1、PBMCsPBMCs的分离和计数的分离和计数 实验目的和要求实验目的和要求 掌握掌握PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)分离的方法分离的方法 掌握掌握细胞计数的方法细胞计数的方法 实验原理实验原理 外周血中细胞种类外周血中细胞种类 细胞细胞密度密度 红细胞和多核白细胞 1.092-1.093 PBMC(淋巴细胞和单核细胞)1.074 淋巴细胞分离液：Ficoll-Hypague 1.077密度梯度离心法：利用一种密度介于1.075-1.092之间而近于等渗的溶液做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种细胞各种细胞加以分离。实验方案
2、实验方案抽取外周血分离PBMCs 细胞计数 实验材料实验材料1.肝素抗凝血肝素抗凝血2.Hanks液液3.淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液4.水平离心机5.显微镜6.细胞计数板细胞计数板实验步骤实验步骤肝素抗凝静脉血肝素抗凝静脉血1-1-1.5 ml加等体积的加等体积的Hanks液稀释液稀释置于置于2ml淋巴细胞分离液上淋巴细胞分离液上(交界液面：一定交界液面：一定不要打乱不要打乱)稀释后的稀释后的抗凝血抗凝血淋巴细胞淋巴细胞分离液分离液用用Hanks液洗、液洗、离心离心(1500 1500 rpmrpm，5 5minmin)重复重复2次次血浆分层液红细胞粒细胞离心（离心（20002000rpmr
3、pm，2 25min5min）PBMCs层细胞计数板细胞计数板细胞计数细胞计数数上不数下，数左不数右。用100ulHanks液重悬细胞取10ul细胞悬液+40ul Hanks液+50ul台盼兰,混匀 取10ul于细胞计数板上进行细胞计数细胞计数细胞计数实验结果计算实验结果计算2 22 2个大方格内细胞总数个大方格内细胞总数单个核细胞浓度单个核细胞浓度（细胞数（细胞数/ml)/ml)10104 4稀释倍数=活细胞百分率活细胞百分率=活细胞数活细胞数细胞总数细胞总数100%100%细胞活力检测：细胞活力检测：（台盼兰染色：死细胞被染成蓝色，活细胞（台盼兰染色：死细胞被染成蓝色，活细胞不着色）不着色）细胞数量：细胞数量：u 纯度在纯度在90%90%以上以上u 淋巴细胞约占淋巴细胞约占90-95%90-95%u 细胞收获率可达细胞收获率可达80-90%80-90%u 活细胞百分率在活细胞百分率在95%95%以上以上密度梯度离心法密度梯度离心法分离分离PBMCs：注意事项注意事项 稀释的肝素抗凝血，沿管壁轻轻叠加于分离液上，使两者形成一个清晰地界面。细胞经离心分层后，缓慢小心吸取，切勿打破形成的细胞层。
