1、专题2微生物的培养和应用专题2微生物的培养和应用 一、微生物的实验室培养1.培养基(1)种类:按培养基的物理性质分为:液体培养基:配制成的液体状态的基质,一般用于生产。固体培养基:在液体培养基中加入凝固剂(如琼脂),配制成的固体状态的基质,琼脂固体培养基是实验室中最常用的培养基之一。专题2微生物的培养和应用(2)培养基配方及营养要素基本营养要素:各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐。此外还要满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。固体培养基适合于分离、鉴定微生物,并且对微生物的计数也适合用固体培养基。但液体培养基适合利用微生物进行发酵,因为液体状态下微生物与营养物质的接触面
2、积大,微生物代谢活动较强。2.无菌技术(1)消毒和灭菌的区别专题2微生物的培养和应用 条件结果常用的方法消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌专题2微生物的培养和应用酒精消毒时,70%的酒精杀菌效果最好,原因是:浓度过高,使菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜,乙醇分子不能渗入其中;浓度过低,杀菌力减弱。(2)无菌技术具体操作对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养
3、基等进行灭菌。为避免周围环境中微生物的污染,实验操作应在酒精灯火焰附近进专题2微生物的培养和应用行。实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触.3.纯化大肠杆菌以及菌种的保藏(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基:计算、称量、熔化、灭菌、倒平板。(2)纯化大肠杆菌原理:在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞,使其长成单个的菌落,这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。专题2微生物的培养和应用方法:平板划线法、稀释涂布平板法。(3)菌种的保藏短期保存:固体斜面培养基上4 保存,菌种易被污染或产生变异。长期保存:-20 甘油管在冷冻箱中保藏。平板划线法和稀释涂布平板法对大肠杆菌的纯化的比较(1)平板
4、划线法中由于划线时,每次从上一次划线的末端开始,线条末端细菌的数目比线条起始处要少,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。专题2微生物的培养和应用(2)稀释涂布平板法中,由于将菌液进行了一系列的梯度稀释和涂布培养,聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞,形成单个菌落。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验,请回答有关问题。(1)制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。(2)为了得到更加准确的结果,选用适宜的方法接种样品:下图是利用 法进行微生物接种,把聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面,为达到这一目的,操作上应注意 。1例专题2微
5、生物的培养和应用(3)适宜温度下培养。结果分析:专题2微生物的培养和应用一同学在稀释倍数为105的培养基中测得平板上菌落数的平均值为32.4个,那么每毫升样品中的细菌数是(接种时所用稀释液的体积为0.1 mL)个。用这种方法所得的数量比实际活菌数量要 ,因为 。(4)在微生物培养操作过程中,为防止杂菌污染,操作者的双手需要进行清洗和 ;已灭菌的材料用具应避免 。(5)培养大肠杆菌时,在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是 。专题2微生物的培养和应用解析:(2)题图为平板划线法分散培养基表面的菌种,操作时应注意保持无菌,第二次及以后每次划线前接种环要灼烧,冷却后从上一
6、区划线末端开始划,首尾区不重叠以便于分散菌种。(3)根据公式菌株数=M=105=324105=3.24107个。由于每个菌落可能是由两个或多个细胞一起形成的,所以此法所得的活菌数比实际活菌数要少。(4)操作者双手用酒精消毒;已灭菌的材料应避免与周围物品接触,防止再次被污染。CV32.40.1专题2微生物的培养和应用(5)接种前检测培养基是否被污染可将未接种的培养基倒置在适宜温度下培养,观察培养基是否有菌落出现,若无则未被污染,若有则已被污染。答案:(2)平板划线第二次及以后每次划线前接种环要灼烧,冷却后从上一区划线末端开始划,首尾区不重叠(3)3.24107少当两个或多个细胞连在一起时,平板上
7、观察到的是一个菌落(4)消毒与周围的物品接触(5)将未接种的培养基在适宜的温度下倒置培养适宜的时间,观察培养基上是否有菌落产生专题2微生物的培养和应用二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1.选择合适的培养基(1)根据培养基的用途可分为选择培养基和鉴别培养基。培养基种类特点用途选择培养基培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物(如培养酵母菌和霉菌,可在培养基中加入青霉素;以尿素为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌)专题2微生物的培养和应用鉴别培养基根据微生物的代谢特点,在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物(如可用伊
8、红美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌,若有,菌落呈深紫色,并带有金属光泽)专题2微生物的培养和应用(2)分离分解尿素的细菌的培养基即为选择培养基,培养基中的氮源只有尿素,理论上只有能合成脲酶的微生物才能在上面生长。2.统计菌落数目的方法(1)显微镜直接计数法原理:利用特定细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。方法:用计数板计数。缺点:不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法)专题2微生物的培养和应用原理:当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌,通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。操作a
9、.设置重复组,增强实验的说服力与准确性。b.为了保证结果准确,一般选择菌落数在30300的平板进行计数。计算公式:每克样品中的菌株数=C/VM,其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL),M代表稀释倍数。专题2微生物的培养和应用3.细菌分离与计数的实验流程土壤取样样品稀释取样涂布微生物培养观察并记录结果细菌计数判断培养基中是否有杂菌污染,需将未接种的培养基同时进行培养;判断选择培养基是否具有筛选作用,需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养,观察两种培养基上的菌落数目,进行对比得出结论。尿素是一种重要的农业肥料,但若不经细菌的分解,就不能更好地被植物
10、利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多,下列是从土壤中分离分解尿素细菌的有关实验,请分析回答问题。2例专题2微生物的培养和应用(1)如果要对培养的菌落进行纯化,在培养基上划线操作中,操作的第一步及每次划线之前都要灼烧接种环,目的是对接种环进行 .(2)下表是一种培养基配方:制备培养基的操作步骤是 。(填选项前的字母)a.倒平板b.计算c.熔化d.称量e.灭菌成分KH2PO4Na2HPO4MgSO47H2O葡萄糖尿素琼脂含量1.4 g2.1 g0.2 g10.0 g1.0 g15.0 g专题2微生物的培养和应用A.abcdeB.ebdcaC.bdcaeD.bdcea该培养基属于 培养基。(填选
11、项前的字母,多选)。A.液体B.固体C.鉴定D.选择E.天然使用该培养基的目的是 。在培养基中加入 指示剂,可初步鉴定出该种细菌能否分解尿素。(3)在进行分离分解尿素的细菌实验时,A同学从培养基上筛选出大约专题2微生物的培养和应用150个菌落,而其他同学只选择出大约50个菌落。A同学的实验结果产生的原因可能有 。(填选项前的字母,多选)A.由于土样不同B.由于培养基被污染C.由于操作失误D.没有设置对照解析:(1)接种前要对接种环进行灼烧灭菌,杀死接种环上残留的细菌.(2)制备培养基的基本步骤是计算称量熔化灭菌倒平板。从成分上看,该培养基中尿素是唯一的氮源,所以属于选择培养基,目的是筛选能分解
12、尿素的细菌。因为含有琼脂,所以该培养基又属于固体培养基。解析解析专题2微生物的培养和应用(3)该同学的培养基中菌落的数目明显多于其他同学,可能的原因是培养基被污染,采用的样土中细菌较多,或者操作有误(如接种时没有将菌液摇匀等)。答案:(1)灭菌 (2)DBD筛选出能分解尿素的细菌酚红 (3)ABC三、分解纤维素的微生物的分离1.纤维素酶是一种复合酶,它包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶,前两种酶使纤维素分解成纤维二糖,第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。专题2微生物的培养和应用2.纤维素分解菌的筛选原理(1)刚果红可以与纤维素形成红色复合物,但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。(2)纤维素分
13、解菌能产生纤维素酶分解纤维素,从而使菌落周围形成透明圈。3.土壤中纤维素分解菌的筛选(1)方案土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落。专题2微生物的培养和应用(2)选择培养的目的:增加纤维素分解菌的浓度,确保能够从样品中分离到所需要的微生物。(3)涉及的微生物技术主要有:培养基的制作、无菌操作、稀释涂布平板法、选择培养基的作用、土壤取样等。(1)纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基,培养基中无凝固剂,利用液体培养基以增加纤维素分解菌的浓度。(2)选择培养基以纤维素作为碳源和能源,其他绝大多数微生物不能正常生长;鉴别培养基含琼脂,故为固体培养基,刚果红
14、染色法就是应用的此培养基。专题2微生物的培养和应用(3)流程中的“选择培养”是为了扩大培养液中的微生物数量,具体需要与否要看土样中微生物的数量。如图为分离并统计分解纤维素的微生物的实验流程,据此回答有关问题。土壤取样梯度稀释将样品接种到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透3例专题2微生物的培养和应用明圈的菌落,统计并计算每克样品中的细菌数(1)要从富含纤维素的环境中分离纤维素分解菌,从高温热泉中寻找耐热菌,这说明 。(2)某同学根据需要,配制了纤维素分解菌的选择培养基如下,整个实验过程严格执行无菌操作。专题2微生物的培养和应用纤维素粉NaNO3Na2HPO47H2OKH2PO45 g1 g1.
15、2 g0.9 gMgSO47H2OKCl酵母膏水解酪素0.5 g0.5 g适量适量如果将其中的纤维素粉换成 ,菌落数 ,即可说明选择培养基的作用。(3)接种微生物最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法,本实验宜采用 法,原因是 。专题2微生物的培养和应用解析:(1)因为纤维素分解菌与耐热菌有不同的生活习性,生活在不同的环境中,故要根据目的菌株对生存环境的要求,到相应的环境中去寻找。(2)因为葡萄糖是纤维素水解、能被微生物直接利用的有机小分子物质,所以如果将其中的纤维素粉换成葡萄糖,纤维素分解菌及其他细菌会生长繁殖得更快,故菌落数明显多于选择培养基。(3)因为稀释涂布平板法要将菌液进行一系列的梯度
16、稀释,故该法可根据稀释体积计算每克样品中的细菌数,而平板划线法则不能这样,所以本实验宜采用稀释涂布平板法。专题2微生物的培养和应用答案:(1)根据目的菌株对生存环境的要求,到相应的环境中去寻找(2)葡萄糖明显多于选择培养基上的菌落数(3)稀释涂布平板平板划线法难以根据稀释体积计算每克样品中的细菌数专题2微生物的培养和应用1.(2012银川模拟)从自然界微生物中筛选某菌种的一般步骤是:采集菌样富集培养纯种分离性能测定。(1)不同微生物的生存环境不同,获得理想微生物的第一步是从适合的环境采集菌样,然后再按一定的方法分离、纯化。培养嗜盐菌的菌样应从 环境中采集。(2)富集培养指创设仅适合待分离微生物
17、旺盛生长的特定环境条件,使其群落中的数量大大增加,从而分离出所需微生物的培养方法。对产耐高温淀粉酶微生物的富集培养应选择 的培养基,并在 条件下培养。专题2微生物的培养和应用(3)接种前要对培养基进行 处理。在整个微生物的分离和培养中,一定要注意在 条件下进行。(4)如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图,请分析接种的具体方法。获得图A效果的接种方法是 ,图B效果的接种方法是 。一同学在纯化土壤中的细菌时,发现培养基上专题2微生物的培养和应用(5)如果探究温度对纤维素酶活性的影响,自变量是 ,应该保的菌落连成一片,最可能的原因是 ,应当怎样操作才可避免此种现象?。持 (至少答
18、两项)等不变。解析:(1)筛选菌种应从适于目的菌种生长、繁殖的环境中寻找,故培养嗜盐菌应从高盐环境中采集。(2)富集培养时培养基及培养条件应能促进目的菌的生长、繁殖。(3)微生物的分离及培养中必须保证无菌,包括培养基的灭菌和操作过程的灭菌等。解析解析专题2微生物的培养和应用(4)纯化培养中接种方法有稀释涂布平板法和平板划线法,前一种方法形成的菌落分布较均匀,后一种方法形成的菌落分布不均匀,先划线的部分菌落密集甚至相连,后划线的部分菌落分布稀疏。(5)探究温度对酶活性的影响时,温度为自变量,酶活性为因变量,其他凡能影响酶活性的变量如底物和酶的用量、pH、反应时间等均为无关变量。答案:(1)海滩等
19、高盐(2)以淀粉为唯一碳源高温专题2微生物的培养和应用(3)高压蒸汽灭菌无菌(4)稀释涂布平板法平板划线法菌液浓度过高增大稀释倍数(或培养过程被杂菌污染严格无菌操作;或用接种环划下一区域前接种环没有灭菌每划一个新区域前都要对接种环进行灭菌处理)(原因与操作要对应)(5)温度纤维素的量与浓度、反应时间、pH专题2微生物的培养和应用2.现在大力提倡无纸化办公,但是每年仍然不可避免要产生大量的废纸,其主要成分是木质纤维,人类正努力将其转化为一种新的资源乙醇。下图是工业上由微生物利用纤维素生产乙醇的基本工艺流程,请回答相关问题。专题2微生物的培养和应用(1)自然界中环节需要的微生物大多分布在 的环境中
20、。将从土壤中获得的微生物培养在以 为碳源、并加入 的培养基上筛选周围有 的菌落。(2)如上所述的筛选中获得了三个菌落,对它们分别培养,并完成环节,且三种等量酶液中酶蛋白浓度相同,则你认为三种酶液的活性 (填“一定相同”“不一定相同”或“一定不相同”),可以通过 进行定量测定。专题2微生物的培养和应用(3)根据测定结果,环节常选择木霉,则中获得的酶是 酶。该酶至少包括 三个组分。(4)生产中可以满足环节的常见菌种是 ,为了确保获得产物乙醇,环节要注意 ,过程要注意避免 。(5)该技术虽然有广阔的前景,但存在酶的成本高等问题,为了降低成本主要从以下几方面入手改进该过程。首先要通过 等技术手段对产酶
21、微生物改造,提高酶的产量。其次,可利用 等技术使酶能够重复利用。专题2微生物的培养和应用解析:(1)题图中培养产纤维素的酶,需要的微生物大多分布在富含纤维素的环境中。在刚果红指示剂的培养基中筛选周围有透明圈的菌落,即可获得要分离的微生物。(2)酶的活性受多种因素的影响,等量的酶液中,即使酶蛋白浓度相同,酶的活性不一定相同,可以用纤维素酶分解纤维素后产生的葡萄糖进行定量分析。(3)木霉中获得的酶主要是纤维素酶,纤维素酶至少包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。专题2微生物的培养和应用(4)发酵生产乙醇离不开酵母菌,同时要提供无氧环境,保证酵母菌的无氧呼吸。(5)通过基因突变或基因工程等技术手段改造产酶
22、微生物,提高酶的产量;同时可利用固定化酶等技术使酶重复利用。答案:(1)富含纤维素(其他答案合理也可,如落叶较多等)纤维素刚果红透明圈(2)不一定相同对纤维素酶分解纤维素后所产生的葡萄糖(3)纤维素C1酶、Cx酶、葡萄糖苷酶(4)酵母菌发酵装置密闭(或保证无氧条件等)杂菌污染(5)基因工程(基因突变)固定化酶专题2微生物的培养和应用3.(密码改编)氯苯化合物是重要的有机化工原料,因其不易降解,会污染环境。某研究小组依照下列实验方案(图1)筛选出能高效降解氯苯的微生物SP1菌,培养基配方如下表。图1专题2微生物的培养和应用表培养基的组成液体培养基蛋白胨 牛肉膏氯苯氯化钠 硝酸铵 无机盐(无碳)蒸
23、馏水号10 g5 g5 mg5 g1 L号50 mg5 g3 g适量1 L号2080 mg5 g3 g适量1 L专题2微生物的培养和应用(1)配制号固体培养基时,除添加号液体培养基成分外,还应添加1%的 。(2)培养基配制时,灭菌与调pH的先后顺序是 。(3)从用途上来说,号培养基和号培养基分别属于 培养基和 培养基。在号培养基中,为SP1菌提供氮源的成分是 。(4)将SP1菌接种在含不同浓度氯苯的号培养液中培养,得到生长曲线(如图2)。从图2可知,SP1菌在 培养条件下最早停止生长,其原因是 。专题2微生物的培养和应用 图2解析:(1)固体培养基必须含有适量的琼脂。(2)配制培养基时应先调p
24、H后灭菌。(3)号培养基是为了获得更多的菌株,属于通用培养基,号培养基是为选择出SP1菌株,属于选择培养基,号培养基成分中含N物质为硝酸铵,由它为SP1菌株提供氮源。(4)SP1菌株以氯苯为解析解析专题2微生物的培养和应用碳源,当氯苯耗尽时,菌株因缺少碳源而不能继续生存,故氯苯含量越少,SP1菌株越早停止生长。答案:(1)琼脂 (2)先调pH,后灭菌(3)通用选择硝酸铵(4)20 mg/L氯苯碳源最早耗尽专题2微生物的培养和应用4.(2012河南焦作)如图表示为平板划线法分离纯化细菌示意图。根据所学生物学知识,回答下列问题。(1)微生物所需的营养成分包括 、水和无机盐。(2)培养微生物时,除考
25、虑微生物生长所需的营养外,还要考虑微生物生长所需的温度、以及是否需要O2等。专题2微生物的培养和应用(3)对培养基进行灭菌时,多采用 法,而对接种环或涂布器灭菌时则用 法。(4)平板划线时,为保证每次划线都从上次划线末端的微生物浓度开始,所以每次划线前都要 ,平板划线结束后,最后一次划的线不能与第一次划的线 。(5)脲酶可以将尿素分解为NH3,从而使尿素溶液pH升高,这可用 试剂来检验。用纤维素做唯一碳源的培养基培养微生物,得到的纤维素分解菌中可能还混杂有 (生物)。专题2微生物的培养和应用(6)抗生素可以抑制肽聚糖合成,从而可以抑制多数原核生物繁殖。实验室现有酵母菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌
26、三种微生物混杂生长的固体培养基,已知大肠杆菌菌落遇伊红美蓝试剂变为紫色,并带有金属光泽;金黄色葡萄球菌耐高浓度食盐水,菌落为金黄色;酵母菌细胞壁成分主要为几丁质,营养条件好,氧气充足,显微镜下可见典型的出芽生殖。现在请你设计一个合理的实验方案,从一个培养基中,将三种微生物一次分离开来。(所需试剂可自选)实验方案:。专题2微生物的培养和应用解析:本题考查多为识记内容,如培养基的成分、微生物生长条件、常用的灭菌方法等,即前三小题。(4)考查平板划线法的操作方法,如果划线相重合则不能分离出纯种。(5)酚酞可检验碱性溶液,用纤维素做唯一碳源的培养基培养微生物,得到纤维素分解菌,但自养微生物也能生存,需
27、要进一步分离。(6)根据条件可以将不同菌分离开来,见答案。答案:(1)碳源氮源(2)pH(3)高压蒸汽灭菌灼烧灭菌专题2微生物的培养和应用(4)对接种环灼烧灭菌相交(相接、相连、交叉等)(5)酚酞自养微生物(硝化细菌)(6)实验方案:根据菌落颜色,首先分离出金黄色葡萄球菌;然后向培养基中加入伊红美蓝试剂,将变为紫色,带有金属光泽的菌落分离出来,得到大肠杆菌;然后加入非磺胺类抗生素如青霉素,将培养基中的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌杀死,得到酵母菌。(分离顺序不唯一,答案合理即可)专题2微生物的培养和应用5.某生物兴趣小组进行研究性学习,探究“影响细菌生长繁殖的因素”。在培养细菌的过程中,发现某种细菌
28、(记作R菌)周围的其他细菌的生长繁殖受到抑制,他们把R菌接种到专门的培养基上进行培养。一段时间后,他们除去R菌,用该培养基再培养其他细菌,结果,其他细菌不能在这个培养基上生长繁殖。(1)从生态学的角度分析,R菌与周围细菌之间的关系是 。(2)某同学假设了造成R菌周围的其他细菌不能生长繁殖的原因,你认为最可能的原因是 。A.R菌占据了其他细菌的生存空间专题2微生物的培养和应用B.R菌吞噬了其他细菌C.R菌产生了不利于其他细菌生长繁殖的物质D.R菌更容易吸收培养基中的物质(3)参照上述题目中给出的有关材料,请设计一个实验,对第(2)题作出的选择进行验证,简述你的实验步骤、结果及结论。实验步骤:第一
29、步:取两个培养皿,按相同营养成分分别配制甲、乙两个培养基.第二步:。专题2微生物的培养和应用第三步:。第四步:在相同条件下,让甲、乙两个培养基上的细菌生长繁殖。结果:。结论:。解析:两种生物生活在一起,因食物和生活空间而进行斗争的现象称为竞争。在验证造成R菌周围其他细菌不能生长繁殖的原因的实验中,培养基中是否含有R菌产生的不利于其他细菌生长繁殖的物质是唯一变量(自变量)。如何证明R菌产生不利于其他细菌生长繁殖的物质是本实验设计的关键点。在实验中,其中一个培养基上接种R菌,另一个培养基上不接种。培养一段时间后除去R菌(除去R菌的方法解析解析专题2微生物的培养和应用不作要求)作为实验组,没有培养R菌的培养基作为对照组,再分别接种相同的其他细菌,培养后观察细菌的生长状况即可得出结论。答案:(1)竞争(2)C(3)第二步:甲培养基上接种R菌,培养一段时间后除去R菌,乙培养基上不接种R菌,作为对照第三步:两个培养基分别接种相同的其他细菌甲培养基上的细菌的生长繁殖受到抑制,乙培养基上的细菌能正常生长繁殖R菌产生了不利于其他细菌生长繁殖的物质
