剂量（L
15、OAEL）低剂量组应无中毒反应，相当于未观察到有害低剂量组应无中毒反应，相当于未观察到有害作用剂量（作用剂量（NOAEL）Page 39剂量选择n 剂量选择原则n参考新化学物的理化性质n参考相关资料n先用少量动物，以较大的剂量间隔染毒，找出10%-90%（或0%-100%）的致死剂量范围，然后设计正式实验的剂量和分组n根据类似试验所选的LD50计算方法确定剂量组数Page 40慢性试验剂量设计参考值LOAELLOAELLDLD5050MTDMTD1/5-1/21/101/21/50-1/101/1001/41/1001/10001/8高剂量中剂量低剂量参参考考剂剂量量MTD:maximal t
16、olerance dose58Page 41研究方法v 观察指标（慢性）以亚慢性毒性实验所提供的毒效应和靶器以亚慢性毒性实验所提供的毒效应和靶器官为基础，优先其筛选出来的敏感或特异官为基础，优先其筛选出来的敏感或特异性指标性指标 组织病理学检查非常重要，必不可少组织病理学检查非常重要，必不可少 迟发、可逆性，停止染毒后迟发、可逆性，停止染毒后1-2月月Page 42v 观察指标 检查项目检查项目n一般观察n实验室指标n系统尸解n组织病理学n可逆性观察n其他特殊检查研究方法Page 43v 观察指标 一般观察一般观察n常常能综合反映毒物对机体的毒作用，应详细记录，往往是敏感的综合毒效应指标，仔细
17、分析，从中发现化学毒物的毒性特征n每日观察进食量、体重，外观体征和行为活动粪便性状等n有中毒反应的动物取出笼单独饲养，观察n死亡或濒死及时尸检研究方法Page 44v 观察指标 一般观察：动物体重一般观察：动物体重 n重要的且敏感、客观的指标，反映生长发育及一般状态的影响n受试组动物体重增长比对照组低10%，提示是由受试物引起的毒效应n各组存在剂量-反应关系，则可以肯定是一种毒性效应n直接体重、增长重量、体重百分增长率研究方法Page 45v 观察指标 一般观察：饲料消耗量一般观察：饲料消耗量 n每周观察记录饲料消耗量n食物利用率：每食入100g饲料所增长的体重克数（g体重/100g饲料）n结
18、合分析体重指标和食物利用率分析 研究方法Page 46v 观察指标（实验室检查）血液学检查血液学检查 n红细胞计数、血红蛋白含量、白细胞计数及分类、血小板计数、凝血时间等 血液生化指标血液生化指标 n天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、总蛋白(TP)、清蛋白(ALB)、血糖(GLU)、总胆红素(T-BIL)、肌酐(Crea)、总胆固醇(T-CHO)等研究方法Page 47v 观察指标 实验室检查：尿液检查实验室检查：尿液检查 n外观、pH值、蛋白、糖、潜血和沉淀物镜检等，可提供与毒物有关的靶器官毒性和中间代谢产物的信息 研究方法P
19、age 48v 观察指标 系统尸解系统尸解n脏器重量和脏器系数n某个脏器的湿重与单位体重的比值，通常是每100g体重中某脏器所占的质量，表示为脏器质量（g）/体重（100g），适用于实质性脏器研究方法增大：增生、水肿、充血;减小：脏器发育不良或萎缩等Page 49研究方法研究方法v 观察指标 组织病理学检查组织病理学检查n病理学检查：重要，确定靶部位、损害的性质和程度、剂量效应关系、毒效应及机制n大体检查、常规组织病理学检查、酶组织化学检查、免疫组织化学检查、细胞超微结构检查等，分别从大体、组织、细胞、亚细胞，甚至分子水平等多个方面发现化学毒物的毒效应 取材包埋解剖切片染色評価診断操作流程Pa
20、ge 50l 可逆性观察n最后一次给药后24h，每组杀部分动物（如2/3），检测各项指标，余下动物停止染毒，继续观察 24wn重点观察毒性反应器官，观察可逆程度和迟缓毒性研究方法l 特异性指标及其它特异性指标及其它n可根据受试物毒性资料、试验中的观察和受试物的结构等线索增加一些检查项目n心血管系统、神经系统、电解质、眼科、骨髓等n特异性指标：能反映毒物对机体毒作用本质的特征性指标，常与其毒作用机制有关，即效应生物学标志Page 51l 大鼠多次给药毒性研究方案（GLP管理下的）案例介绍l 全新化合物的毒性评价设计全新化合物的毒性评价设计Page 52局部刺激试验局部刺激试验v 局部刺激试验(l
21、ocal irritation test)包括眼刺激、皮肤刺激试验、皮肤致敏试验包括眼刺激、皮肤刺激试验、皮肤致敏试验目的是了解外源化学物对皮肤、眼睛的局部刺激性和目的是了解外源化学物对皮肤、眼睛的局部刺激性和腐蚀性，皮肤变态反应及程度，以采取对眼睛和皮肤腐蚀性，皮肤变态反应及程度，以采取对眼睛和皮肤保护措施保护措施我国农药、化学品和消毒剂毒理学试验程序均规定局我国农药、化学品和消毒剂毒理学试验程序均规定局部刺激试验为必做项目部刺激试验为必做项目Page 53眼刺激试验眼刺激试验 眼刺激眼刺激(eye irritation):眼睛前表面接触受试物后产眼睛前表面接触受试物后产生的眼睛生的眼睛可逆
22、性可逆性炎症变化炎症变化 眼腐蚀眼腐蚀(eye corrosion)：眼睛前表面接触受试物后：眼睛前表面接触受试物后产生的眼睛产生的眼睛不可逆性不可逆性组织损伤组织损伤 Draize试验：家兔四只，滴眼后观察结膜、角膜和试验：家兔四只，滴眼后观察结膜、角膜和虹膜虹膜 注意：注意：7天，家兔可能刺激反应大于人天，家兔可能刺激反应大于人Page 54皮肤刺激试验皮肤刺激试验v 皮肤原发性刺激试验 (skin primary irritation test)单次，多次皮肤刺激试验单次，多次皮肤刺激试验 完整皮肤刺激试验完整皮肤刺激试验 破损皮肤刺激试验破损皮肤刺激试验Page 55皮肤刺激试验皮肤刺
23、激试验v 皮肤刺激试验 皮肤刺激皮肤刺激(dermal irritation):皮肤接触受试物后皮肤接触受试物后产生的局部可逆性炎症变化产生的局部可逆性炎症变化 皮肤腐蚀皮肤腐蚀(dermal corrosion):皮肤接触受试物后皮肤接触受试物后产生的局部不可逆性组织损伤产生的局部不可逆性组织损伤 不宜做：太强，太弱不宜做：太强，太弱Page 56皮肤刺激试验皮肤刺激试验v 皮肤刺激评价方法（Draize试验）家兔及豚鼠家兔及豚鼠 不同时间观察涂抹部位皮肤反应不同时间观察涂抹部位皮肤反应 红斑、紫红斑、焦痂红斑、紫红斑、焦痂 按照红斑和水肿的严重程度评分按照红斑和水肿的严重程度评分 一般不超
24、过一般不超过14天天Page 57皮肤刺激试验皮肤刺激试验v 皮肤刺激反应的影响因素 皮肤完整性，破损可增强吸收皮肤完整性，破损可增强吸收 固态受试物的物理特性固态受试物的物理特性 封闭染毒的严密程度封闭染毒的严密程度 实验动物的年龄和性别，受试部位实验动物的年龄和性别，受试部位 主观判断主观判断 动物物种，兔动物物种，兔豚鼠豚鼠人人猪猪Page 58局部刺激试验局部刺激试验1v 动物替代试验 2009年欧盟禁止动物实验来评价化妆品和成品年欧盟禁止动物实验来评价化妆品和成品 欧洲替代方法验证中心欧洲替代方法验证中心(ECVAM)替代方法验证部门协调委员会替代方法验证部门协调委员会(ICCVAM
25、)鸡胚胎绒毛膜尿囊膜试验鸡胚胎绒毛膜尿囊膜试验 绒毛膜尿囊膜胎盘蓝染绒毛膜尿囊膜胎盘蓝染色试验色试验 荧光素漏出试验荧光素漏出试验 人工表皮模型人工表皮模型(CorroSkin,RHE,EpiDermr(EPI)Page 59皮肤致敏试验皮肤致敏试验v 皮肤致敏试验（skin sensitization test）免疫记忆，迟发性超敏反应免疫记忆，迟发性超敏反应Page 60皮肤致敏试验皮肤致敏试验v 皮肤致敏试验（skin sensitization test）1 福氏完全佐剂（福氏完全佐剂（FCA）：提高动物对致敏性物质）：提高动物对致敏性物质的敏感性；的敏感性；2 不加佐剂；不加佐剂；v 实验过程：豚鼠豚鼠 诱导接触诱导接触14d,间隔间隔1014d,激发接触，观察激发接触，观察24h,48h,72h后有无皮肤反应后有无皮肤反应 比较诱导及激发后皮肤水肿、红斑出现情况比较诱导及激发后皮肤水肿、红斑出现情况http:/ Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use,即“人用药品注册技术要求国际协调会”，它是由欧洲联盟、日本和美国三方的药品管理部门和生产部门组成
