1、第十二章第十二章 免疫组织化学技术免疫组织化学技术第1页，共63页。免疫组织化学技术（免疫组织化学技术（immunohistochemistry technique）又称）又称免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术，是指用，是指用标记的特异性标记的特异性抗体抗体在组织细胞在组织细胞原位原位通过抗原抗体反应和组织化学的通过抗原抗体反应和组织化学的呈色呈色反应，反应，对相应抗原进行对相应抗原进行定性、定位、定量定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。测定的一项免疫检测方法。概概 念念第2页，共63页。第一节第一节 免疫组织化学技术概述免疫组织化学技术概述根据标记物的不同分类：根据标记物的不同分类：荧光免
2、疫组织化学技术荧光免疫组织化学技术 酶免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术 免疫金（银）组织化学技术免疫金（银）组织化学技术 亲和组织化学技术亲和组织化学技术 免疫电镜组织化学技术免疫电镜组织化学技术第3页，共63页。第4页，共63页。第一节第一节 免疫组织化学技术概述免疫组织化学技术概述免疫组织化学的基本过程包括：免疫组织化学的基本过程包括：1.1.抗原的提取与纯化；抗原的提取与纯化；2.2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；的纯化；3.3.将标记物与抗体结合形成标记抗体；将标记物与抗体结合形成标记抗体；4.4.标本的处理与制备；标本的
3、处理与制备；5.5.抗原抗体免疫学反应以及标记物呈色反应；抗原抗体免疫学反应以及标记物呈色反应；6.6.观察结果。观察结果。第5页，共63页。标本的主要来源标本的主要来源 活体组织活体组织各种体液及穿刺液各种体液及穿刺液培养细胞培养细胞一、标一、标 本本 的的 处处 理理第6页，共63页。组织切片技术组织切片技术石蜡切片：石蜡切片：对组织结构形态保存好，对组织结构形态保存好，是观察组织和细胞结构的是观察组织和细胞结构的理想方法，可以用于回顾性研究，但对抗原的保存不如冰冻切片。理想方法，可以用于回顾性研究，但对抗原的保存不如冰冻切片。冰冻切片：冰冻切片：能避免石蜡切片应固定、脱水、浸蜡等对抗原的
4、能避免石蜡切片应固定、脱水、浸蜡等对抗原的损失，较好的损失，较好的保保存组织抗原的免疫活性，适用于不稳定的抗原。存组织抗原的免疫活性，适用于不稳定的抗原。第7页，共63页。标本的固定标本的固定良好的固定是免疫组织化学结果可靠的重要保证良好的固定是免疫组织化学结果可靠的重要保证 固定目的：固定目的：凝固蛋白，终止细胞内酶的作用，防止细胞自溶，保持细胞形态和凝固蛋白，终止细胞内酶的作用，防止细胞自溶，保持细胞形态和结构结构保持组织细胞的抗原性保持组织细胞的抗原性防止组织或细胞脱落防止组织或细胞脱落去除细胞内妨碍抗体结合的类脂，便于保存去除细胞内妨碍抗体结合的类脂，便于保存防腐防腐第8页，共63页。
5、固定的原则：固定的原则：不损伤组织细胞的固有形态、结构、抗原性不损伤组织细胞的固有形态、结构、抗原性和细胞膜的通透性；不干扰固定后的抗原与抗体的识别与结和细胞膜的通透性；不干扰固定后的抗原与抗体的识别与结合合 固定剂的选择：固定剂的选择：所有的标本固定必须根据其性质及所进所有的标本固定必须根据其性质及所进行的组织化学反应选择适当的固定剂行的组织化学反应选择适当的固定剂 第9页，共63页。各种抗原的固定各种抗原的固定抗原抗原固定剂或处理方法固定剂或处理方法蛋白质蛋白质乙醇、甲醇乙醇、甲醇微生物微生物丙酮、三氯化碳丙酮、三氯化碳病毒外壳病毒外壳胰蛋白酶胰蛋白酶多糖多糖10%10%甲醛或微火加热甲醛
6、或微火加热黏液物质黏液物质透明质酸酶透明质酸酶类脂质类脂质乙醚、丙酮乙醚、丙酮第10页，共63页。二、抗二、抗 原原 的的 保保 存存 与与 修修 复复抗原修复抗原修复:使在制片过程中被遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的过程使在制片过程中被遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的过程。常用的方法：常用的方法：酶消化法：酶消化法：无花果酶（轻度）、胰蛋白酶（中度）和胃蛋白酶（强）无花果酶（轻度）、胰蛋白酶（中度）和胃蛋白酶（强）盐酸水解法盐酸水解法：注意浓度、温度和时间注意浓度、温度和时间 微波法微波法：微波是一种高频电磁波，可以打开蛋白质微波是一种高频电磁波，可以打开蛋白质 之间的交联键，从而之间的交联键，
7、从而使抗原修复。使抗原修复。高压锅法、煮沸法高压锅法、煮沸法：高温可以使某些已经封闭的抗原表位得以重新暴露高温可以使某些已经封闭的抗原表位得以重新暴露和修复。和修复。第11页，共63页。三、抗三、抗 体体 的的 处处 理理 与与 保保 存存抗体的选择抗体的选择注意选择具有注意选择具有高特异性、稳定高特异性、稳定的优质抗体的优质抗体多克隆抗体：多克隆抗体：敏感性较高、特异性相对较低敏感性较高、特异性相对较低单克隆抗体：单克隆抗体：特异性较高、敏感性相对较低特异性较高、敏感性相对较低第12页，共63页。抗体的稀释抗体的稀释抗原抗体反应要比例合适才能达到预期效果抗原抗体反应要比例合适才能达到预期效果
8、使用前根据预实验结果得出抗体的最佳稀释度使用前根据预实验结果得出抗体的最佳稀释度第13页，共63页。抗体的保存抗体的保存分装密封保存，避免对抗体的污染分装密封保存，避免对抗体的污染并注明标记（批号、名称、效价、量）并注明标记（批号、名称、效价、量）根据厂家提供的保存条件保存根据厂家提供的保存条件保存避免反复冻融而使抗体效价降低避免反复冻融而使抗体效价降低第14页，共63页。四、结四、结 果果 判判 断断对照实验：对照实验：阳性对照：阳性对照：选择含已有抗原的标本选择含已有抗原的标本(证明整个显色程序正确，尤其待检标本呈阴性结果时证明整个显色程序正确，尤其待检标本呈阴性结果时更为重要）更为重要）
9、阴性对照：阴性对照：选择不含已知抗原的标本（排除假阳性）选择不含已知抗原的标本（排除假阳性）确证实验：确证实验：空白实验：空白实验：PBSPBS（排除内源性酶）（排除内源性酶）替代试验：替代试验：与待测抗原的同种动物非免疫血清（证明阳性反应不是由异嗜性抗原引起的非特与待测抗原的同种动物非免疫血清（证明阳性反应不是由异嗜性抗原引起的非特异性反应）异性反应）吸收或阻断试验：吸收或阻断试验：用过量已知抗原（可溶性）与特异性抗体反应，已知阳性的标用过量已知抗原（可溶性）与特异性抗体反应，已知阳性的标本应呈阴性或弱阳性（证明免疫组化的阳性结果是与天然抗原相同的抗原抗体反本应呈阴性或弱阳性（证明免疫组化的
10、阳性结果是与天然抗原相同的抗原抗体反应。）应。）第15页，共63页。阴性对照阳性对照吸收实验PBS替代实验待测组第16页，共63页。阳性细胞显色分布类型阳性细胞显色分布类型 细胞质细胞质 细胞核细胞核 细胞膜表面细胞膜表面阳性细胞显色：抗原分布于细胞核阳性细胞显色：抗原分布于细胞核 阳性显色深浅反映抗原存在阳性显色深浅反映抗原存在的数量的数量 定性的依据定性的依据 定位的依据定位的依据 定量的依据定量的依据第17页，共63页。阳性细胞分布可呈阳性细胞分布可呈 散在分布散在分布 灶性分布灶性分布 弥漫性分布弥漫性分布阳性细胞呈灶性分布阳性细胞呈灶性分布第18页，共63页。阴性结果及抗原不表达阴性
11、结果及抗原不表达阴性结果阴性结果:不能简单认为具有否定意义，因为阳性表达不能简单认为具有否定意义，因为阳性表达有强弱、多少之分，有强弱、多少之分，哪怕只有少数细胞阳性（只要是在抗原所在部位）也要视哪怕只有少数细胞阳性（只要是在抗原所在部位）也要视为阳性表达为阳性表达不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待。第19页，共63页。特异性染色与非特异性染色特异性染色与非特异性染色特异性染色特异性染色非特异性染色非特异性染色分布在特定的部位分布在特定的部位,具结构性具结构性无分布规律，常出现在切片边缘、刀痕无分布规律，常出现在切片边缘、刀痕或皱折部位及坏死或挤压的细胞区域或
12、皱折部位及坏死或挤压的细胞区域 由于细胞内抗原含量不同，所以显色不由于细胞内抗原含量不同，所以显色不均一均一不限于单个细胞，而是累及一片细胞，不限于单个细胞，而是累及一片细胞，均匀显色均匀显色阳性与阴性细胞相互交杂，同一切片上阳性与阴性细胞相互交杂，同一切片上显色强度不一显色强度不一细胞和周围的结缔组织均无区别的着色细胞和周围的结缔组织均无区别的着色第20页，共63页。免疫组化结果与免疫组化结果与HEHE染色结果染色结果 当免疫组化诊断结果与当免疫组化诊断结果与HEHE切片诊断不一致时切片诊断不一致时,应再结应再结合临床资料，如性别、年龄、部位、合临床资料，如性别、年龄、部位、X X线等影像学
13、及实验线等影像学及实验室结果综合分析室结果综合分析,不能简单地推翻不能简单地推翻HEHE切片诊断。切片诊断。第21页，共63页。五、质五、质 量量 控控 制制 抗体特异性、敏感性测试抗体特异性、敏感性测试 抗体最佳稀释度的选择抗体最佳稀释度的选择 稀释剂稀释剂 孵育温度、时间孵育温度、时间非特异性染色：非特异性染色：缩短一抗缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制，这是最重要的一条。二抗孵育时间、稀释抗体来控制，这是最重要的一条。一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。试剂的质量控制试剂的质量控制第22页，共63页。
14、操作过程质量控制操作过程质量控制操作：操作：步骤是否正确规范；每日之间、操作步骤是否正确规范；每日之间、操作 人员之间的变异；试剂复溶、状态是否良好人员之间的变异；试剂复溶、状态是否良好标本：标本：阴性、阳性或自身组织对照三种类型阴性、阳性或自身组织对照三种类型 质控品，可用于监控标本制备、操作过程、质控品，可用于监控标本制备、操作过程、染色步骤、试剂质量等问题引起的误差染色步骤、试剂质量等问题引起的误差第23页，共63页。仪器的质量控制仪器的质量控制相关技术设备、仪器和器具定期校对、消毒相关技术设备、仪器和器具定期校对、消毒第24页，共63页。第二节第二节 酶免疫组织化学技术酶免疫组织化学技
15、术定义定义:用用酶标抗体酶标抗体(抗原抗原)与组织或细胞标本中的抗原与组织或细胞标本中的抗原(抗体抗体)发生反发生反应，催化底物产生显色反应，通过显微镜观察标本中抗原应，催化底物产生显色反应，通过显微镜观察标本中抗原(抗体抗体)的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。第25页，共63页。一、组织处理一、组织处理 常用的标本有组织切片、组织印片和细胞涂片等，其固常用的标本有组织切片、组织印片和细胞涂片等，其固定及标本制作方法见第一、二节。与荧光免疫技术相比，酶定及标本制作方法见第一、二节。与荧光免疫技术相比，酶免疫组织化学技术具
16、有染色标本可免疫组织化学技术具有染色标本可长期保存长期保存，可用可用普通光镜观普通光镜观察结果察结果，可观察组织细胞的细微结构等优点。，可观察组织细胞的细微结构等优点。第26页，共63页。二、酶标记抗体免疫组化染色二、酶标记抗体免疫组化染色定义定义:借助交联剂共价键将借助交联剂共价键将酶直接连接在抗体酶直接连接在抗体上，酶标抗体上，酶标抗体与靶抗原反应后，再通过对底物的特异性催化作用，生成与靶抗原反应后，再通过对底物的特异性催化作用，生成不溶不溶性性有色产物，达到对抗原定性、定量、定位检测的目的。有色产物，达到对抗原定性、定量、定位检测的目的。常用的方法常用的方法:直接法、间接法直接法、间接法
17、第27页，共63页。三、非标记抗体酶免疫组化染色三、非标记抗体酶免疫组化染色特点特点:用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体抗酶抗体酶通过免疫学反应与抗酶抗体及组织抗原上的抗体结合，酶通过免疫学反应与抗酶抗体及组织抗原上的抗体结合，最后经酶分子催化底物的显色反应，达到对抗原的检测最后经酶分子催化底物的显色反应，达到对抗原的检测避免了酶标记抗体对抗体的损伤，避免了酶标记抗体对抗体的损伤，提高了方法的敏感性提高了方法的敏感性第28页，共63页。酶桥法：酶桥法：抗酶抗体作为第三抗体抗酶抗体作为第三抗体，通过第二抗体作桥抗体，将，通过第二抗体作桥抗体，将结合在
18、组织抗原上的第一抗体与第三抗体连接起来，最后形成结合在组织抗原上的第一抗体与第三抗体连接起来，最后形成酶联的抗原酶联的抗原-抗体复合物，加底物显色抗体复合物，加底物显色+HRPHRP底物底物二抗二抗/Ab2/Ab2兔源一抗兔源一抗/Ab1/Ab1Ag兔源抗酶抗体兔源抗酶抗体/Ab3/Ab3Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRPAg-Ab1-Ab2-Ab3-HRP复合物复合物AgAgAgAg第29页，共63页。优点：优点：敏感性较酶标法有所提高敏感性较酶标法有所提高 缺点：缺点：操作分四步，较复杂操作分四步，较复杂 如果抗酶抗体与酶结合弱，在操作中酶常被冲洗掉如果抗酶抗体与酶结合弱，在操作中酶常被
19、冲洗掉 如果酶标记在非特异性抗体上会存在背景着色问题如果酶标记在非特异性抗体上会存在背景着色问题 如果抗酶抗体的非特异性成分与桥抗结合，结果就与抗如果抗酶抗体的非特异性成分与桥抗结合，结果就与抗 酶抗体竞争桥抗的结合位点，也会影响方法的敏感性酶抗体竞争桥抗的结合位点，也会影响方法的敏感性 第30页，共63页。PAPPAP法：法：是酶桥法的改良法。是酶桥法的改良法。PAPPAP法将酶桥法的第三抗体（抗酶抗法将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶形成一种稳定可溶性体）与酶形成一种稳定可溶性(PAPPAP复合物复合物)+底物底物二抗二抗/Ab2/Ab2兔源一抗兔源一抗/Ab1/Ab1Ag兔源兔源PAPP
20、AP复合物复合物AgAgAgAg-Ab1-Ab2-PAPAg-Ab1-Ab2-PAP复合物复合物第31页，共63页。操作只需三步操作只需三步PAPPAP复合物稳定，酶不易洗脱，避免了酶桥法的弊端复合物稳定，酶不易洗脱，避免了酶桥法的弊端敏感性高敏感性高背景着色淡背景着色淡 即使桥连抗体存在有非特异性抗体，因其与第一抗体并非同种属，故不能即使桥连抗体存在有非特异性抗体，因其与第一抗体并非同种属，故不能与抗酶抗体结合与抗酶抗体结合 如果抗酶抗体中存在的非抗酶抗体，虽可与组织成分结合，但此抗体不如果抗酶抗体中存在的非抗酶抗体，虽可与组织成分结合，但此抗体不能与酶结合，不会有酶活性。能与酶结合，不会有
21、酶活性。第32页，共63页。双桥双桥PAPPAP法：法：是在是在PAPPAP法中通过两次连接桥抗体和法中通过两次连接桥抗体和PAPPAP而建立起来的，通过双桥可而建立起来的，通过双桥可结合更多的结合更多的PAPPAP复合物于抗原分子上，以复合物于抗原分子上，以增强敏感性增强敏感性。这种放大方式重复。这种放大方式重复使用桥抗体，使桥抗与使用桥抗体，使桥抗与PAPPAP复合物中的抗酶抗体未充分饱和的复合物中的抗酶抗体未充分饱和的FcFc段结合，段结合，或桥抗体与特异性一抗尚未饱和的或桥抗体与特异性一抗尚未饱和的FcFc段结合。对抗原有明显放大作用，对段结合。对抗原有明显放大作用，对于组织细胞于组织
22、细胞微量抗原微量抗原的检测有实用价值。的检测有实用价值。第33页，共63页。APAAP法：法：有些组织细胞富含内源性过氧化物酶，染色时就不宜使有些组织细胞富含内源性过氧化物酶，染色时就不宜使用用HRPHRP体系。用碱性磷酸酶代替体系。用碱性磷酸酶代替HRPHRP建立的碱性磷酸酶建立的碱性磷酸酶(AP)-(AP)-抗碱性抗碱性磷酶磷酶(AAP)(AAP)法，简称法，简称APAAPAPAAP法法如淋巴组织和肿瘤组织中含如淋巴组织和肿瘤组织中含HRPHRP高，可以高，可以APAP代替。代替。+底物底物二抗二抗/Ab2/Ab2兔源一抗兔源一抗/Ab1/Ab1Ag兔源兔源APAAPAPAAP复合物复合物
23、AgAgAgAg-Ab1-Ab2-APAAPAg-Ab1-Ab2-APAAP复合物复合物第34页，共63页。四、酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物四、酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物常用种类常用种类:辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶/HRP/HRP底物显色（底物显色（DABDAB)棕色或棕色或(AEC)(AEC)橘红色橘红色 最常用最常用 碱性磷酸酶碱性磷酸酶/AP/AP 底物显色红色底物显色红色(-(-萘酚磷酸盐与快红反应）或深蓝色萘酚磷酸盐与快红反应）或深蓝色 (-(-萘酚萘酚磷酸盐与快蓝反应）磷酸盐与快蓝反应）;紫蓝色（靛蓝四唑）紫蓝色（靛蓝四唑）最敏感最敏感酶的选择酶的选择:HRPH
24、RP染色结果比染色结果比APAP染色结果保存时间长染色结果保存时间长 含有内源性含有内源性HRPHRP的组织切片的组织切片:首选标记酶为首选标记酶为APAP AP AP和和HRPHRP结合可进行双重或三重免疫组化标记结合可进行双重或三重免疫组化标记,对比清晰对比清晰第35页，共63页。第三节第三节 免疫荧光组织化学技术免疫荧光组织化学技术定义定义:采用采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，分抗原抗体复合物上
25、带有荧光素，在荧光显微镜下，分辨出抗原辨出抗原(或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算其含量，以达到对抗原量技术计算其含量，以达到对抗原(或抗体）物质定位、或抗体）物质定位、定性和定量测定的目的。定性和定量测定的目的。第36页，共63页。一、组一、组 织织 的的 处处 理理 标本的类型：标本的类型：涂片和印片涂片和印片 组织切片组织切片 细胞培养标本细胞培养标本 活细胞活细胞 标本的保存：标本的保存：标本固定干燥后，最好立即染色镜检标本固定干燥后，最好立即染色镜检 保持干燥、置保持干燥、置44甚至甚至-20-20 以下保存以下保存第37页
26、，共63页。二、荧光免疫组化染色二、荧光免疫组化染色 直接法：直接法：优点：优点：操作简便、特异性高操作简便、特异性高 缺点：缺点：敏感度偏低、抗体制备麻烦敏感度偏低、抗体制备麻烦 间接法：间接法：优点：优点：较直接法灵敏，标记一种抗较直接法灵敏，标记一种抗 体可以鉴定多种抗原体可以鉴定多种抗原 缺点：缺点：非特异荧光、操作时间较长非特异荧光、操作时间较长 第38页，共63页。双标记荧光免疫染色法：双标记荧光免疫染色法：用两种荧光素分别标记用两种荧光素分别标记不同抗体，对同一标本不同抗体，对同一标本中的相应两种抗原同时中的相应两种抗原同时显示显示 标记抗体标记抗体A A抗原抗原A A抗原抗原B
27、 B标记抗体标记抗体B B标本标本载玻片载玻片第39页，共63页。第四节第四节 亲和组织化学技术亲和组织化学技术 亲和组织化学亲和组织化学（Affinity histochemistryAffinity histochemistry）是利用两种物质之间的高）是利用两种物质之间的高度亲和力而建立的方法。一些具有双价或多价结合力的物质如植物度亲和力而建立的方法。一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素、生物素和葡萄球菌蛋白凝集素、生物素和葡萄球菌蛋白A A等，对某种组织成分具有高亲和力，等，对某种组织成分具有高亲和力，可以与标记物如荧光素、酶、同位素、铁蛋白及胶体金等结合可以与标记物如荧光素、酶
28、、同位素、铁蛋白及胶体金等结合,可采用可采用荧光显微镜、酶加底物的显色反应、放射自显影或电子显微镜，在荧光显微镜、酶加底物的显色反应、放射自显影或电子显微镜，在细胞或亚细胞水平进行对应亲和物质的定位或定量。细胞或亚细胞水平进行对应亲和物质的定位或定量。第40页，共63页。一、生物素一、生物素-亲合素法亲合素法 生物素生物素/Biotin：即维生素即维生素H H，是一种碱性蛋白。，是一种碱性蛋白。亲合素亲合素/Avidin：也被称为抗生物素，它是由也被称为抗生物素，它是由4 4个相同亚基组成的大个相同亚基组成的大分子糖蛋白，分子糖蛋白，具有具有4 4个与生物素亲和力极高的结合点个与生物素亲和力极
29、高的结合点，能够彼此牢固，能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性，它们都具有与其它示踪剂结合的结合而不影响彼此的生物学活性，它们都具有与其它示踪剂结合的能力。能力。第41页，共63页。亲合素亲合素-生物素生物素-过氧化酶复合物技术过氧化酶复合物技术Avidin Biotin Peroxidase Complex technique，ABC原理：原理：预先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合形成可溶预先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合形成可溶性的性的ABC复合物。当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直复合物。当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，接法）
30、或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，ABC中末饱和中末饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原抗体反应体系与抗体反应体系与ABC标记体系连成一体进行检测。标记体系连成一体进行检测。第42页，共63页。第43页，共63页。待测抗原待测抗原 非特异性抗原非特异性抗原A-A-亲合素亲合素 B-B-生物素生物素 E-E-酶酶ABC ABC 直接法原理示意图直接法原理示意图第44页，共63页。ABC ABC 间接法原理示意图间接法原理示意图待测抗原待测抗原非特异性抗原非特异性抗原A-A-亲合素亲合素 B-B-生物素生物素 E-E-酶酶第45页，
31、共63页。缺点：缺点：有些组织如肝、肾、白细胞、脂肪组织和有些组织如肝、肾、白细胞、脂肪组织和乳腺等有内源性生物素活性，需要对组织乳腺等有内源性生物素活性，需要对组织进行预处理进行预处理 ABCABC复合物在中性时带正电荷，容复合物在中性时带正电荷，容易与细胞核等带负电荷结构非特异易与细胞核等带负电荷结构非特异结合亲合素为糖蛋白，可以与凝集结合亲合素为糖蛋白，可以与凝集素等碳水化合物素等碳水化合物结合结合 优点：优点：敏感性高敏感性高 特异性高特异性高 一抗和二抗工作浓度低一抗和二抗工作浓度低 操作时间缩短操作时间缩短 可以多重标记可以多重标记第46页，共63页。桥联亲合素桥联亲合素-生物素技
32、术生物素技术Bridged Avidin-Biotin technique，BRAB原理：原理：是是以游离的亲合素作为桥联剂以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检，利用亲合素的多价性，将检测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来，达到检测反应分子的目的。，达到检测反应分子的目的。由于生物素化抗体分子上连有多个由于生物素化抗体分子上连有多个生物素，因此，最终形成的抗原生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体生物素化抗体-亲合素亲合素-酶标生酶标生物素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，物素复合物可积
33、聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。即会产生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。第47页，共63页。第48页，共63页。BRAB BRAB 直接法原理示意图直接法原理示意图待测抗原待测抗原 非特异性抗原非特异性抗原A-A-亲合素亲合素 B-B-生物素生物素 E-E-酶酶第49页，共63页。BRAB BRAB 间接法原理示意图间接法原理示意图待测抗原待测抗原非特异性抗原非特异性抗原A-A-亲合素亲合素 B-B-生物素生物素 E-E-酶酶第50页，共63页。标记生物素标记生物素-抗生物素技术抗生物素技术Labelled Avidin-biotin
34、technique，LAB原理原理:以标记亲合素直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测。以标记亲合素直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测。特点特点:相当高的灵敏度，相当高的灵敏度，省略了加标记生物素步骤，操作较省略了加标记生物素步骤，操作较BRABBRAB法简便。法简便。间接间接LABLAB法采用生物素化第二抗体，可进一步提高法采用生物素化第二抗体，可进一步提高 检测灵敏度检测灵敏度YYYBYYBEEEYYBEEEYY YY YBYYBYYYYBEEEE EE EE EYYBYYBEEEE EE EE E第51页，共63页。二、链霉亲合素二、链霉亲合素-生物素法生物素法(LSAB
35、）链霉亲合素链霉亲合素(Streptavidin SA)(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物是从链霉菌培养物提取的一种纯蛋白，不含糖基，有提取的一种纯蛋白，不含糖基，有4 4个生物素结合位个生物素结合位点，并且具有高度的亲和力，其功能类似亲合素。点，并且具有高度的亲和力，其功能类似亲合素。利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合素组合成酶标链霉亲合素-生物素方法生物素方法第52页，共63页。LSABLSAB法具有几大特点：法具有几大特点：酶标记在酶标记在SASA上，与生物素结合的位点呈游离状态，可上，与生物素结
36、合的位点呈游离状态，可结结合更多的生物素化的二抗合更多的生物素化的二抗，放大效应远远超过，放大效应远远超过ABCABC法（法（1-1-2 2倍）倍）低背景着色：等电点比亲和素低，带正电荷少，与带低背景着色：等电点比亲和素低，带正电荷少，与带负电荷的结缔组织结合少，背景染色低。负电荷的结缔组织结合少，背景染色低。操作时间缩短（孵育时间短），抗体用量少。操作时间缩短（孵育时间短），抗体用量少。第53页，共63页。三、葡萄球菌三、葡萄球菌A蛋白法蛋白法定义定义:葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A A（SPASPA）是一种从金黄色葡萄球菌细胞）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，由于它能与多种动物壁分离
37、的蛋白质，由于它能与多种动物IgGIgG的的FcFc段结合，段结合，用用SPASPA标记物（酶、荧光素、放射性物质等）显示抗原与抗标记物（酶、荧光素、放射性物质等）显示抗原与抗体结合反应的各种免疫检测实验体结合反应的各种免疫检测实验第54页，共63页。SPASPA可以和人及多种动物的可以和人及多种动物的IgGIgG结合，解决不同动物样结合，解决不同动物样本检测时，需分别标记相应二抗的问题本检测时，需分别标记相应二抗的问题SPASPA结合部位是结合部位是FcFc段，因此不会影响抗体的活性段，因此不会影响抗体的活性 SPASPA具有双价结合力具有双价结合力SPASPA对对IgGIgG 亚型的结合有
38、选择性，可能出现的假阴性结亚型的结合有选择性，可能出现的假阴性结果果第55页，共63页。三、凝集素法三、凝集素法凝集素（凝集素（lectinlectin）是指一类从植物种子、无脊椎动物和较高是指一类从植物种子、无脊椎动物和较高等动物组织中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白质，可使红等动物组织中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白质，可使红细胞凝集故称凝集素。细胞凝集故称凝集素。凝集素具有与特定糖基专一结合的特凝集素具有与特定糖基专一结合的特性性，是研究肿瘤细胞膜糖分子变化的一种理想工具。凝集，是研究肿瘤细胞膜糖分子变化的一种理想工具。凝集素法就是一方面利用凝集素可以与标记物结合，另一方面素法就是一方面利用凝集素
39、可以与标记物结合，另一方面又可以与细胞膜糖基结合所形成一种亲和反应。又可以与细胞膜糖基结合所形成一种亲和反应。第56页，共63页。直接法直接法是将标记物直接标记在凝集素上，与组织细胞相应是将标记物直接标记在凝集素上，与组织细胞相应的糖蛋白或糖脂相结合。的糖蛋白或糖脂相结合。间接法间接法是先将凝集素与组织细胞膜糖基结合，然后再用标是先将凝集素与组织细胞膜糖基结合，然后再用标记的抗凝集素抗体与结合在细胞上的凝集素反应记的抗凝集素抗体与结合在细胞上的凝集素反应-凝集素凝集素-糖法，这种方法是利用生物细胞膜的特殊糖基与凝集素结合糖法，这种方法是利用生物细胞膜的特殊糖基与凝集素结合后，再用标记的已知糖基
40、与其反应，形成一个后，再用标记的已知糖基与其反应，形成一个“三明治样三明治样”的结合物。的结合物。第57页，共63页。第六节第六节 免疫组化技术的应用免疫组化技术的应用第58页，共63页。荧光免疫组织化学技术的应用荧光免疫组织化学技术的应用肾小球抗基底膜抗体的阳性显色肾小球抗基底膜抗体的阳性显色自身免疫性疾病中的应用自身免疫性疾病中的应用病原体检测病原体检测SARSSARS感染的细胞感染的细胞第59页，共63页。酶免疫组织化学技术的应用酶免疫组织化学技术的应用提高病理诊断准确性（提高病理诊断准确性（HEHE可观察到炎性细胞浸润，可观察到炎性细胞浸润，ED1ED1染色可观察到巨噬细胞浸润）染色可观察到巨噬细胞浸润）第60页，共63页。Survivin在肝癌细胞核的表达 癌基因蛋白的癌基因蛋白的临床应用临床应用第61页，共63页。对肿瘤细胞增生程度的评价Ki67在小肝癌组织中的表达 第62页，共63页。肿瘤的靶向治疗第63页，共63页。
