1、临床遗传学与临床遗传学与分子生物学实验诊断分子生物学实验诊断 clinical geneticsclinical genetics and and molecularmolecular d diagnosticsiagnostics南方医科大学第二临床医学院南方医科大学第二临床医学院临床检验诊断学教研室临床检验诊断学教研室彭永正彭永正2016.12.3012主要内容主要内容第一节第一节 染色体病检查染色体病检查第二节第二节 核酸和基因相关检验核酸和基因相关检验第三节第三节 产前诊断产前诊断第四节第四节 新生儿疾病筛查新生儿疾病筛查3基本要求基本要求1、掌握掌握 染色体数目异常性疾病染色体数目异
2、常性疾病，常用核酸分，常用核酸分子杂交技术的基本方法及原子杂交技术的基本方法及原理理，实时荧光，实时荧光PCRPCR技技术的原理及特点，术的原理及特点，唐氏综合征筛查项目唐氏综合征筛查项目及其临床及其临床意义。意义。2 2、熟悉熟悉 羊水检查的项目及其临床意义，新生儿羊水检查的项目及其临床意义，新生儿筛查的项目及其临床意义。筛查的项目及其临床意义。3 3、了解、了解 染色体结构异常性疾病及染色体不稳定染色体结构异常性疾病及染色体不稳定综合征。综合征。4基本概念基本概念 医学遗传学医学遗传学（medical geneticsmedical genetics）医学和遗传学相结合的一门医学和遗传学相
3、结合的一门边缘学科边缘学科，是遗传学知识在医学领域中的应用。，是遗传学知识在医学领域中的应用。医学遗传学不仅与生物学、生物化学、微生物及免疫学、药理医学遗传学不仅与生物学、生物化学、微生物及免疫学、药理学、卫生学等基础医学密切相关学、卫生学等基础医学密切相关,而且已经深入临床各学科之中。而且已经深入临床各学科之中。临床遗传学临床遗传学（clinical geneticsclinical genetics）研究临床各种研究临床各种遗传病的诊遗传病的诊断、产前诊断、预防、遗传咨询和治疗的学科。断、产前诊断、预防、遗传咨询和治疗的学科。5基本概念基本概念遗传性疾病：遗传性疾病：染色体病（染色体病（c
4、hromosomal diseasechromosomal disease）基因基因病（病（genic diseasegenic disease）绝大多数遗传性疾病的发生都与基因的改变密切相关。绝大多数遗传性疾病的发生都与基因的改变密切相关。诊断：从诊断：从基因水平找到相关证据基因水平找到相关证据。举例举例 唐氏综合征唐氏综合征 染色体病染色体病 地中海贫血地中海贫血 基因病基因病 遗传性乳腺癌遗传性乳腺癌卵巢癌综合征卵巢癌综合征 基因病基因病67Barts 水肿胎水肿胎 重型重型地贫血患儿的肝大、脾大和头颅变形（脾切除）地贫血患儿的肝大、脾大和头颅变形（脾切除）8BRCABRCA：遗传性乳腺
5、癌遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征卵巢癌综合征 约约5-6%5-6%的女性乳腺癌为遗传性的女性乳腺癌为遗传性。检测检测乳腺癌的乳腺癌的BRCA1/2BRCA1/2状态的意义状态的意义:有有BRCA1/2BRCA1/2突变病的家族应突变病的家族应进行进行BRCA1/2BRCA1/2基因突变的基因突变的筛查（筛查（血样本血样本）所有所有BRCA1/2BRCA1/2阳性家属都应阳性家属都应按按NCCNNCCN指南进行指南进行乳腺乳腺的全面检测的全面检测，预防性预防性化疗化疗（他莫昔芬）（他莫昔芬）或或预防性预防性手术（手术（乳腺切除乳腺切除）。携带者携带者有极高患有极高患乳腺癌（乳腺癌（45-65%45-
6、65%）和和卵巢癌卵巢癌（11-3911-39%）的风险！）的风险！9第一节第一节 染色体病检查染色体病检查 染色体病染色体病 染色体遗传病的简称。主要是细胞中遗传物质的主要染色体遗传病的简称。主要是细胞中遗传物质的主要载体载体染色体的数目或形态、结构异常染色体的数目或形态、结构异常引起的疾病。引起的疾病。分类：分类：常染色体病常染色体病 性染色体病性染色体病 常染色体病：常染色体异常引起，临床表现为先天性智力低下、常染色体病：常染色体异常引起，临床表现为先天性智力低下、发育滞后及多发畸形。如发育滞后及多发畸形。如 13-13-三体综合征三体综合征 性染色体病：性染色体异常引起，临床表现为性发
7、育不全、智力性染色体病：性染色体异常引起，临床表现为性发育不全、智力低下、多发畸形等。低下、多发畸形等。如如 4545，X X 综合征综合征 染色体异常的发生率：自然流产胎儿染色体异常的发生率：自然流产胎儿 20%50%20%50%新生儿新生儿 0.5%1%0.5%1%10一、染色体数目异常一、染色体数目异常（一）（一）唐氏综合征唐氏综合征 (Down Down syndrome,DSsyndrome,DS)1959)1959年年 法国法国又称又称 21-21-三体综合征、先天愚型、伸舌样痴呆等，是三体综合征、先天愚型、伸舌样痴呆等，是一种最常见一种最常见的染色体病的染色体病，也是，也是人类第
8、一个被确诊的染色体病人类第一个被确诊的染色体病。-智力低下、特殊面容、智力低下、特殊面容、残疾、学习障碍、残疾、学习障碍、掌纹异常等掌纹异常等。u完全型完全型21-21-三体三体u易易位型位型21-21-三体（三体（3%4%3%4%）u嵌合型嵌合型21-21-三体（三体（1%2%1%2%）11唐氏综合征唐氏综合征 患病概率：患病概率：与人种、生活水准等没有直接联系与人种、生活水准等没有直接联系，约，约每每600600个新生个新生儿中就有儿中就有1 1个患唐氏综合征。个患唐氏综合征。高龄初产妇高龄初产妇会会加剧婴儿加剧婴儿患唐氏综合征的患唐氏综合征的风险风险：随着产妇年龄增加：随着产妇年龄增加，
9、卵子形成过程中引起染色体不分离现象的概率增高。，卵子形成过程中引起染色体不分离现象的概率增高。妊娠期筛查：在妊娠期筛查：在妊娠早期和妊娠中期进行血清学筛查妊娠早期和妊娠中期进行血清学筛查 。如果诊断为高危，可以进行羊膜穿刺抽取羊水进行染色如果诊断为高危，可以进行羊膜穿刺抽取羊水进行染色体检查来确诊。体检查来确诊。羊水染色体检查结果报告方式：羊水染色体检查结果报告方式：47 47，XN,+21XN,+21 46,XN 46,XN （产前（产前诊断诊断，正常核型），正常核型）12羊水羊水 (Amnion Fluid)(Amnion Fluid)60年代后期发展起来，至今最常用的（产前）。年代后期发
10、展起来，至今最常用的（产前）。取样时间：取样时间：15周，常用周，常用16-25周。周。取样：取样：在超声的监控下，用细针穿入在超声的监控下，用细针穿入羊水池，抽取约羊水池，抽取约 20ml 羊水于羊水于无菌离心管无菌离心管。*无菌操作！无菌操作！尽快送实验室培养。尽快送实验室培养。13唐氏综合征患儿分型唐氏综合征患儿分型 1.完全型完全型 21-三体三体 47，XX（XY），），+21。占全部病例的。占全部病例的92%以上以上 发生机制：亲代（多数为母方）的生殖细胞染色体在减数分裂发生机制：亲代（多数为母方）的生殖细胞染色体在减数分裂时不分离所致。双亲外周血淋巴细胞核型都正常。时不分离所致。
11、双亲外周血淋巴细胞核型都正常。临床上不易与易位型区分。临床上不易与易位型区分。14儿科儿科Down Syndrome（Blood）核型：核型：47,XY,+2115细胞周期细胞周期 G1 phase S phase G2 phase M phase Cytokinesis -Interphase-Cell division-16核型分析核型分析 （Karyotyping)Karyotyping)G-400450条带17染色体结构，染色体结构，G-G-显带图例：显带图例：C 着丝粒着丝粒 p 短臂短臂S 随体随体 q 长臂长臂stk 随体柄随体柄18命名命名 与与 核型核型 -ISCN-ISCN
12、International System for Human Cytogenetic Nomenclature 46,XX or 46,XY 46,XN （产前，正常核型）（产前，正常核型）47,XY,+21 45,X 47,XXY19核型核型 cont.cont.46,XX,ins(1;?)(p22;?)Insertion 插入插入 46,XX,add(19)(p13)Addition 46,XX,del(7)(p11.2)Deletion 46,XX,inv(3)(q21;q26.2)Inversion 46,XY,der(1)t(1;10)(q44;q22)Derivative Tran
13、slocation 46,XY,dup(1)(q24q44)Duplication 46,X,i(X)(q10)Isochromosome20核型核型 cont.cont.45,XX,rob(14;21)(q10;q10)Robertsonian 45,XX,der(13;21)(q10;q10)（Chromosomes 13-15,21-22）45,XX,dic(13;13)(q14;q32)Dicentric 46,XX,r(7)(p22q36)Ring 47,XX,+mar Marker chr.其它：其它：16qh+Yqh-21ps+21pss mat(Maternal)pat(Pat
14、ernal)21唐氏综合征患儿分型唐氏综合征患儿分型 2.易位型易位型 21-三体三体 多为罗伯逊易位（多为罗伯逊易位（Robertsonian translocation）只发生在近端着丝粒染色体的一种相互易位，亦称着丝粒融合。只发生在近端着丝粒染色体的一种相互易位，亦称着丝粒融合。这类患者的细胞内除具有两条完整的这类患者的细胞内除具有两条完整的21号染色体外，号染色体外，还有一条由还有一条由21号染色体易位到另一条号染色体易位到另一条D组或组或G组染色体上而形成的易位染色组染色体上而形成的易位染色体。体。D组中组中以以14号染色体为主号染色体为主，核型，核型 46，XX（或（或XY），），
15、-14，+t（14q21q）；少数为）；少数为15号。号。这种易位型患儿这种易位型患儿约半数为遗传性约半数为遗传性，即亲代中有，即亲代中有14/21平衡易位携平衡易位携带者，核型为带者，核型为45，XX（或（或XY），），-14，-21，+t（14q21q）。）。另一种为另一种为G/G易位，是由于易位，是由于G组中两条组中两条21号染色体发生着丝粒融号染色体发生着丝粒融合，形成合，形成等臂染色体等臂染色体t（21q21q），），或一条或一条21号染色体易位到一号染色体易位到一条条22号染色体上，形成号染色体上，形成 t（21q22q），较少见。），较少见。22唐氏综合征患儿分型唐氏综合征患儿分
16、型 3.嵌合型嵌合型 21-三体三体 患儿患儿临床表现差异悬殊，视正常细胞所占的百分比而定临床表现差异悬殊，视正常细胞所占的百分比而定，可，可以从接近正常到典型表型。以从接近正常到典型表型。患儿体内患儿体内同时含有正常的二倍体细胞同时含有正常的二倍体细胞和和异常的异常的21-三体细胞三体细胞。发生机制发生机制：受精卵在早期分裂过程中染色体不分离引起。：受精卵在早期分裂过程中染色体不分离引起。23（二）其它染色体数目异常性疾病（二）其它染色体数目异常性疾病1.1.18-18-三体综合征三体综合征（Edwards syndromeEdwards syndrome）仅次于唐氏综合征的）仅次于唐氏综合
17、征的第第二种常见染色体三体征二种常见染色体三体征。19601960年首先报道，至今已有数百例报道。年首先报道，至今已有数百例报道。三体型：三体型：4747，XXXX（XYXY），），+18 +18 80%80%嵌合型：嵌合型：4646，XXXX（XYXY）/47/47，XXXX（XYXY），），+18 +18 20%20%2.2.1313三体综合征三体综合征 19601960年，年，PatauPatau首先描述。首先描述。新生儿中发病率：新生儿中发病率：1/25 0001/25 000，女性明显多于男性女性明显多于男性，患儿的，患儿的畸形畸形和临床表现要比和临床表现要比21-21-三体严重得多
18、。三体严重得多。染色体核型：多为单纯的染色体核型：多为单纯的13-13-三体型三体型 4747，4747，XXXX（XYXY），），+13+13。极。极少数为易位型和嵌合型。少数为易位型和嵌合型。24B-超异常超异常AF核型：47,XX,+1325常染色体数量异常常染色体数量异常 cont.cont.22-三体综合征三体综合征易位型、嵌合体易位型、嵌合体 先天性肛门闭锁等先天性肛门闭锁等26性染色体异常性染色体异常 cont cont.47,XXX 47,XXY 47,XYY 47，如，如 48,XXXX,49，XXXXX等，罕见等，罕见 嵌合体嵌合体 常见，对表型影响小常见，对表型影响小 4
19、6,XY 女性女性（？）（？）27二、染色体结构异常二、染色体结构异常（一）部分三体综合征（一）部分三体综合征（二）部分单体综合征（二）部分单体综合征（三）（三）9号染色体异常号染色体异常 -最常见的结构异常最常见的结构异常常被认为是常被认为是“染色体的多态染色体的多态”289号染色体的异常，不一定号染色体的异常，不一定有疾病表型。有疾病表型。可能出现的表型：可能出现的表型：特殊面容、脑瘫、先心病、特殊面容、脑瘫、先心病、运动机能失调。运动机能失调。29核型：核型：46,XY,inv(9)(p12q13),?der(9)(q13)脑瘫脑瘫30二、染色体结构异常二、染色体结构异常（一）部分三体综
20、合征（一）部分三体综合征 由于某一常染色体的某一片段有三份而由于某一常染色体的某一片段有三份而引起的染色体病，细胞染色体数是引起的染色体病，细胞染色体数是4646或或4747条。条。122122号染色体的号染色体的部分三体综合征都有报道。部分三体综合征都有报道。9 p9 p部分三体综合征，即在部分三体综合征，即在每一个体细胞中每一个体细胞中9 9号染色体短臂有三份号染色体短臂有三份的染色体病患者。的染色体病患者。常见特征为小头、宽眼距、性腺发育不良、长常见特征为小头、宽眼距、性腺发育不良、长手掌、短中指骨、小而发育不良的指甲、中度智力障碍、通贯手手掌、短中指骨、小而发育不良的指甲、中度智力障碍
21、、通贯手，少数患者在幼年死亡，多数能活到成年。，少数患者在幼年死亡，多数能活到成年。举例：举例：4747，XX,+9q-XX,+9q-3132（二）部分单体综合征（二）部分单体综合征 由于由于某一常染色体部分缺失而引起的染色体病某一常染色体部分缺失而引起的染色体病，细胞染色体数是细胞染色体数是4646条。条。核型：核型：4646，XXXX（XYXY），），5p-5p-。部分缺失可以是短臂部分缺失、长臂部分缺失或长短臂部分都有部分缺失可以是短臂部分缺失、长臂部分缺失或长短臂部分都有缺失而引起的环状染色体。缺失而引起的环状染色体。部分缺失种种虽然发生率不高，但缺失种类繁多，临床症状也远部分缺失种种
22、虽然发生率不高，但缺失种类繁多，临床症状也远比部分三体综合征严重，常于婴幼儿期夭折。比部分三体综合征严重，常于婴幼儿期夭折。5p-5p-综合征，又叫猫叫综合征综合征，又叫猫叫综合征，婴儿期哭声酷似猫叫，常伴有动，婴儿期哭声酷似猫叫，常伴有动脉导管未闭和免疫球蛋白缺乏。脉导管未闭和免疫球蛋白缺乏。33核型的解释：核型的解释：染色体的多态性染色体的多态性 (Polymorphism)(Polymorphism)染色体结构和着色强度存在非病理性差别，未发现多染色体结构和着色强度存在非病理性差别，未发现多态直接导致有害的遗传性状。态直接导致有害的遗传性状。常见的多态：常见的多态：1.1.异染色质区异染
23、色质区2.2.随体随体3.3.臂间倒位臂间倒位结论结论 1.G1.G显带数；显带数；2.2.培养方法；培养方法；3.3.培养时间培养时间异态（异态（Heteromorphism)34核型：核型：46,X,Yqh-,16qh+,21pstk+35三、三、染色体不稳定综合症染色体不稳定综合症 -DNA-DNA 复制或修复缺陷复制或修复缺陷 范科尼贫血范科尼贫血（Fanconi anaemia）较罕见，具有全血细胞减少、较罕见，具有全血细胞减少、骨髓再生障碍及伴有多发性畸形骨髓再生障碍及伴有多发性畸形三联征三联征。Bloom综合征综合征（Bloom syndrome）是一种典型的染色体断裂综合）是一
24、种典型的染色体断裂综合征，又称征，又称面部红斑侏儒综合征面部红斑侏儒综合征。患者皮肤对光敏感，手部与四肢。患者皮肤对光敏感，手部与四肢可见毛细管扩张性红斑。可见毛细管扩张性红斑。毛细血管扩张性共济失调症毛细血管扩张性共济失调症（Ataxia telangiectasia）本病的神经）本病的神经系统症状主要为小脑性共济失调，多数患者在系统症状主要为小脑性共济失调，多数患者在36岁出现皮肤毛岁出现皮肤毛细管扩张。细管扩张。上述三种综合征均为常染色体隐性遗传病。上述三种综合征均为常染色体隐性遗传病。36第二节第二节 核酸和基因相关检验核酸和基因相关检验 1.1.人类的绝大多数疾病都与基因密切相关。外
25、伤？人类的绝大多数疾病都与基因密切相关。外伤？2.2.基因的改变可以导致各种表型的改变，从而导致疾病基因的改变可以导致各种表型的改变，从而导致疾病发生。发生。3.3.疾病诊断：表型诊断疾病诊断：表型诊断基因诊断基因诊断 4.4.相关技术：分子生物学，分子遗传学相关技术：分子生物学，分子遗传学 5.5.直接检测基因结构及表达水平是否正常，从而对疾病直接检测基因结构及表达水平是否正常，从而对疾病做出准确地诊断。做出准确地诊断。6.6.精准医疗的核心问题：精准诊断。精准医疗的核心问题：精准诊断。37中心法则中心法则3839Personalized MedicinePersonalized Medic
26、ineGenomic medicineGenomic medicinePharmacogenetics/PharmacogenomicsPharmacogenetics/Pharmacogenomicsfor identifying:for identifying:5R5R the the right patient,right patient,right dose,right dose,right target,right target,right drug,right drug,right time.right time.40precision medicineMirnezami R,Ni
27、cholson J,Darzi A.Preparing for Precision Medicine.N Engl J Med 2012,366(6):489-491.Ultimately,precision medicine should ensure that patients get the right treatment at the right dose at the right time,with minimum ill consequences and maximum efficacy.An Informatics Research Roadmap to Facilitate A
28、n Informatics Research Roadmap to Facilitate Precision MedicinePrecision Medicine The intent of precision medicine is to integrate individual genetic data with existing health information to predict disease risk,develop prevention strategies,accurately establish disease course and tailor management
29、plans.Precision Medicine Initiative(PMI)Clinical Chemistry Sep 2016，62(9)1282-128341一、聚合酶链反应一、聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCRpolymerase chain reaction,PCR）由美国由美国Centus公司的公司的Kary Mullis发明，于发明，于1985年由年由Saiki等在等在Science杂志上首次报道，是杂志上首次报道，是一种体外快速扩增一种体外快速扩增DNA的技术的技术。1.PCR的基本原理和过程的基本原理和过程 PCR技术是在技术是在模板
30、模板DNA、引物引物和和4种脱氧单核苷酸种脱氧单核苷酸存在的条件下存在的条件下依赖于依赖于耐高温的耐高温的DNA聚合酶聚合酶的酶促合成反应。的酶促合成反应。PCR以待扩增的以待扩增的DNA做为模板，以和模板正链和负链末端互补的两种寡聚核苷酸做为模板，以和模板正链和负链末端互补的两种寡聚核苷酸做为引物，经过模板做为引物，经过模板DNA变性、模板引物复性结合、并在变性、模板引物复性结合、并在DNA聚聚合酶作用下发生引物链延伸反应来合成新的模板合酶作用下发生引物链延伸反应来合成新的模板DNA。模板模板DNA变性、退火、引物延伸合成变性、退火、引物延伸合成 DNA这三步构成一个这三步构成一个PCR循环
31、。循环。每一每一循环的循环的DNA产物经变性又成为下一个循环的模板产物经变性又成为下一个循环的模板 DNA。目的。目的DNA的数量将以的数量将以2n的形式累积，在的形式累积，在2小时内可扩增小时内可扩增30(n)个循环，个循环，DNA量达原来的上百万倍。量达原来的上百万倍。42PCR反应原理和反应过程4344（二）特点（二）特点 优点：优点：1.1.特异性强、灵敏度高、简便快速特异性强、灵敏度高、简便快速；2.2.可使用特定的低纯度标本可使用特定的低纯度标本，如人的组织、细胞、毛发、，如人的组织、细胞、毛发、血液、培养后的细菌和病毒等；血液、培养后的细菌和病毒等；3.3.为临床基因诊断为临床基
32、因诊断最为广泛应用最为广泛应用的技术之一。的技术之一。缺点缺点：特指普通：特指普通PCRPCR 1.1.只能定性只能定性，临床需要的定量结果无法满足；，临床需要的定量结果无法满足；2.PCR2.PCR产物采用电泳检测，易引起扩增产物的产物采用电泳检测，易引起扩增产物的交叉污染交叉污染，增加了增加了假阳性结果假阳性结果的可能性；的可能性；3.3.采用的采用的染色剂溴乙啶具有致癌性染色剂溴乙啶具有致癌性，可能危害工作人员及，可能危害工作人员及污染环境。污染环境。45（三）临床应用（三）临床应用 广泛应用于微生物学广泛应用于微生物学、医学及遗传学的分子克隆、序列分析、基因突、医学及遗传学的分子克隆、
33、序列分析、基因突变、遗传病、变、遗传病、传染病、传染病、血源筛查、法医学鉴定及考古等多种领域。血源筛查、法医学鉴定及考古等多种领域。PCRPCR及其相关技术在临床遗传学中得到广泛应用：及其相关技术在临床遗传学中得到广泛应用：1.PCR/RFLP(restriction fragment length polymorphism1.PCR/RFLP(restriction fragment length polymorphism，限制性，限制性片段长度多态性片段长度多态性)，PCR/SSP(sequence-specific primerPCR/SSP(sequence-specific prim
34、er，序列特异，序列特异性引物性引物)，PCR/SSCP(single-strand conformation PCR/SSCP(single-strand conformation polymorphism,polymorphism,单链构象多态性单链构象多态性)等技术可用于等技术可用于HLAHLA的基因分型的基因分型。2.2.用于某些遗传性疾病的诊断：用于某些遗传性疾病的诊断：镰状细胞贫血镰状细胞贫血 珠蛋白基因第珠蛋白基因第6 6位密位密码子发生单个碱基突变码子发生单个碱基突变 ATAT，谷氨酸被缬氨酸取代谷氨酸被缬氨酸取代所致，导致基因所致，导致基因内部内部一个一个 MstMst限制性
35、酶切位点丢失限制性酶切位点丢失，用，用PCR/RFLPPCR/RFLP技术，技术，可将患者、可将患者、突变携带者和正常人区别开来。突变携带者和正常人区别开来。46二、实时荧光二、实时荧光PCRPCR技术技术（一）原理（一）原理 基于荧光共振能量转移（基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance fluorescence resonance energy transferenergy transfer，FRETFRET）的原理。以）的原理。以TaqManTaqMan荧光标记探针荧光标记探针为基为基础的实时荧光础的实时荧光PCRPCR技术，在目前的临床诊断中技术，在目前的临床
36、诊断中应用最为广泛应用最为广泛。热稳定的热稳定的TaqTaq DNA DNA聚合酶不仅具有聚合酶不仅具有5533方向的聚合酶活性，方向的聚合酶活性，同时还具有同时还具有5 53 3核酸外切酶活性，可以切割聚合延伸过程中核酸外切酶活性，可以切割聚合延伸过程中遇到的与靶序列结合的寡核苷酸探针，利用遇到的与靶序列结合的寡核苷酸探针，利用TaqTaq酶的这一特性，酶的这一特性，可以检测靶序列的扩增。可以检测靶序列的扩增。47二、实时荧光二、实时荧光PCRPCR技术技术 TaqmanTaqman荧光探针是在其荧光探针是在其55端标记一个荧光报告基团端标记一个荧光报告基团，33端有端有一个淬灭剂。一个淬灭
37、剂。据荧光共振能量转移原理，完整的据荧光共振能量转移原理，完整的TaqmanTaqman荧光探针荧光探针因荧光基团和淬灭剂距离很近而使荧光基团发射出的荧光被淬灭因荧光基团和淬灭剂距离很近而使荧光基团发射出的荧光被淬灭，只有当探针被降解时，荧光报告基团和淬灭剂分离，这时荧光，只有当探针被降解时，荧光报告基团和淬灭剂分离，这时荧光才能发射出来。才能发射出来。荧光信号变量与扩增产物变量成正比，根据实时扩增曲线，可对荧光信号变量与扩增产物变量成正比，根据实时扩增曲线，可对原始模板定量。原始模板定量。CtCt值：指值：指荧光强度大于最小检测水平（即荧光阈值）时的荧光强度大于最小检测水平（即荧光阈值）时的
38、PCRPCR循循环数环数，它是获得准确且重现性好的数据的基础。为实时荧光，它是获得准确且重现性好的数据的基础。为实时荧光PCRPCR的基本参数。的基本参数。起始模板量越多，荧光信号显著高于背景信号所需的起始模板量越多，荧光信号显著高于背景信号所需的PCRPCR循环数循环数越少，即越少，即CtCt值越小；反之则越大。值越小；反之则越大。4849荧光定量标准曲线荧光定量标准曲线50（二）实时荧光（二）实时荧光PCRPCR的特点的特点 1.1.全封闭反应全封闭反应，无需扩增后处理，大大减少了扩增产物污染的可，无需扩增后处理，大大减少了扩增产物污染的可能性；能性；2.2.特异性强，灵敏度高；特异性强，
39、灵敏度高；3.3.采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确，重复性好；采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确，重复性好；4.4.定量范围宽，定量范围宽，可达到可达到1010个数量级；个数量级；5.5.仪器在线实时检测，结果直观，避免人为判断；仪器在线实时检测，结果直观，避免人为判断；6.6.可实现一管双检或多检可实现一管双检或多检；7.7.操作安全，简便快速；操作安全，简便快速；8.8.利用自动化和联网管理。利用自动化和联网管理。51（三）实时荧光（三）实时荧光PCRPCR的临床应用的临床应用 应用范围越来越广，如应用范围越来越广，如病原微生物的核酸定量病原微生物的核酸定量 mRNA mRNA表
40、达研究表达研究 等位基因的差异分析等位基因的差异分析 石蜡包埋组织的基因表达等。石蜡包埋组织的基因表达等。实时荧光实时荧光PCRPCR对实验室空间和人员操作的要求相对较低，对实验室空间和人员操作的要求相对较低，且易于定量，且易于定量，尤其适用于核酸分子的临床检测尤其适用于核酸分子的临床检测。52三、其它核酸与基因检测的基本技术三、其它核酸与基因检测的基本技术（一）限制性酶切（一）限制性酶切 限制性内切酶是限制性内切酶是存在于原核细胞存在于原核细胞中中能特异地识别双链能特异地识别双链DNA分子中分子中的特殊序列，并对其进行剪切的一类酶。的特殊序列，并对其进行剪切的一类酶。不同种类的生物体之间不同
41、种类的生物体之间DNA的碱基序列存在很大差异，同种生物的碱基序列存在很大差异，同种生物的不同个体之间的不同个体之间DNA的碱基序列也存在一定的差异。基因突变的碱基序列也存在一定的差异。基因突变 限制性片段长度多态性：染色体限制性片段长度多态性：染色体DNA上疾病基因座位的遗传标志上疾病基因座位的遗传标志 用途：连锁分析、基因定位和用途：连锁分析、基因定位和亲子鉴定亲子鉴定等。等。53三、其它核酸与基因检测的基本技术三、其它核酸与基因检测的基本技术（二）核酸分子杂交技术（二）核酸分子杂交技术 最经典的基因分析和基因检测方法。是指具有一定互补序列的两最经典的基因分析和基因检测方法。是指具有一定互补
42、序列的两种核酸单链在液相或固相体系中按种核酸单链在液相或固相体系中按碱基互补配对原则合成异质双碱基互补配对原则合成异质双链的过程。链的过程。杂交：杂交：DNADNA与与DNADNA，DNADNA与与RNARNA，RNARNA与与RNARNA之间进行，特定序列，可之间进行，特定序列，可定性或定量。定性或定量。1.1.印迹杂交法：印迹杂交法：SouthernSouthern杂交法杂交法检测检测DNADNA Northern Northern杂交法杂交法检测检测RNARNA 2.2.斑点杂交法：由斑点杂交法：由SouthernSouthern杂交法衍生而来杂交法衍生而来54三、其它核酸与基因检测的基
43、本技术三、其它核酸与基因检测的基本技术（三）凝胶电泳技术（三）凝胶电泳技术 分离、鉴定和纯化分离、鉴定和纯化DNADNA片段的最常用方法。片段的最常用方法。1.1.琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：DNADNA的分离范围较广的分离范围较广 （1 1）普通凝胶电泳普通凝胶电泳 200 bp20 kb200 bp20 kb的的DNADNA （2 2）脉冲场凝胶电泳）脉冲场凝胶电泳 数数kbkb数百数百kbkb 2.2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 能分离相差能分离相差1 1 bpbp的的DNADNA片段，分辨率高，片段，分辨率高，可适用于可适用于5bp500bp DNA5bp500bp DN
44、A片段。片段。55第三节第三节 产前筛查和产前诊断产前筛查和产前诊断 出生缺陷出生缺陷 严重危害人民的身体健康和生命。由于它的种类多、严重危害人民的身体健康和生命。由于它的种类多、发病率高，给社会带来的负担大，已成为医学难题之一。发病率高，给社会带来的负担大，已成为医学难题之一。遗传病遗传病 多数缺乏有效的治疗方法。可造成后代发病。多数缺乏有效的治疗方法。可造成后代发病。我国我国每年新增的出生缺陷每年新增的出生缺陷 120万。万。预防与治疗：预防与治疗：1.婚前检查婚前检查，孕前咨询，孕前咨询 2.产前诊断产前诊断 （超声，（超声，实验诊断实验诊断）3.出生后治疗出生后治疗 或或 宫内治疗宫内
45、治疗 56主要英语词汇主要英语词汇genetic disease(遗传病遗传病)Down syndrome（DS,唐氏综合征）唐氏综合征）neural tube defect(NTD,神经管畸形神经管畸形)multiple of median(MOM,中位数值的倍数中位数值的倍数)Pregnancy-associated plasma protein A (PAPP-A,妊娠相关血浆蛋白妊娠相关血浆蛋白A）noninvasive prenatal testing(NIPT,无创产前检测无创产前检测)thalassemia(地中海贫血地中海贫血)57产前诊断的概念和目的产前诊断的概念和目的 概念
46、概念 产前诊断是在遗传咨询的基础上，产前诊断是在遗传咨询的基础上，应用现代生物学、生物应用现代生物学、生物化学、免疫遗传学、细胞遗传学、分子遗传学技术化学、免疫遗传学、细胞遗传学、分子遗传学技术对胚胎和胎儿对胚胎和胎儿的直接检测的直接检测，或，或通过母体的检查，预测胎儿在子宫内的生长发育通过母体的检查，预测胎儿在子宫内的生长发育情况，诊断胎儿是否有遗传缺陷及先天畸形情况，诊断胎儿是否有遗传缺陷及先天畸形，以便早期发现，以便早期发现和处和处理。理。目的目的 通过对母体和胎儿的早期监测，及早预防和发现并发症，通过对母体和胎儿的早期监测，及早预防和发现并发症，减少不良影响。减少不良影响。58全全国首
47、例！广东实现国首例！广东实现不开刀给腹中胎儿做心脏手术不开刀给腹中胎儿做心脏手术 2016.10.142016.10.1459短暂的短暂的20分钟手术全程由超声影像定位操作分钟手术全程由超声影像定位操作此例此例“胎心术胎心术”，全球能施，全球能施行的不超过行的不超过1010家医院，不仅填家医院，不仅填补了我国胎儿心脏病宫内介入补了我国胎儿心脏病宫内介入治疗的空白，也标志着广东省治疗的空白，也标志着广东省人民医院人民医院心血管病研究所开创心血管病研究所开创了胎儿严重先天性心脏病治疗了胎儿严重先天性心脏病治疗新的里程碑。新的里程碑。甜杏仁大小甜杏仁大小穿刺路径：穿刺路径：孕肚孕肚子宫壁子宫壁羊膜腔
48、羊膜腔胎儿胸壁胎儿胸壁胎胎心右心室心右心室胎心肺动脉瓣胎心肺动脉瓣遗传咨询遗传咨询 genetic counsellinggenetic counselling由从事医学遗传的专业人员或咨询医师，对咨询由从事医学遗传的专业人员或咨询医师，对咨询者就其提出的家庭中遗传性疾病的发病原因、遗者就其提出的家庭中遗传性疾病的发病原因、遗传方式、诊断、预后、复发风险、防治等传方式、诊断、预后、复发风险、防治等问题予问题予以解答以解答，并就咨询者提出的婚育问题，并就咨询者提出的婚育问题提出医学建提出医学建议。议。遗传咨询是遗传咨询是预防遗传性疾病预防遗传性疾病十分重要的环节。十分重要的环节。60遗传咨询的对
49、象遗传咨询的对象遗传性疾病高风险人群遗传性疾病高风险人群 1.夫妇双方或家系成员患有某些遗传病或先天畸形者，曾生育过夫妇双方或家系成员患有某些遗传病或先天畸形者，曾生育过遗传病患儿或先天畸形儿的夫妇；遗传病患儿或先天畸形儿的夫妇；2.不明原因智力低下或先天畸形儿的父母；不明原因智力低下或先天畸形儿的父母；3.不明原因的反复流产或有死胎、死产等病史的夫妇；不明原因的反复流产或有死胎、死产等病史的夫妇；4.孕期接触不良环境因素及患有某些慢性病的夫妇；孕期接触不良环境因素及患有某些慢性病的夫妇；5.常规检查或常见遗传病筛查发现异常者；常规检查或常见遗传病筛查发现异常者；6.其它需要咨询者，如婚后多年
50、不育的夫妇，或其它需要咨询者，如婚后多年不育的夫妇，或35岁以上的高龄岁以上的高龄孕妇。孕妇。61遗传咨询必须遵循的原则遗传咨询必须遵循的原则1.尽可能收集证据原则：尽可能地获得正确的诊断尽可能收集证据原则：尽可能地获得正确的诊断2.非指令性原则非指令性原则：患者及其家属有选择权：患者及其家属有选择权3.尊重患者原则尊重患者原则：将咨询者本人的利益放在第一位：将咨询者本人的利益放在第一位4.知情同意原则知情同意原则：医师应本着科学、负责的态度，：医师应本着科学、负责的态度，告知真相告知真相5.守密和信任原则守密和信任原则：未经许可的情况下，决不能将：未经许可的情况下，决不能将遗传检查结果告知除
