1、-LXF2019.4.101第一代测序技术原理：1.Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法(Sanger,1977)2.MaxamGilbert DNA化学降解法化学降解法(Maxam&Gilbert,1977)2Dideoxynucleotides（双脱氧核苷酸）u ddNTPs 是反应终止剂是反应终止剂可以当作正常碱基参与复制，一旦链入DNA中，其后就不能再继续中，其后就不能再继续连接。u反应体系中dNTPs的浓度远高于的浓度远高于ddNTPs(一般一般3-4：1)。3Sanger双脱氧终止法双脱氧终止法与 PCR反应类似；反应体系中包含：模板 DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs
2、和测序引物；反应过程：变性复性延伸终止4Sanger第一步：加入复制终止剂第一步：加入复制终止剂5ddNTPs参与下的DNA复制Sanger法测序产物的平均链长取决于ddNTP：dNTP的比例,比例高时，得到较短的产物；（BigDye，HiDi）“标记终止法标记终止法”测序产物测序产物的平均长度可通过标记反应中dNTP浓度(高浓度能得到长的产物)或终止反应的ddNTP:dNTP来调整。6Sanger第二步：荧光检测7Gel ElectrophoresisDNA Fragment Size DeterminationDNA 带负电DNA在电泳胶中的迁移率与其片段大小有关8关于ABI3730 xl
3、u 毛细管规格毛细管规格:96道毛细管道毛细管u 毛细管长度毛细管长度:50cmu 凝胶的规格凝胶的规格:POP-7液体分离胶液体分离胶u 配套的试剂配套的试剂:基因测序基因测序(BigDye3.1v和和5Sequence buffer)基因基因分型分型(Liz120,Liz500,ROX500)u 基因基因测序及分型的运行时间测序及分型的运行时间 时间：96样本 2h 通量：（94-96）/384*12u 读长：700-900bp9长片段的测序Primer Walking：获得未知克隆的序列信息，或者验证克隆序列的准确性。如果提供参考序列，可以一次完成长片段克隆的全长测序。Fragment1
4、Fragment2Fragment3Fragment4Legend：PrimerFragment10基于ABI3730 xl平台的扩展应用1.Gene Synthesis：protein/DNA sequence of interestdesign oligosorder oligosRun 1st round PCR(assembly)Run 2nd round PCR(amplification)ligate into vector,transformPick colony and screen recombinants by colony PCRSequencing recombinan
5、tsPlasmid minipreparation4 day between PCR amplification and sequencing-confirmed plasmid(at best!)11基于ABI3730 xl平台的扩展应用2.STR:uSTR/SSR:是由长度为2-7个碱基的核苷酸序列重复构成的多态性DNA标记，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度可变性，因此在同一个基因位点创造了多个不同的等位基因。微卫星分析通常被用来创建遗传图谱，连锁分析以及对遗传性状的追踪。u原理：在一端引物上标记特定的荧光,通过PCR产物长度大小，检测基因型.12基于ABI3730 xl平台的扩展应用
6、2.STR:13基于ABI3730 xl平台的扩展应用3.SNP:u传统测序法u金标准14基于ABI3730 xl平台的扩展应用3.SNP:u传统测序法u金标准15基于ABI3730 xl平台的扩展应用3.SNP:uSNaPshot适合5-12个及以上的SNP位点的检测该检测方法的主要原理为单碱基延伸技术，并且利用引物片段的大小，从而把不同位点的检测结果区分开。16基于ABI3730 xl平台的扩展应用17基于ABI3730 xl平台的扩展应用18基于ABI3730 xl平台的扩展应用19基于ABI3730 xl平台的扩展应用3.SNP:uSNPlexSNPlex Genotyping Sys
7、tem是基于荧光检测方法来进行。DNA模板直接与一套3个探针组成的系统结合，这3个探针包括2个等位基因探针ASO和1个位点特异探针LSO。当ASO探针和LSO探针与模板完全匹配时，连接酶连接两条探针。然后使用生物素标记的PCR引物扩增该连接产物。生物素标记的扩增产物结合在链霉亲核素包被的杂交板孔中，通过碱变性的方法使生物素标记的单链PCR产物保留在杂交板中，然后该单链PCR产物与一套通用Zipchute探针杂交结合。这些探针带有荧光标记，它们具有特殊的片段与单链PCR 产物的特殊部位互补，还包含有修饰部分，一条Zipchute 探针对应一个待检测等位基因，然后将杂交捕获到的Zipchute 探
8、针分离出来，通过毛细管电泳进行检测，最后通过GeneMapper软件分析来确定SNP基因型。20基于ABI3730 xl平台的扩展应用21第二代测序平台454(GS-FLX)SolexaSOLiD22454(GS-FLX)原理：原理：依赖于核苷酸掺入中焦磷酸盐的释放。该技术是由波尔尼伦和穆斯塔法罗纳吉于2019年在斯德哥尔摩的皇家工学院发展出来的。454的突破之处：将试剂和模板统统都吸附在一个个微珠上，然后把这些微珠一个个地放到芯片上的小孔中，每孔一个微珠。保证了反应的独立性，节省试剂耗材。23GS FLX系统的流程概括起来，就是“一个片段=一个磁珠=一条读长（One fragment=One
9、 bead=One read）”。1）样品输入并片段化：GS FLX系统支持各种不同来源的样品，包括基因组DNA、PCR产物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。大的样品例如基因组DNA或者BAC等被打断成300800 bp的片段；对于小分子的非编码RNA或者PCR扩增产物，这一步则不需要。短的PCR产物则可以直接跳到步骤3)。242）文库制备：借助一系列标准的分子生物学技术，将A和B接头（3和5端具有特异性）连接到DNA片段上。接头也将用于后续的纯化，扩增和测序步骤。具有A、B接头的单链DNA片段组成了样品文库。3）一个DNA片段一个磁珠：单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上。每
10、一个磁珠携带了一个独特的单链DNA片段。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。254）乳液PCR扩增：每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。对于每一个片段而言，扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增的片段仍然结合在磁珠上。26携带DNA的捕获磁珠放入PTP板中将PTP板放置在GS FLX中四种碱基依次循环进入PTP板发生碱基配对，释放一个焦磷酸释放出光信号（从萤光素到氧化萤光素）CCD捕获一个磁珠一条读长27454(GS-FLX)小
11、结：GS FLX系统的流程概括起来，就是“一个片段=一个磁珠=一条读长（One fragment=One bead=One read）”。GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息。GS FLX系统的准确率在99%以上。其主要限制来自同聚物，也就是相同碱基的连续掺入，如AAA或GGG。454测序平台的主要错误类型是插入-缺失，而不是替换。28Illumina公司的新一代测序仪Genome Analyzer最早由Solexa公司研发，利用其专利核心技术“DNA簇”和“可逆性末端终结（reversible terminator）”，实现自动化样本制备及基
12、因组数百万个碱基大规模平行测序。Illumina 测序仪测序仪29Genome Analyzer技术的基本原理1.文库制备文库制备将基因组DNA打成几百个碱基（或更短）的小片段，在片段的两个末端加上接头(adapter)。30Genome Analyzer技术的基本原理2.产生产生DNA簇簇利用专利的芯片，其表面连接有一层单链引物，DNA片段变成单链后通过与芯片表面的引物碱基互补被一端“固定”在芯片上。另外一端（5或3）随机和附近的另外一个引物互补，也被“固定”住，形成“桥(bridge)“。反复30轮扩增，每个单分子得到了1000倍扩增，成为单克隆DNA簇。DNA簇产生之后，扩增子被线性化，
13、测序引物随后杂交在目标区域一侧的通用序列上。31Genome Analyzer技术的基本原理 Genome Analyzer系统应用了边合成边测序（Sequencing By Synthesis）的原理。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的SBS（边合成边测序）技术对待测的模板DNA进行测序。加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。这些核苷酸是“可逆终止子”，因为3羟基末端带有可化学切割的部分，它只容许每个循环掺入单个碱基。此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复3端粘性，继续聚合第二个核
14、苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。32Genome Analyzer系统的优势1.可扩展的超高可扩展的超高通量通量 Genome Analyzer系统目前每次运行后可获得超过20 GB的高品质过滤数据。2.需要样品量需要样品量少少需要的样品量低至100ng，能应用在很多样品有限的实验（比如免疫沉淀、显微切割等）中。3.简单、快速、简单、快速、自动化自动化提供了最简单和简洁的工作流程。33SOLiD(Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection)原理原理：用连接法测序获得基于：用连接法测序获得基于“双碱基编码原理双
15、碱基编码原理”的的SOLiD颜色编码序列，随后的数据分析比较原始颜色颜色编码序列，随后的数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编码的序列与转换成颜色编码的reference序列，把序列，把SOLiD颜色序列定位到颜色序列定位到reference上，同时校正测序错误，上，同时校正测序错误，并可结合原始颜色序列的质量信息发现潜在并可结合原始颜色序列的质量信息发现潜在SNP位点。位点。SOLID 测序仪34SOLID工作流程A 文库文库制备制备B 乳液乳液PCR/微珠富集微珠富集C 微珠沉积微珠沉积D 连接测序连接测序E 数据分析数据分析35SOLID工作流程ACGTACGT2nd Base1st B
16、aseDetecting a single color does not indicate a base Each reading contains information from two basesTo decode the bases you must know one of the bases in the sequence36SOLiD 4-color ligation reaction37SOLiD 4-color ligation reactionTemplate Sequence 53 Adapter Oligo Sequence 1mbead1mbeadligaseligas
17、e3 p5 universal seq primer universal seq primer 53GT-probe53CT-probe53TT-probe5AT-proben n n A T z z zn n n GT z z zn n n T T z z zn n n C T z z zATp538SOLiD 4-color ligation reaction39SOLiD 4-color ligation reaction40SOLiD 4-color ligation reactionACGTACGT2nd Base1st BaseIf know first base is an A
18、then immediately it decodes 2nd base.This must be an A as Blue translates 2nd base A if first base AAACCGGTTACCAGTTGACCAGTTGAACCGGTTAACCGGTTAGCTGATCAGCTGATCAGCTGATCATCGGCTAExample:41SOLiD 4-color ligation reaction42u优势：系统可系统可扩展性扩展性最大的最大的灵活性灵活性全基因表达图全基因表达图谱分析谱分析更多更多RNA研究研究SNP分析分析甲基化分析甲基化分析SOLID 测序仪43
19、第三代测序技术HeliScopePacific Biosciences：SMRT Oxford Nanopore Technologies44HeliScopeHelicos公司：基于单分子边合成边测序的原理随机打断成小片段3末端加上Poly(A)在接头末端加上CY3荧光标记小片段与表面带有寡聚Poly(T)的平板杂交加入DNA聚合酶和CY5荧光标记的dNTP进行DNA合成反应每一轮反应加一种dNTP。洗脱，记录荧光信号用化学试剂去掉荧光标记，进行下一轮反应。不断地重复合成、洗脱、成像、淬灭过程完成测序45HeliScope基于单分子边合成边测序的原理46 Heliscope的读取长度约为30
20、-35 nt，每个循环的数据产出量为21-28 Gb。PacBio-SMRT基于边合成边测序的思想，以SMRT芯片为测序载体进行测序反应。SMRT芯片是一种带有很多ZMW(zero-mode waveguides，零模波导)孔的厚度为100 nm的金属片。将DNA聚合酶、待测序列和不同荧光标记的dNTP放入ZMW孔的底部，进行合成反应。与其他技术不同的是，荧光标记的位置是3磷酸基团而不是5甲基碱基。47PacBio-SMRT48PacBio-SMRT当一个dNTP被添加到合成链上的同时，它会进入ZMW孔的荧光信号检测区并在激光束的激发下发出荧光，根据荧光的种类就可以判定dNTP的种类。其它未参
21、与合成的dNTP由于没进入荧光型号检测区而不会发出荧光。在下一个dNTP被添加到合成链之前，这个dNTP的磷酸基团会被氟聚合物（fluoropolymer）切割并释放，荧光分子离开荧光信号检测区。49PacBio-SMRT合成过程中，每次进入一个碱基，原始数据会实时地产生一个脉冲峰，每两个相邻的脉冲峰之间有一定的距离。距离与模板上碱基是否存在修饰有关，如果有碱基修饰，就会导致两个相邻峰之间距离加大。根据这个距离的变化，可以判断模板相应位点是否出现碱基修饰，并且结果是实时的。可以用于甲基化等碱基修饰研究。50PacBio-SMRT2019年底，Pacific Biosciences发布XL系列超
22、长测序试剂，使平均读长达到5,000 bp，其中5%的读长将超过13,000bp，最长超过20,000bp。据公司CTO Steve Turner介绍，到今年年底，这些数字可能再翻倍。51Oxford Nanopore Technologies基于电信号测序的技术设计了一种以-溶血素为材料制作的纳米孔，在孔内共价结合有分子接头环糊精。用核酸外切酶切割ssDNA时，被切下来的单个碱基会落入纳米孔，并和纳米孔内的环糊精相互作用，短暂地影响流过纳米孔的电流强度，这种电流强度的变化幅度就成为每种碱基的特征。52小结：三代测序技术的原理各有特点，适用范围也不近相同。第一代测序技术凭借其长的序列片段和高的准确率，适合对新物种进行基因组长距框架的搭建以及后期GAP填补，但是成本昂贵，而且难以胜任微量DNA样品的测序工作。53小结：第二代测序技术中454序列片段最长，比较适合对未知基因组从头测序，搭建主体结构，但是在判断连续单碱基重复区时准确度不高。Solexa较454具有通量高、片段短、价位低的特点，可以用于大基因组和小基因组的测序和重测序。SOLiD基于双碱基编码系统的纠错能力以及较高的测序通量，适合转录本研究以及比较基因组学特别是SNP检测等，但是测序的片段短限制了该技术在基因组拼接中的广泛应用。第三代测序技术目前正在发展中，在未来会成为主导。5455
