1、第三节第三节 化学遗传学方法化学遗传学方法 二十年前，编码蛋白的发现引起了细胞周期调节领域二十年前，编码蛋白的发现引起了细胞周期调节领域的一场革命。它们作为重要的信号传导组分的确认加的一场革命。它们作为重要的信号传导组分的确认加速了在这个领域的研究，为进一步生物化学研究提供速了在这个领域的研究，为进一步生物化学研究提供了必要的起点。在近些年，生物活性的小分子化合物了必要的起点。在近些年，生物活性的小分子化合物已经在细胞生物学中起到类似的作用，化学生物学这已经在细胞生物学中起到类似的作用，化学生物学这一新领域把那些致力于了解和模拟自然世界的化学家一新领域把那些致力于了解和模拟自然世界的化学家和生
2、物学家带到一起。和生物学家带到一起。19941994，哈佛大学的，哈佛大学的Tim Mitchison1Tim Mitchison1教授在首期的教授在首期的“Chemistv&Bio1ogyChemistv&Bio1ogy化学和生物学化学和生物学上阐述了化上阐述了化学遗传学学遗传学(chemical genetics)(chemical genetics)的基本概念。他指出要的基本概念。他指出要探索生命过程必须有干扰生命过程的手段，然后才能探索生命过程必须有干扰生命过程的手段，然后才能了解其后果。随后，哈佛大学了解其后果。随后，哈佛大学stuart L.Schreiberstuart L.Sc
3、hreiber教教授和授和Tim MitchisonTim Mitchison教授开始利用小分子来系统地探索教授开始利用小分子来系统地探索细胞和蛋白质的生理功能。细胞和蛋白质的生理功能。化学遗传学采用小分子活性化合物作为探针，以多种方化学遗传学采用小分子活性化合物作为探针，以多种方式影响靶蛋白的功能，探索和控制细胞过程。从另一方式影响靶蛋白的功能，探索和控制细胞过程。从另一方面来说，化学遗传学研究所获得的成果面来说，化学遗传学研究所获得的成果-小分子化合物小分子化合物及其生物学效应，除了被用来揭示生命的基本活动规律及其生物学效应，除了被用来揭示生命的基本活动规律外，还可能成为候选药物。外，还可
4、能成为候选药物。也就是说化学遗传学的研究活动不是单纯的基础研究，也就是说化学遗传学的研究活动不是单纯的基础研究，而与应用紧密相联。所以很多大型制药公司都非常关注而与应用紧密相联。所以很多大型制药公司都非常关注化学遗传学。化学遗传学。例如，哈佛大学在成立一个以从事化学遗传学为核心的例如，哈佛大学在成立一个以从事化学遗传学为核心的“化学与细胞生物学研究所化学与细胞生物学研究所”时，著名的默克制药公司时，著名的默克制药公司（MerckMerck）就成为了该所的主要赞助者之一。可以说，）就成为了该所的主要赞助者之一。可以说，化学遗传学的出现把传统的学术研究实验室引进了药物化学遗传学的出现把传统的学术研
5、究实验室引进了药物开发的战场。开发的战场。在在“化学遗传学化学遗传学”出现的同时，又出现了出现的同时，又出现了“化学基因组化学基因组学学”的概念。两者的研究思路、内容基本相同，只不过的概念。两者的研究思路、内容基本相同，只不过化学基因组学在化学遗传学及化学蛋白质组学的基础上化学基因组学在化学遗传学及化学蛋白质组学的基础上又向前一步，研究与人类疾病密切相关基因的生物功能。又向前一步，研究与人类疾病密切相关基因的生物功能。考虑到本书中很少涉及到基因组学内容，因此，主要介考虑到本书中很少涉及到基因组学内容，因此，主要介绍化学遗传学方法。绍化学遗传学方法。化学遗传学与传统的遗传学在思路上有相通之处，它
6、还化学遗传学与传统的遗传学在思路上有相通之处，它还可以分为正向化学遗传可以分为正向化学遗传(forward chemical genetics)(forward chemical genetics)和和反向化学遗传反向化学遗传(reverse chemical genetics)(reverse chemical genetics)。前者用动物细胞、微生物以及它们的裂解产物来寻找对前者用动物细胞、微生物以及它们的裂解产物来寻找对生物过程产生影响的小分子，并确定相应的蛋白靶；后生物过程产生影响的小分子，并确定相应的蛋白靶；后者则是先高表达某种蛋白，寻找与蛋白结合或影响纯蛋者则是先高表达某种蛋白，
7、寻找与蛋白结合或影响纯蛋白的功能的小分子，再对找到的小分子在体内进行对此白的功能的小分子，再对找到的小分子在体内进行对此蛋白的功能影响实验。蛋白的功能影响实验。一、化学遗传学的基本方法一、化学遗传学的基本方法根据人类基因组的草图，基因的表达产物根据人类基因组的草图，基因的表达产物-蛋白质的数蛋白质的数量在量在100100，000000到数百万个，其中大部分属于目前还不清到数百万个，其中大部分属于目前还不清楚的未知蛋白质，而化学遗传学通过使用小分子作为探楚的未知蛋白质，而化学遗传学通过使用小分子作为探针研究细胞内或完整组织中蛋白质的功能，通过这些分针研究细胞内或完整组织中蛋白质的功能，通过这些分
8、子探针作用模型的生物化学解释，有助得到关于复杂细子探针作用模型的生物化学解释，有助得到关于复杂细胞过程中蛋白质功能的新信息。胞过程中蛋白质功能的新信息。化学遗传学的第一个关键环节是合成可供筛选的小分子化学遗传学的第一个关键环节是合成可供筛选的小分子库，第二个关键环节是发展准确、高速和低成本的化学库，第二个关键环节是发展准确、高速和低成本的化学库筛选方法，获得尽可能多的机理和特异性信息，第三库筛选方法，获得尽可能多的机理和特异性信息，第三个关键环节是确证筛选得到的化合物结构，并确认蛋白个关键环节是确证筛选得到的化合物结构，并确认蛋白标靶以及优化化合物的蛋白亲和性。标靶以及优化化合物的蛋白亲和性。
9、1 1，小分子化合物库的构建，小分子化合物库的构建-高高通量合成和制备通量合成和制备过去，生物活性小分子主要是从生物有机过去，生物活性小分子主要是从生物有机体中发现的，但是，很可能它被认定的活体中发现的，但是，很可能它被认定的活性是由于机体内许多化合物的协同作用造性是由于机体内许多化合物的协同作用造成的，而不仅仅取决于这一小分子。为了成的，而不仅仅取决于这一小分子。为了克服这一困难，需要构建包含大量具有确克服这一困难，需要构建包含大量具有确定结构的小分子化合物库。定结构的小分子化合物库。2 2，生物活性的检测，生物活性的检测-高通量筛选高通量筛选 在过去，从万个化合物中筛选具有生物活性的小分子
10、在过去，从万个化合物中筛选具有生物活性的小分子化合物是比较烦琐和困难的，高通量筛选是指运用自化合物是比较烦琐和困难的，高通量筛选是指运用自动化的筛选系统在相对短时间内，通过特定的生物模动化的筛选系统在相对短时间内，通过特定的生物模型来对成千上万化合物进行活性筛选。现在人们可以型来对成千上万化合物进行活性筛选。现在人们可以尽可能采用自动的方式利用尽可能采用自动的方式利用9696、384384或或15361536孔板进行生孔板进行生物活性分子的筛选（图物活性分子的筛选（图a a）。）。在设计化学遗传学适合的筛选方法过程中，首先要确在设计化学遗传学适合的筛选方法过程中，首先要确定是采用哪种化学遗传学
11、方法，即正向还是反向化学定是采用哪种化学遗传学方法，即正向还是反向化学遗传学方法，以便选择遗传学方法，以便选择“纯蛋白纯蛋白”、“细胞细胞”或或“胚胚胎胎”检测方式检测方式(图图b)b)。筛选过程首先是确定生物活性靶。筛选过程首先是确定生物活性靶点以及检测活性的方法，然后再设计相应的用于高通点以及检测活性的方法，然后再设计相应的用于高通量筛选的平台。为了确保高通量筛选结果的有效性，量筛选的平台。为了确保高通量筛选结果的有效性，所用的检测方法必须灵敏，而且重复性好。所用的检测方法必须灵敏，而且重复性好。高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成
12、的新的技术体系，它以分子水平和细胞水平的实验成的新的技术体系，它以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理，在同一时间内对数以千、万计的样品进行检测，理，在同一时间内对数以千、万计的样品进行检测，并以相应的数据库支持整个技术体系的正常运转。并以相应的数据库支持整个技术体系的正常运转。分子水平和细胞水平的实验方法分子水平和细胞水平的实验方
13、法(或称筛选模型或称筛选模型)是实是实现高通量药物筛选的技术基础。由于高通量药物筛选现高通量药物筛选的技术基础。由于高通量药物筛选要求同时处理大量样品，实验体系必须微量化。这些要求同时处理大量样品，实验体系必须微量化。这些微量化的实验方法有些是应用传统的实验方法加以改微量化的实验方法有些是应用传统的实验方法加以改进建立的，更多的是根据新的科学研究成果建立的。进建立的，更多的是根据新的科学研究成果建立的。高通量筛选技术高通量筛选技术高通量药物筛选的检测系统快速、高灵敏度的高通量药物筛选的检测系统快速、高灵敏度的检测技术是高通量药物筛选的关键技术之一。检测技术是高通量药物筛选的关键技术之一。在高通
14、量药物筛选中，检测系统一般采用液闪在高通量药物筛选中，检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪等。检测仪器灵敏度的不断度仪、荧光光度仪等。检测仪器灵敏度的不断提高，即使对微量样品的检测，也可以得到很提高，即使对微量样品的检测，也可以得到很好的检测效果。好的检测效果。常用的高通量药物筛选模型可以根据其生物学常用的高通量药物筛选模型可以根据其生物学特点分为以下几类：受体结合分析法。酶特点分为以下几类：受体结合分析法。酶活性测定法。细胞因子测定法。细胞活性活性测定法。细胞因子测定法。细胞活性测定法。代谢物质测定法。基因产物测
15、定测定法。代谢物质测定法。基因产物测定法等等。法等等。1、酶标仪、酶标仪酶标仪是一种用途广泛的酶标仪是一种用途广泛的生物检验医疗设备，利用生物检验医疗设备，利用酶联免疫分析法，根据酶酶联免疫分析法，根据酶标记原理，根据呈色物的标记原理，根据呈色物的有、无和呈色深浅进行定有、无和呈色深浅进行定性或定量分析。性或定量分析。这是一种极具生命力的免这是一种极具生命力的免疫学技术。可用于单克隆疫学技术。可用于单克隆抗体筛分、凝血分、抗生抗体筛分、凝血分、抗生素灵敏度检验，以及其它素灵敏度检验，以及其它需要进行比色的分析工作需要进行比色的分析工作中。中。按照功能的划分，酶标仪可以分为光吸收酶标按照功能的划
16、分，酶标仪可以分为光吸收酶标仪，荧光酶标仪，化学发光酶标仪和多功能的仪，荧光酶标仪，化学发光酶标仪和多功能的酶标仪。光吸收酶标仪是用来进行可见光与紫酶标仪。光吸收酶标仪是用来进行可见光与紫外光吸光度的检测。外光吸光度的检测。特定波长的光通过微孔板中的样品后，光能量特定波长的光通过微孔板中的样品后，光能量被吸收，而被吸收的光能量与样品的浓度呈一被吸收，而被吸收的光能量与样品的浓度呈一定的比例关系，由此可以用来定性和定量的检定的比例关系，由此可以用来定性和定量的检测。测。光吸收的检测技术成熟，成本低，操作简单，光吸收的检测技术成熟，成本低，操作简单，但是动态范围窄，灵敏度比较低，特异性不强。但是动
17、态范围窄，灵敏度比较低，特异性不强。一般可见光和紫外光分别采用钨灯及氘灯作为一般可见光和紫外光分别采用钨灯及氘灯作为光源，而紫外光源，而紫外/可见酶标仪是可以将两种光源可见酶标仪是可以将两种光源进行切换，适应不同测量波长的需求。进行切换，适应不同测量波长的需求。荧光酶标仪是用来进行荧光的检测，通过激发荧光酶标仪是用来进行荧光的检测，通过激发光栅分光后的特定波长的光照射到被荧光物质光栅分光后的特定波长的光照射到被荧光物质标定的样品上后，会发出波长更长的发射光，标定的样品上后，会发出波长更长的发射光，通过发射光栅后到达检测器。荧光的强度与样通过发射光栅后到达检测器。荧光的强度与样品的浓度呈一定的比
18、例。荧光检测灵敏度高，品的浓度呈一定的比例。荧光检测灵敏度高，可实时检测，使用方便，检测模式多样，但是可实时检测，使用方便，检测模式多样，但是容易受外界干扰，激发光与发射光容易互相影容易受外界干扰，激发光与发射光容易互相影响，干扰检测。响，干扰检测。化学发光是来自生物化学反应中的自发光，可化学发光是来自生物化学反应中的自发光，可分为辉光型和闪光型两种类型。辉光型发光持分为辉光型和闪光型两种类型。辉光型发光持久，稳定，能持续一段时间；闪光型发光时间久，稳定，能持续一段时间；闪光型发光时间短，变化快，稳定性不强，需要应用自动加样短，变化快，稳定性不强，需要应用自动加样器才可以进行。化学发光中发出的
19、光子数与样器才可以进行。化学发光中发出的光子数与样品量呈一定比例关系，化学发光酶标仪灵敏度品量呈一定比例关系，化学发光酶标仪灵敏度非常高，动力学范围广。非常高，动力学范围广。2，多功能酶标仪，多功能酶标仪 多功能酶标仪又称多功能微孔板检测仪，可对多功能酶标仪又称多功能微孔板检测仪，可对以微孔板为体系的实验提供多种不同模式的检以微孔板为体系的实验提供多种不同模式的检测。通常，多功能酶标仪至少可提供测。通常，多功能酶标仪至少可提供“吸收吸收光光”、“荧光荧光”、“发光发光”三种不同的检测模三种不同的检测模式。一些中高端多功能酶标仪还可完成式。一些中高端多功能酶标仪还可完成“时间时间分辨荧光分辨荧光
20、”、“荧光偏振荧光偏振”、“荧光共振能量荧光共振能量转移转移”等高级荧光检测实验。等高级荧光检测实验。多功能酶标仪工作站多功能酶标仪工作站FlexstationFlexstation 3 3具有双具有双光栅提供光栅提供1nm1nm步径全波长步径全波长检测，可对检测，可对6-3846-384孔微孔孔微孔板进行光吸收板进行光吸收(紫外紫外-可可见见)(200-1000nm)(200-1000nm)、荧光、荧光强度强度(250-850nm)(250-850nm)、化学、化学发光发光(250-850nm)(250-850nm)、荧光、荧光偏振偏振(400-750nm)(400-750nm)和时间和时间
21、分辨荧光分辨荧光(250-850nm)(250-850nm)五五大功能的检测。大功能的检测。3 3，高通量自动筛选系统，高通量自动筛选系统 高通量药物筛选应用的实验方法总体积一般要求在高通量药物筛选应用的实验方法总体积一般要求在2 2250250 l l，自动化操作系统主要是指实验室自动化工作站，俗，自动化操作系统主要是指实验室自动化工作站，俗称药物筛选机器人，是由计算机控制的全自动实验室操作称药物筛选机器人，是由计算机控制的全自动实验室操作设备。设备。试验室自动化工作站的基本功能是可以自动连续地完成试试验室自动化工作站的基本功能是可以自动连续地完成试验的基本操作，如验的基本操作，如加样：即向
22、每个反应单位加样：即向每个反应单位(微板中的每一个孔微板中的每一个孔)中加入各种中加入各种不同成分、不同浓度、不同容积的溶液；不同成分、不同浓度、不同容积的溶液；稀释：实际上就是加入一定容积的样品或试剂溶液后，再稀释：实际上就是加入一定容积的样品或试剂溶液后，再加入一定的溶媒；加入一定的溶媒；转移：主要是完成某一试剂或样品的位置变化；转移：主要是完成某一试剂或样品的位置变化；混合：将加入的不同溶液进行混合，混合的方式有震荡，混合：将加入的不同溶液进行混合，混合的方式有震荡，也可以用加样器反复吹吸混合；也可以用加样器反复吹吸混合；洗板：用适当的溶液清洗板：用适当的溶液清洗试验用的微板，或洗洗试验
23、用的微板，或洗除不需要的反应液；除不需要的反应液；温孵：让反应体系在一温孵：让反应体系在一定的温度条件下保持一定的温度条件下保持一定的时间，使之完成反定的时间，使之完成反应过程，自动化工作站应过程，自动化工作站可以严格控制温孵的温可以严格控制温孵的温度和时间；度和时间；检测：试验室自动化工检测：试验室自动化工作站一般都可以与某一作站一般都可以与某一种或多种检测仪器连接，种或多种检测仪器连接，在试验操作完成后，可在试验操作完成后，可以自动进行必要的检测以自动进行必要的检测并自动采集储存数据，并自动采集储存数据，完成整个试验过程。完成整个试验过程。目前，用于高通量药物筛选的仪器种类很多，其最大目前
24、，用于高通量药物筛选的仪器种类很多，其最大的特点是可以对各种不同规格微板中的样品直接进行的特点是可以对各种不同规格微板中的样品直接进行测定，如同位素放射活性的测定、化学发光测定、生测定，如同位素放射活性的测定、化学发光测定、生物发光测定、可见光比色、紫外光比色、荧光测定以物发光测定、可见光比色、紫外光比色、荧光测定以及电化学测定等等。及电化学测定等等。实验数据的分析处理系统是高通量筛选的必备条件。实验数据的分析处理系统是高通量筛选的必备条件。由于高通量药物筛选可以在短时间内产生大量数据，由于高通量药物筛选可以在短时间内产生大量数据，对这些数据的采集、储存、分析、处理，必须依靠计对这些数据的采集
25、、储存、分析、处理，必须依靠计算机完成。一般条件下，目前高通量药物筛选使用的算机完成。一般条件下，目前高通量药物筛选使用的检测仪器，基本上都实现了数据采集的自动化，结果检测仪器，基本上都实现了数据采集的自动化，结果检测完毕，试验结果就自动储存在计算机中。检测完毕，试验结果就自动储存在计算机中。一般来说，高通量筛选模型基本上可分为基于一般来说，高通量筛选模型基本上可分为基于靶点的筛选模型靶点的筛选模型(target-based assay)(target-based assay)(亦称亦称体外生化筛选模型体外生化筛选模型)、细胞水平筛选模型、细胞水平筛选模型(cell(cell based as
26、say)based assay)和胚胎水平的筛选模型和胚胎水平的筛选模型(embryo-(embryo-based assay)based assay)三类。三类。由于标记技术的发展由于标记技术的发展(如显色反应、荧光、化如显色反应、荧光、化学发光以及同位素标记等学发光以及同位素标记等)，对于细胞水平和，对于细胞水平和胚胎水平的筛选模型也可以通过直接观测表型胚胎水平的筛选模型也可以通过直接观测表型来分析功能分子对生物过程的影响。来分析功能分子对生物过程的影响。（1 1）体外生化筛选模型）体外生化筛选模型 体外生化筛选模型主要是用来研究与生物体内重要生体外生化筛选模型主要是用来研究与生物体内重要
27、生理过程相关的酶与底物、受体与拮抗剂或激动剂、蛋理过程相关的酶与底物、受体与拮抗剂或激动剂、蛋白质与蛋白质之间的相互作用（见第二节白质与蛋白质之间的相互作用（见第二节 相互作用与相互作用与分子识别），可以在体外通过蛋白结合能力或酶催化分子识别），可以在体外通过蛋白结合能力或酶催化活性检测的方式完成，主要采用光学如发光、光吸收活性检测的方式完成，主要采用光学如发光、光吸收或荧光测定的方法。这些靶点往往和某个疾病过程相或荧光测定的方法。这些靶点往往和某个疾病过程相关。关。这是这是HTSHTS中使用最多的模型。根据生物分子的类型，分中使用最多的模型。根据生物分子的类型，分子水平的药物筛选模型主要分为
28、受体、酶、通道、基子水平的药物筛选模型主要分为受体、酶、通道、基因和其他类型的模型，其特点是药物作用靶标明确，因和其他类型的模型，其特点是药物作用靶标明确，应用这些模型可以直接得到药物作用机理的信息。应用这些模型可以直接得到药物作用机理的信息。（2 2）细胞水平筛选模型）细胞水平筛选模型 细胞水平筛选模型主要用于研究涉及信号传导和转录调节细胞水平筛选模型主要用于研究涉及信号传导和转录调节过程中的相关靶点；由于该筛选体系与生物活性体系比较过程中的相关靶点；由于该筛选体系与生物活性体系比较接近，因此被广泛用于生物学和药物研究中。接近，因此被广泛用于生物学和药物研究中。细胞水平的筛选也可以根据研究方
29、向的不同选择微生物或细胞水平的筛选也可以根据研究方向的不同选择微生物或哺乳动物细胞，两者各有利弊。哺乳动物细胞，两者各有利弊。微生物系统，如酿酒酵母和大肠杆菌，具有廉价快速的特微生物系统，如酿酒酵母和大肠杆菌，具有廉价快速的特点，但是细胞的通透性不好，很多微生物还具有能将化合点，但是细胞的通透性不好，很多微生物还具有能将化合物有效泵出的系统，筛选时化合物往往难以接近靶点，从物有效泵出的系统，筛选时化合物往往难以接近靶点，从而造成假阴性，错过一些本来具有不错活性的小分子。而造成假阴性，错过一些本来具有不错活性的小分子。哺乳动物细胞通道性好，更接近真实的活体环境，但是价哺乳动物细胞通道性好，更接近
30、真实的活体环境，但是价格相对昂贵，也比不上微生物系统的快速。细胞水平的筛格相对昂贵，也比不上微生物系统的快速。细胞水平的筛选主要有细胞表型筛选、报告基因检测、细胞印记以及细选主要有细胞表型筛选、报告基因检测、细胞印记以及细胞增殖测定、细胞基础的生理测定和黑色素色素胞增殖测定、细胞基础的生理测定和黑色素色素-易位测易位测定等。定等。细胞表型筛选细胞表型筛选具有一定遗传型的生物个体，在特定的外界环境中，通过具有一定遗传型的生物个体，在特定的外界环境中，通过生长和发育所表现出的种种形态和生理特征的总和，是生生长和发育所表现出的种种形态和生理特征的总和，是生物体的可见特征或特性，即为其表型（物体的可见
31、特征或特性，即为其表型（phenotypephenotype）。相同）。相同遗传型的生物，在不同的外界条件下，会呈现不同的表型，遗传型的生物，在不同的外界条件下，会呈现不同的表型，但这不是真正的变异，因为在这种个体中，其遗传物质结但这不是真正的变异，因为在这种个体中，其遗传物质结构并未发生变化。构并未发生变化。显微镜检测技术可以检测细胞表型的变化，例如细胞形变、显微镜检测技术可以检测细胞表型的变化，例如细胞形变、增生、凋亡以及纺锤体形态。该模型是观察被筛样品对细增生、凋亡以及纺锤体形态。该模型是观察被筛样品对细胞的作用，但不能反映药物作用的具体途径和靶标，只能胞的作用，但不能反映药物作用的具体
32、途径和靶标，只能反映出药物对细胞生长等过程的综合作用，着眼于细胞整反映出药物对细胞生长等过程的综合作用，着眼于细胞整体的某些功能，所以这种检测方法主要适合于初步筛选。体的某些功能，所以这种检测方法主要适合于初步筛选。细胞外形上的变化细胞外形上的变化 inhibitors of SARS冠状病毒冠状病毒-CoV 细胞表型筛选需要通过各种显微镜观察细胞整体形态变细胞表型筛选需要通过各种显微镜观察细胞整体形态变化、细胞器以及细胞骨架的形态变化，这就需要用荧光化、细胞器以及细胞骨架的形态变化，这就需要用荧光染料分子对细胞和细胞内部的组分进行标记。小分子荧染料分子对细胞和细胞内部的组分进行标记。小分子荧
33、光探针已经称为化学生物学研究的不可缺少的工具，如光探针已经称为化学生物学研究的不可缺少的工具，如作为生物大分子的标记物、酶的底物、环境指示剂以及作为生物大分子的标记物、酶的底物、环境指示剂以及细胞成像剂等。细胞成像剂等。小分子荧光探针一般由两部分组成：荧光团以及与生物小分子荧光探针一般由两部分组成：荧光团以及与生物大分子（受体）专一性高亲和力结合的配体，通过受体大分子（受体）专一性高亲和力结合的配体，通过受体与配体的相互作用来标记蛋白质。与配体的相互作用来标记蛋白质。小分子荧光探针应该可以穿过细胞膜并且无毒；能够与小分子荧光探针应该可以穿过细胞膜并且无毒；能够与受体专一性稳定结合，使得其在进行
34、监测的较长时间受体专一性稳定结合，使得其在进行监测的较长时间(几几个小时个小时)内保持稳定性；背景噪音水平尽可能的低；探针内保持稳定性；背景噪音水平尽可能的低；探针尽可能地设计成一定的模式，使得多种荧光团能够方便尽可能地设计成一定的模式，使得多种荧光团能够方便地结合。选择合适的受体可以实现对蛋白质位点专一性地结合。选择合适的受体可以实现对蛋白质位点专一性结合。结合。作为荧光标记的试剂，分子中含有比较活泼的作为荧光标记的试剂，分子中含有比较活泼的官能团，这些基团易与蛋白质分子中的官能团，这些基团易与蛋白质分子中的NHNH2 2、OHOH、SHSH等共价结合，形成比较稳定的结合物。活性等共价结合，
35、形成比较稳定的结合物。活性基团主要包括以下基团：基团主要包括以下基团：对于受体的选择有以下两个要求：对于受体的选择有以下两个要求：(1)(1)受体与目受体与目标蛋白质融合后必须能够被基因表达；标蛋白质融合后必须能够被基因表达；(2)(2)受体受体应该尽可能小，以致不干扰目标蛋白质的正常应该尽可能小，以致不干扰目标蛋白质的正常生理功能，因此较理想的受体是一段短序列的生理功能，因此较理想的受体是一段短序列的肽链并且能够插入目标蛋白质的许多位点。肽链并且能够插入目标蛋白质的许多位点。一般说来，受体与配体的结合应当尽可能地快，一般说来，受体与配体的结合应当尽可能地快，有利于监测时间敏感性的生理过程。受
36、体有利于监测时间敏感性的生理过程。受体-配体配体的作用一般包括半抗原的作用一般包括半抗原-抗体抗体 生物素生物素-抗生物抗生物素蛋白、酶素蛋白、酶-底物、酶底物、酶-抑制剂、蛋白质专一性抑制剂、蛋白质专一性结合试剂等。结合试剂等。为了能够在荧光显微镜下观察细胞内部的形态结构，人为了能够在荧光显微镜下观察细胞内部的形态结构，人们利用一些与细胞内生物大分子专一性相互作用的小分们利用一些与细胞内生物大分子专一性相互作用的小分子化合物与不同类型的荧光染料偶联，设计合成了一系子化合物与不同类型的荧光染料偶联，设计合成了一系列细胞探针。列细胞探针。如核酸（或细胞核）探针（溴乙啶，吖啶橙、如核酸（或细胞核）
37、探针（溴乙啶，吖啶橙、Hoechst Hoechst 3325833258、DAPIDAPI等）细胞骨架探针（紫三醇荧光探针、毒伞等）细胞骨架探针（紫三醇荧光探针、毒伞素荧光探针等）、细胞器探针（细胞器标记酶底物探素荧光探针等）、细胞器探针（细胞器标记酶底物探针）、细胞膜探针（磷脂、鞘磷脂、胆固醇荧光探针）针）、细胞膜探针（磷脂、鞘磷脂、胆固醇荧光探针）以及某些特殊部位的蛋白质（与抗体偶联或与专一性结以及某些特殊部位的蛋白质（与抗体偶联或与专一性结合试剂偶联）探针。合试剂偶联）探针。荧光染料的种类很多，如荧光素类、罗丹明类、香豆素荧光染料的种类很多，如荧光素类、罗丹明类、香豆素类、二氟化硼类、
38、二氟化硼-二吡咯甲烷（二吡咯甲烷（BODIPY)BODIPY)类及乙锭类化合物。类及乙锭类化合物。不同类型的荧光探针具有不同的激发波长和发射波不同类型的荧光探针具有不同的激发波长和发射波长，从而在荧光显微镜下呈现出不同颜色的图像，长，从而在荧光显微镜下呈现出不同颜色的图像，可以容易地区分细胞的各个不同部位的形态变化。可以容易地区分细胞的各个不同部位的形态变化。报告基因报告基因(reporter gene)(reporter gene)由于转录因子和基因表达相关因子是药物作用的重要由于转录因子和基因表达相关因子是药物作用的重要靶标，从而出现了报告基因法。如果把靶基因表达的靶标，从而出现了报告基因
39、法。如果把靶基因表达的调控序列与编码某种酶活性的基因相连，转入细胞内，调控序列与编码某种酶活性的基因相连，转入细胞内，通过简单地检测酶活性的变化，就可以反映化合物对通过简单地检测酶活性的变化，就可以反映化合物对转录因子和基因表达的作用性质和程度，一般把这种转录因子和基因表达的作用性质和程度，一般把这种能间接反映基因转录水平的编码某种酶的基因称为基能间接反映基因转录水平的编码某种酶的基因称为基因报告法。因报告法。在应用时，首先确定构建模型所需的调控序列，然后在应用时，首先确定构建模型所需的调控序列，然后根据具体情况选择载体。应用最普遍的有荧光素酶基根据具体情况选择载体。应用最普遍的有荧光素酶基因
40、、因、-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因(-Cal)(-Cal)和氯霉素已酰转移酶和氯霉素已酰转移酶基因基因(CAT)(CAT)。报告基因方法报告基因方法目前活体细胞应用较多的报告基因是绿色荧光蛋白目前活体细胞应用较多的报告基因是绿色荧光蛋白(GFP)(GFP)，因其适于活体细胞检测，被称为生物传感蛋白。，因其适于活体细胞检测，被称为生物传感蛋白。它的优点是具有自发荧光，不需其他的底物和辅因子它的优点是具有自发荧光，不需其他的底物和辅因子且荧光稳定，另外且荧光稳定，另外GFPGFP与其他蛋白嵌合后不影响其自身与其他蛋白嵌合后不影响其自身荧光特性。荧光特性。GFPGFP及其变体作为报告基因适用于实时
41、动态研究体内或及其变体作为报告基因适用于实时动态研究体内或细胞水平的蛋白定位和转位，蛋白的降解，蛋白细胞水平的蛋白定位和转位，蛋白的降解，蛋白-蛋白蛋白的相互作用，细胞骨架动力学，细胞周期，并可检测的相互作用，细胞骨架动力学，细胞周期，并可检测目的基因表达变化。这类报告基因的表达可以在多种目的基因表达变化。这类报告基因的表达可以在多种组织和细胞中，采用不同光学检测方法通过对探针或组织和细胞中，采用不同光学检测方法通过对探针或化学发光底物的光学信号的检测，来进行靶标功能的化学发光底物的光学信号的检测，来进行靶标功能的研究。研究。细胞印迹（细胞印迹（CytoblotCytoblot）即高通量整体细
42、胞免疫检测（即高通量整体细胞免疫检测（high-high-throughput whole-cell immunodetection throughput whole-cell immunodetection assayassay技术技术3838，是在酶偶联免疫吸附测定，是在酶偶联免疫吸附测定（ELISAELISA）和免疫印迹（）和免疫印迹（western blottingwestern blotting）的基础上发展起来的。的基础上发展起来的。该方法用于快速检测小分子对该方法用于快速检测小分子对DNADNA合成、蛋白合成、蛋白质翻译后加工（乙酰化、磷酸化等）及细胞周质翻译后加工（乙酰化、磷酸
43、化等）及细胞周期等的影响，其基本原理与免疫印迹十分类似。期等的影响，其基本原理与免疫印迹十分类似。但是检测某一类细胞中的分子是在多孔培养板但是检测某一类细胞中的分子是在多孔培养板上的整体细胞水平进行的。上的整体细胞水平进行的。首先以待检测的分子作为抗原制备抗体，即一抗；然首先以待检测的分子作为抗原制备抗体，即一抗；然后选择合适的二抗进行检测，如采用连接有辣根过氧后选择合适的二抗进行检测，如采用连接有辣根过氧化物酶的二抗与一抗偶联，形成的复合物通过加入氨化物酶的二抗与一抗偶联，形成的复合物通过加入氨基苯二酰一肼（基苯二酰一肼（luminolluminol）、过氧化氢和对碘苯酚进行）、过氧化氢和对
44、碘苯酚进行检测，若细胞中有待检测的分子（即抗原存在，则引检测，若细胞中有待检测的分子（即抗原存在，则引发的化学发光反应使底片感光；如果不存在，则无发发的化学发光反应使底片感光；如果不存在，则无发光反应。光反应。其最大的优点是能够进行活性小分子的高通量快速筛其最大的优点是能够进行活性小分子的高通量快速筛选选,可以采用组织特异的细胞在纳升到毫升的规模培可以采用组织特异的细胞在纳升到毫升的规模培养。但该方法一般适合于初筛养。但该方法一般适合于初筛,要进一步明确所得小要进一步明确所得小分子的活性还需结合其他筛选方法。分子的活性还需结合其他筛选方法。(3)(3)胚胎水平筛选模型胚胎水平筛选模型 这类筛选
45、比细胞水平的筛选更接近活体环境，可这类筛选比细胞水平的筛选更接近活体环境，可以看做是对药物研发过程中动物试验的改进，比以看做是对药物研发过程中动物试验的改进，比较常用的是斑马鱼胚胎较常用的是斑马鱼胚胎(zebrafish embryo)(zebrafish embryo)和果和果蝇胚胎蝇胚胎(fruitfly embryo)(fruitfly embryo)等。由于传统的动物等。由于传统的动物试验所使用的动物体积相对较大，繁殖期也较长，试验所使用的动物体积相对较大，繁殖期也较长，难以实现高通量筛选的要求。难以实现高通量筛选的要求。斑马鱼斑马鱼斑马鱼斑马鱼(zebrafish)(zebrafis
46、h)是一是一种热带硬骨鱼，体积小种热带硬骨鱼，体积小(3-4cm)(3-4cm)，可在较小的空，可在较小的空间大量繁殖，产卵量高间大量繁殖，产卵量高(每周产卵可达每周产卵可达200200多个多个)；发育快，许多组织在受发育快，许多组织在受精后精后2424小时开始形成，小时开始形成，成熟周期短成熟周期短(3-4(3-4个月个月)；体外受精且胚胎透明，体外受精且胚胎透明，发育过程可在体视解剖发育过程可在体视解剖镜下观察。斑马鱼的这镜下观察。斑马鱼的这些特点使它适宜于作大些特点使它适宜于作大规模的突变筛选，是研规模的突变筛选，是研究基因功能和脊椎动物究基因功能和脊椎动物发育机制的重要手段。发育机制的
47、重要手段。斑马鱼与人类基因在引起相关疾病时的表型极为斑马鱼与人类基因在引起相关疾病时的表型极为相似，可将斑马鱼作为研究人类疾病的重要模式相似，可将斑马鱼作为研究人类疾病的重要模式生物体。所以，斑马鱼常常用于进行造血系统病生物体。所以，斑马鱼常常用于进行造血系统病理和生理功能的研究。理和生理功能的研究。线虫线虫为假体腔动物，有超过为假体腔动物，有超过28,00028,000个已被记录的物个已被记录的物种，尚有大量种尚未命名。绝大多数体小呈圆种，尚有大量种尚未命名。绝大多数体小呈圆柱形，又称圆虫（柱形，又称圆虫（roundwormsroundworms）。它们在淡水、）。它们在淡水、海水、陆地上随
48、处可见，不论是个体数或物种海水、陆地上随处可见，不论是个体数或物种数都往往超越其他动物，并在极端的环境如南数都往往超越其他动物，并在极端的环境如南极和海沟都可发现。极和海沟都可发现。线虫属两侧对称，体长，通常两端尖，并具透线虫属两侧对称，体长，通常两端尖，并具透明隔腔（消化道与体壁间充满液体的体腔）。明隔腔（消化道与体壁间充满液体的体腔）。一般为雌雄异体，有些则为雌雄同体一般为雌雄异体，有些则为雌雄同体(即个体即个体兼具雌雄生殖器官兼具雌雄生殖器官)。甘油醛-3-磷酸脱氢酶 酵母酵母是一种以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞酵母是一种以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核微生物真核微生物,在
49、我国已有在我国已有4 000 4 000 多年的应用历史。早多年的应用历史。早期对酵母的利用主要体现在酿造、食品和医药生产等期对酵母的利用主要体现在酿造、食品和医药生产等领域领域,利用酵母生产的核苷酸、核黄素、细胞色素、利用酵母生产的核苷酸、核黄素、细胞色素、维生素维生素D2D2以及辅酶以及辅酶A A 等药物曾为人类健康事业的发展等药物曾为人类健康事业的发展做出过巨大的贡献。作为一种单细胞真核生物做出过巨大的贡献。作为一种单细胞真核生物,酵母酵母繁殖速度快、培养周期短、基因操作相对简单以及研繁殖速度快、培养周期短、基因操作相对简单以及研究费用相对低廉究费用相对低廉,使得其成为现代生物医学研究中
50、的使得其成为现代生物医学研究中的一种模式生物一种模式生物,酿酒酵母酿酒酵母S1 cerevisiae S1 cerevisiae 作为第一个作为第一个完成全基因组序列分析的真核生物完成全基因组序列分析的真核生物,更是在生物医药更是在生物医药研究领域中得到了广泛的应用。研究领域中得到了广泛的应用。高内涵筛选高内涵筛选虽然目前已经形成了可日筛选虽然目前已经形成了可日筛选1010万样次的超高通量筛万样次的超高通量筛选技术。但是，高通量药物筛选技术的单靶点单指标选技术。但是，高通量药物筛选技术的单靶点单指标的筛选方法，已经不能适应药物发现的需要，而且也的筛选方法，已经不能适应药物发现的需要，而且也不利
