1、单细胞精确操纵与基因组测序新方法在肿瘤防治中的应用研究立项依据及研究现状 临床需求：现有临床方法无法准确预测肿瘤转移超过50%的结直肠癌患者发生肝转移，未经治疗中位生存6.9个月三阴性乳腺癌90%的转移发生于术后3年内、中位生存不足一年同时性肝转移2025异时性肝转移 4050无肝转移 恶性肿瘤居我国死亡原因第一位远处转移是导致死亡的主要因素3肝转移淋巴结转移正常上皮原位癌浸润癌EMTMETTwistPrrx1TwistPrrx1血行转移淋巴转移CTC凋亡的CTCS-CTCCTMCTC：循环肿瘤细胞S-CTC：干细胞样循环肿瘤细胞CTM：循环肿瘤微栓存活的CTC立项依据及研究现状 S-CTC各
2、种CTC单细胞分离单细胞测序有转移无转移分子标志物立项依据及研究现状 4负性富集效率较低 假阳性高正性富集丢失细胞捕获不全立项依据及研究现状 技术问题 1：单一策略无法准确捕获CTC5立项依据及研究现状 技术问题 1：单一策略无法准确捕获CTC 解决方案：负性富集与正性富集相结合 6研究现状单细胞全基因组扩增技术微升级 解决方案：在微孔内进行扩增，大大增加扩增的均衡性 优势：可在微孔内连续进行单细胞的分离，鉴定，裂解和扩增技术问题 2：扩增的不均一性造成部分区域无法测到Streets A M et al.PNAS 2014;111:7048-7053纳升级均一性7 极高通量，大数据产出 高精确
3、度，错误率极低 需要样本的起始量低（100pg DNA）成本低，性价比高 定位完整基因组，可分析单倍体型联合探针锚定连接技术DNA纳米球芯片立项依据及研究现状 解决方案：采用新型CG测序技术技术问题 3：现有测序技术成本高，准确率有待提高8项目设计试剂盒乳腺癌微流控单细胞技术 循环肿瘤细胞分离、捕获和测序新方法 筛选肿瘤转移标志物CTC异质性与 肿瘤转移微孔原位扩增技术CG测序平台结直肠癌 多中心前瞻性临床验证9总技术路线（一）单细胞分离鉴定原发灶转移灶结肠癌肝转移晚期三阴性乳腺癌原发灶、转移灶单细胞CTC或S-CTC微流控捕获芯片正性筛选多肽识别探针负性筛选外周全血单细胞的富集和鉴定10单细
4、胞测序分析总技术路线（二）单细胞DNA或RNA单细胞全外显子组、转录组测序：CG测序数据整合分析：CGA Tools等转移相关标志谱原位PCR扩增DNB文库制备单细胞全基因组扩增和测序11总技术路线（三）转移标志谱前瞻性验证II期结肠癌三阴性乳腺癌功能研究转移相关标记物验证诊断试剂盒研发生存曲线ROC曲线候选预警标志物的前瞻性验证12预期目标目标目标1 建立外周血循环肿瘤细胞、癌症组织中肿瘤干细胞、实体肿瘤中微小转移灶细胞的分离、捕获、鉴定、回收技术平台，准确率超过95%。目标目标2 建立单细胞测序平台，优化循环肿瘤细胞、肿瘤干细胞等单细胞全基因组测序、全外显子测序及转录组测序技术。目标目标3
5、 发现一批与发生结直肠癌肝转移相关的预警分子标志物，并通过多中心前瞻性临床研究加以验证。目标目标4 发现一批与三阴性乳腺癌早期转移相关的预警分子标志物，并通过多中心前瞻性临床研究加以验证。13拟解决技术难点识别探针的设计、优化和组装单细胞微流控芯片的设计和加工单细胞扩增的均一性单细胞测序技术的准确率14创新点负性、正性富集相结合微流控技术实现单细胞精确操纵微孔原位扩增技术，提高扩增均一性单细胞分离、操纵单细胞DNA扩增CG测序平台研究策略极微量起始，大幅降低错误率，降低成本基于临床问题，整合最新技术建立解决方案，应用于临床15工作基础及可行性分析样本癌种 多肽/MNP(/7.5mL)CellS
6、earch（/7.5mL）1乳腺癌012乳腺癌52.5393乳腺癌3514乳腺癌22.5395乳腺癌62.406乳腺癌112.507肺癌87.508肺癌00RecognitionMNPs MCF7 cell EpCAM EpCAM-targeting peptide De novo designed peptide pool 王琛等，王琛等，专利申请专利申请 201310013908.1Bai LL,et al.J.Mater.Chem.B 2014,in pressNuclearCD45CytokeratinBlood CellCancer Cell 工作基础1（纳米中心团队）：基于多肽探针
7、的CTC富集及检测 CTC富集及检测集成细胞形态学表面标志染色体倍体分析等多维鉴定技术的外周血CTC检测新方法。工作基础及可行性分析 工作基础2（肿瘤医院团队）：CTC多维鉴定技术 微孔芯片实物图和电镜照片硅基单细胞操纵芯片的设计图硅基单细胞操纵芯片的设计图(Hu Z.et al.Lab Chip.2013)(Hu Z.et al.Anal.Chem.2014)魏泽文，胡志远，“一种单细胞分析用微流控芯片和系统及单细胞分析方法”申请号：201410141283.1王蔚芝，李梦林，魏泽文，胡志远，“一种微腔阵列质谱靶板及其制作方法和应用”，申请号：201410100307.9工作基础及可行性分析
8、 工作基础3（纳米中心团队）：微流控单细胞芯片 18p已建立基于多重置换扩增（MDA）的单细胞测序方法p整合和优化CG测序技术，实现在多种平台上的基因组学研究19工作基础及可行性分析 工作基础4（华大团队）：单细胞测序平台的开发及应用 工作基础及可行性分析 工作基础5（肿瘤医院团队）：结肠癌肝转移多部位单细胞测序 发现肿瘤细胞发展过程中基因拷贝数变异和点突变产生的时序关系，绘制结肠癌发生转移过程中的分子学演化模型201.TNBC中含有更高比例的CSC乳腺癌组织例数ALDH1+表达N%P 值TNBCLuminal ALuminal B HER2+253316271123944.06.118.83
9、3.30.0032.CSC影响了TNBC的转移与生存工作基础及可行性分析 工作基础6（肿瘤医院团队）：三阴性乳腺癌干细胞研究 211.TNBC的CTC存在显著异质性1.白细胞；2.CTC（上皮表型）；3.CTC（间质表型）；4.CTC（混合表型）1.CTM（上皮表型）；2.CTM（间质表型）；3.CTM（混合表型）2.存在少量循环肿瘤细胞团工作基础及可行性分析 工作基础7（肿瘤医院团队）：三阴性乳腺癌CTC异质性研究 22团队优势医科院肿瘤医院国家纳米科学中心华大基因研究院军事医学科学院辽宁省肿瘤医院浙江省人民医院科研优势技术优势临床优势23课题预算24预算科目名称预算科目名称合计合计专项经费
10、专项经费 一、经费支出一、经费支出500.0500.0（一）直接费用（一）直接费用438.0428.0 1、设备费、设备费72.1468.0（1）购置设备费）购置设备费65.1461.0（2）试制设备费）试制设备费7.07.0 2、材料费、材料费7543.48 3、测试化验加工费、测试化验加工费222.56242.22 4、燃料动力费、燃料动力费410.0 5、差旅费、差旅费5.85.8 6、会议费、会议费 3.03.0 7、国际合作与交流费、国际合作与交流费8.08.0 8、出版、出版/文献文献/信息传播信息传播/知识产权事务费知识产权事务费3.53.5 9、劳务费、劳务费34.034.0
11、10、专家咨询费、专家咨询费10.010.0（二）间接费用（二）间接费用62.072.0 其中：绩效支出其中：绩效支出18.018.0 二、经费来源二、经费来源 1、申请从专项经费获得的资助、申请从专项经费获得的资助500.0500.0 主要考核指标 1-2项单细胞操控新方法及试剂盒、芯片检测检测技术技术 结直肠癌肝转移及乳腺癌标志物各1-2个标记谱标记谱 国内发明专利2-3项专利专利 高水平SCI论文2-5篇，国际学术报告3-5 次文章文章25课题年度计划及指标26年度计划 单细胞分离、捕获、鉴定技术平台的建立和优化 单细胞测序技术的优化 开始用于转移预警标志物筛选的单细胞测序分析 收集用于验证的结直肠癌和乳腺癌标本考核指标 完成2-4例结直肠癌和乳腺癌测序 申请1项专利 收集50例用于验证的结直肠癌和乳腺癌标本2015年课题年度计划及指标27年度计划 用于转移预警标志物筛选的单细胞测序分析 收集用于验证的结直肠癌和乳腺癌标本 任务指标考核指标 完成用于转移预警标志物筛选的剩余病例测序 申请1项专利 完成收集用于验证的结直肠癌和乳腺癌标本2016年课题年度计划及指标28年度计划 候选转移预警分子标志物的验证 撰写文章 结题工作考核指标 对用于验证的100例病例完成靶向测序验证 文章撰写及发表2017年
