1、第三篇 分子诊断以分子诊断以DNADNA、RNARNA和蛋白质为材料，通和蛋白质为材料，通过应用分子生物学技术，检查基因的存在、过应用分子生物学技术，检查基因的存在、结构缺陷或表达异常，从而对人体状态和结构缺陷或表达异常，从而对人体状态和疾病作出诊断。疾病作出诊断。着重介绍感染性疾病、遗传性疾病、复杂着重介绍感染性疾病、遗传性疾病、复杂疾病等的分子诊断基本策略和方法。疾病等的分子诊断基本策略和方法。分子诊断的临床意义在于不仅能够分子诊断的临床意义在于不仅能够对疾病作出早期诊断、确切诊断，而且还对疾病作出早期诊断、确切诊断，而且还能确定个体归于疾病的易感性以及疾病的能确定个体归于疾病的易感性以及
2、疾病的分期分型、疗效监测、预后判断等。随着分期分型、疗效监测、预后判断等。随着分子诊断学的发展，分子诊断的原理和方分子诊断学的发展，分子诊断的原理和方法不仅适用于遗传性疾病，而且也广泛应法不仅适用于遗传性疾病，而且也广泛应用于感染性疾病、肿瘤等医学领域。用于感染性疾病、肿瘤等医学领域。从生物中心法则来看，分子诊断包从生物中心法则来看，分子诊断包括检测基因的结构异常和基因表达异常。括检测基因的结构异常和基因表达异常。常见的分子诊断方法如下：常见的分子诊断方法如下：DNADNAmRNAmRNA蛋白质蛋白质转转 录录反转录反转录 翻翻 译译 PCRPCR DNADNA测序测序Southern-blo
3、tSouthern-blot基因芯片基因芯片基因结构异常基因结构异常基因表达异常基因表达异常RT-PCR RT-PCR FQ-PCRFQ-PCR Nothern-blot Nothern-blot 基因芯片基因芯片ELISAELISAWestern-blot Western-blot 组织化学染色组织化学染色蛋白质芯片蛋白质芯片中心法则中心法则检测方法检测方法第十四章第十四章感染性疾病的分子诊断感染性疾病的分子诊断生物化学与分子生物学学科生物化学与分子生物学学科2011.42011.4第一节第一节 概概 述述感染性疾病感染性疾病：由某种病原体所致，通过不：由某种病原体所致，通过不同方式引起人体
4、发生感染并出现临床症同方式引起人体发生感染并出现临床症状的疾病。状的疾病。病原体病原体：病毒、细菌、原虫、支原体、：病毒、细菌、原虫、支原体、衣原体、立克次体。衣原体、立克次体。常规检测方法：常规检测方法：免疫学方法免疫学方法 微生物学方法微生物学方法 受敏感性、特异性限制，不易早期诊断，受敏感性、特异性限制，不易早期诊断，并且不易提供病原体分型及耐药性方面的并且不易提供病原体分型及耐药性方面的信息。信息。分子生物学方法：分子生物学方法：聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCRPCR）核酸杂交核酸杂交 基因芯片基因芯片 早期、特异地进行诊断，能提供早期、特异地进行诊断，能提供病原体分型及耐药性方
5、面的信息，同时进行病原体分型及耐药性方面的信息，同时进行大量基因的检测。大量基因的检测。一、一、感染性疾病的分子诊断，其诊断感染性疾病的分子诊断，其诊断策略可以分为以下两种：策略可以分为以下两种：一般性检出策略一般性检出策略，即只需要提供是否有，即只需要提供是否有某种病原体的感染；某种病原体的感染；完整检出策略完整检出策略，即不仅对病原体做出诊，即不仅对病原体做出诊断，还要进行分型（包括亚型）和耐断，还要进行分型（包括亚型）和耐药性方面的检测。药性方面的检测。1.1.一般性检出策略和方法一般性检出策略和方法 针对针对特异性的核酸序列特异性的核酸序列进行核酸分子进行核酸分子探针杂交，或者利用探针
6、杂交，或者利用常规常规PCRPCR技术直接技术直接检出微生物的检出微生物的DNA/RNADNA/RNA，它能够判断，它能够判断有有无感染无感染和是和是何种病原体感染何种病原体感染。2.2.完整检出策略和方法完整检出策略和方法 按照诊断按照诊断分型分型亚型亚型耐耐药性检测的思路药性检测的思路，利用多种分子诊断手，利用多种分子诊断手段对感染性病原体进行分析。段对感染性病原体进行分析。基因芯片基因芯片、基因测序基因测序等等 二、感染性疾病分子诊断的常用方法 根据目的基因是否被放大，可分为杂交法和扩增法。信号放大技术检测方法 靶分子数目不变，而检测的探针信号放大 采用多酶、多探针或二者结合等方法来增加
7、探针标志物的浓度使检测信号得到放大。靶分子扩增技术检测方法 靶分子（RNA、DNA或探针）的扩增 PCR、替代扩增、LCR等分支链DNA信号放大技术(bDNA)nucleic acid sequence-based amplification(NASBA)Figure 1.Target generation scheme for SDA.This figure depicts the initial stepsin an SDA reaction which transform the original target sequence into theamplification cycle d
8、epicted in Figure 2.Figure 2.The SDA reaction cycle.These reaction steps continuously cycle during the course of amplification.NoImage引物A 靶RNA 引物B RNAcDNA RT 355535353cDNA cDNA模板 553353引物B RNAseH RT T7RNA聚合酶 100-1000 RNA扩增子 53533535引物A 355RNAseH RNA RNA cDNA cDNA 5端带有T7RNA聚合酶结合位点，3端碱基与靶RNA 3端序列互补;的碱
9、基序列与cDNA 3端序列互补三、感染性疾病分子诊断的标本处理 标本采集处理主要包括选择合适的标本种类、标本量、抗凝剂等及对标本进行合适的传送、保存和预处理。四、感染性疾病分子诊断的结果解释1.阴性结果 假阴性可能性 方法的灵敏度太低 方法失败 目标分子2.阳性结果 假阳性可能性 方法的特异性 受到污染3.定性检测结果 有时不能提供病原体活力相关信息 临床治疗病情缓解后一定时间内，在患者样本中仍可以检测出相应的病原体。有些病原体潜伏在进体内，没有临床症状。4.疾病状况的判断 检测出病原体的存在并不能说此病原体就是引起疾病的直接原因。该病原体可能是一种正常菌群 五、感染性疾病分子诊断的临床应用及
10、评价 用于感染性疾病治疗的监控和预测、病情发展过程的危险性评价及疾病预后等。耐用性的检测 细菌的分型 流行病调查第二节第二节 病毒的基因检测病毒的基因检测人类许多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝人类许多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、脑炎、流行性感冒等等，占人类传染疾炎、脑炎、流行性感冒等等，占人类传染疾病的病的75%75%左右。左右。400400多种不同病毒。多种不同病毒。病毒结构：大病毒结构：大 小：小：20-300nm 20-300nm 核心区：核酸（核心区：核酸（DNADNA或或RNARNA）外周衣壳：蛋白质外周衣壳：蛋白质 包膜：脂质（镶嵌有蛋白质）包膜：脂质（镶嵌有蛋白质）我国是我
11、国是HBVHBV高流行区，高流行区，50%50%70%70%的人受的人受过感染，过感染，8%8%10%10%是是HBVHBV携带者，肝炎患者携带者，肝炎患者中中60%60%是慢性肝炎患者，导致肝硬变，是慢性肝炎患者，导致肝硬变，HBVHBV又与原发性肝癌密切相关。又与原发性肝癌密切相关。外壳（外壳（HBsAg):HBsAg):外壳蛋白成分为表面抗原外壳蛋白成分为表面抗原 核心（核心（HBcAg)HBcAg)：DNA DNA DNA DNA 聚合酶聚合酶 HBcAg HBcAg一、一、乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒DaneDane颗粒（完整的病毒）形态颗粒（完整的病毒）形态HBsAgHBcAgHBV
12、DNADNAPol（外膜蛋白）（外膜蛋白）（核衣壳蛋白）（核衣壳蛋白）完整的乙肝病毒颗粒直径42纳米由双层外壳和一个核心组成的，核心直径为27纳米，内含DNA双链和DNA多聚酶（一）病毒基因组结构（一）病毒基因组结构 3.2kb3.2kb双链双链DNADNA病毒病毒 不完全双连环状不完全双连环状DNADNA 长链长链L L为负链：有为负链：有4 4个开放阅读框个开放阅读框S S、C C、P P、X X S S区编码外膜蛋白（区编码外膜蛋白（HBsAgHBsAg）C C区编码区编码HBeAg HBeAg、HBcAg HBcAg p p区编码区编码DNADNA聚合酶聚合酶 X X区位编码区位编码X
13、 X蛋白，可能与病毒蛋白表蛋白，可能与病毒蛋白表 达有关。达有关。短链短链S S为正链：长短不一为正链：长短不一pre-s1 pre-s1 pre-s2pre-s2S S P P C C pre-cpre-c X XHBV DNA 3.2 kbHBV DNA 3.2 kbpre-S1pre-S1 pre-S1pre-S1蛋白蛋白 pre-S2pre-S2 pre-S2pre-S2蛋白蛋白 S S HBsAgHBsAg pre-Cpre-C HBeAgHBeAg C C HBcAg HBcAg P P DNAP DNAP X X HBxAgHBxAgHBVHBV基因组结构基因组结构（二）分子诊断
14、（二）分子诊断 常用的免疫学检测方法，即二对半的检测存常用的免疫学检测方法，即二对半的检测存在窗口期，不易早期诊断。在窗口期，不易早期诊断。1.PCR 1.PCR 采用普通采用普通PCRPCR、FQ-PCRFQ-PCR、竞争性、竞争性PCRPCR、免疫、免疫杂交杂交PCRPCR，可提供直接、准确的病原学诊断证，可提供直接、准确的病原学诊断证据。引物是根据据。引物是根据S S、C C、P P、X X基因中高度保守基因中高度保守序列设计，决定扩增的特异性和敏感度。序列设计，决定扩增的特异性和敏感度。扩增位置扩增位置 引物序列引物序列 扩增片断（扩增片断（bp)bp)P P、X X基因基因 5-AT
15、ACTGCGGAACTCCTAGC-3 278 5-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3 278 5-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3 5-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3 C C基因基因 5-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3 477 5-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3 477 5-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3 5-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3 C C基因基因 5-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3 2
16、58 5-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3 258 5-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3 5-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3 有时为了证实扩增产物的特异性，对扩增有时为了证实扩增产物的特异性，对扩增产物进行以下分析：产物进行以下分析：RLFP RLFP 斑点杂交斑点杂交 Southern Southern杂交杂交 2.2.支链支链DNADNA信号放大技术信号放大技术(bDNA(bDNA）原理原理:捕获探针捕获探针 检测检测 靶探针靶探针1 1 体系体系 靶探针靶探针2 2 bDNA bDNA分子分
17、子:DNA:DNA主链上结主链上结 合多个侧链合多个侧链 捕获探针固化在微孔板上捕获探针固化在微孔板上 靶探针靶探针1 1分别与捕获探针及待测核酸杂交分别与捕获探针及待测核酸杂交 靶探针靶探针2 2分别与待测核酸及分别与待测核酸及bDNAbDNA杂交杂交 形成复合物：形成复合物：固相支固相支持物持物捕获捕获探针探针靶探靶探针针1 1CEsCEs待测待测核酸核酸靶探靶探针针2 2LEsLEsbDNAbDNA复复合物合物分支链DNA信号放大技术(bDNA)信号检测：信号检测：bDNAbDNA可结合很多酶标探针，酶催可结合很多酶标探针，酶催化底物（化底物（1,2-1,2-二恶二酮，二恶二酮，diox
18、etanedioxetane）发光，）发光，使核酸信号放大，且发光强度与使核酸信号放大，且发光强度与DNADNA量成正比。量成正比。优点：放大倍数确定优点：放大倍数确定 阳性检出率高阳性检出率高 稳定性和可重复性好稳定性和可重复性好 操作简便，省时，易于普及操作简便，省时，易于普及支链支链DNADNA技术技术3.3.基因芯片技术基因芯片技术 标本经标本经PCRPCR扩增后与芯片上的特异探扩增后与芯片上的特异探针进行杂交，可以检测：针进行杂交，可以检测：是否有病毒感染是否有病毒感染 感染病毒的种类及亚型感染病毒的种类及亚型 病毒的耐药情况病毒的耐药情况 特点：可同时进行大量标本的检测特点：可同时
19、进行大量标本的检测近年来陆续上市的核苷(酸)类似物对HBV的治疗压力集中在P区。干扰素治疗对HBV的压力主要集中在前C/C区及前S区。lamivudineadefovirentecavirtelbivudine（三）临床意义（三）临床意义1.1.早期诊断早期诊断 免疫学检测敏感性：免疫学检测敏感性：0.1 0.1g/ml g/ml 核酸杂交检测敏感性：核酸杂交检测敏感性：0.1pg/ml 0.1pg/ml PCR PCR检测：检测：0.1fg/ml 0.1fg/ml 因此，在感染早期即可通过因此，在感染早期即可通过DNADNA检测证实检测证实病毒的存在。病毒的存在。2.2.监测治疗效果监测治疗
20、效果:HBVDNA10 HBVDNA107 7拷贝拷贝/ml/ml提示病毒复制活跃；提示病毒复制活跃；HBVDNA HBVDNA10104 4拷贝拷贝/ml/ml治疗有一定疗效；治疗有一定疗效；HBVDNA HBVDNA10103 3拷贝拷贝/ml/ml、HBeAgHBeAg阴转、转氨酶阴转、转氨酶正常为乙型肝炎临床治愈指标；正常为乙型肝炎临床治愈指标；3.3.判断病情，指导制定合理的治疗方案判断病情，指导制定合理的治疗方案4.4.病毒耐药性的检测病毒耐药性的检测 乙肝病毒乙肝病毒DNADNA聚合酶聚合酶YMDDYMDD处的突变是病毒处的突变是病毒产生耐药性的重要原因，通过监测产生耐药性的重要
21、原因，通过监测YMDDYMDD的突的突变情况，可以获得病毒耐药性方面的信息，变情况，可以获得病毒耐药性方面的信息，指导抗病毒治疗。指导抗病毒治疗。二、流行性感冒病毒二、流行性感冒病毒 流行性感冒病毒流行性感冒病毒(Influenza virus)(Influenza virus)，是引，是引起流行性感冒的病原体起流行性感冒的病原体;分为甲分为甲(A)(A)、乙、乙(B)(B)和丙和丙(C)3(C)3个个型别型别;根据病毒颗粒表面根据病毒颗粒表面(Haemagglutinin ，HAHA)和和(Neuramiridase，NANA)的抗的抗原性，甲型流感病毒又可分为不同的原性，甲型流感病毒又可分
22、为不同的亚型亚型。甲型流感病毒易发生变异，致病力强，甲型流感病毒易发生变异，致病力强，19181918年发生在西方国家的大流感杀死了几千万人，年发生在西方国家的大流感杀死了几千万人，即是由甲型流感病毒引起。即是由甲型流感病毒引起。There are 16 different H antigens(H1 to H16)and nine different N antigens(N1 to N9).（一）流感病毒基因组结构（一）流感病毒基因组结构 单链单链RNARNA病毒，病毒，RNARNA为负链；为负链；有有8 8个个RNARNA片段或片段或7 7个个RNARNA片段；片段；所有所有RNARNA
23、片段片段55末端和末端和33末端高度保守；末端高度保守；两种不同亚型病毒感染宿主时，会生成基因两种不同亚型病毒感染宿主时，会生成基因重配的新病毒；重配的新病毒；RNARNA基因在复制过程中基因在复制过程中 常会发生点突变。常会发生点突变。（二）分子诊断方法（二）分子诊断方法 可采用可采用RT-PCRRT-PCR、FQ-PCRFQ-PCR检测流感病毒检测流感病毒RNARNA。引。引物常按流感病毒保守的非结构基因（物常按流感病毒保守的非结构基因（NSNS）的）的序列进行设计。序列进行设计。为证实为证实PCRPCR扩增产物的特异性或提高检测的灵扩增产物的特异性或提高检测的灵敏度，可用限制性内切酶分析
24、法、斑点杂交敏度，可用限制性内切酶分析法、斑点杂交法、法、SouthernSouthern印迹法进行扩增产物的分析。印迹法进行扩增产物的分析。扩增位置扩增位置 引物序列引物序列 扩扩增片段大小增片段大小 NSNS基因基因 5-AAGGGCTTTCACCGAAGAGG-3 190 5-AAGGGCTTTCACCGAAGAGG-3 190(bp)(bp)5-CCCATTCTCATTACTGCTTC-3 5-CCCATTCTCATTACTGCTTC-3 NSNS基因基因 5-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3 241 5-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3 241(bp)(bp)
25、5-TGTCAGCTATTATGGAGCTG-3 5-TGTCAGCTATTATGGAGCTG-3（三）临床意义（三）临床意义 流感病毒的诊断过去主要靠鸡胚羊膜腔流感病毒的诊断过去主要靠鸡胚羊膜腔培养和血清学血凝抑制试验，这些方法比较培养和血清学血凝抑制试验，这些方法比较费时，灵敏度低，难以作出早期诊断。费时，灵敏度低，难以作出早期诊断。PCRPCR法敏感、特异、简便、快速，并且法敏感、特异、简便、快速，并且可用于流感病毒的分型和流行病学调查。可用于流感病毒的分型和流行病学调查。HIV，human immunodeficiency virus AIDS，acquired immunodefic
26、iency syndrome HIVHIV为艾滋病的病原体。现已发现引起艾滋病为艾滋病的病原体。现已发现引起艾滋病的病毒有的病毒有HIV-1HIV-1、HIV-2HIV-2、HIV-3HIV-3三种。三种。19981998年底艾滋病感染者和艾滋病患者总数为年底艾滋病感染者和艾滋病患者总数为3.3403.340万，已死亡万，已死亡1.3901.390万，是全球十大主要万，是全球十大主要死因之一。死因之一。最外层为囊膜，双层脂蛋白，是病毒识别攻击宿主最外层为囊膜，双层脂蛋白，是病毒识别攻击宿主细胞所必不可少的；其内为核衣壳。细胞所必不可少的；其内为核衣壳。2.2.基因组结构基因组结构 逆转录病毒，
27、两个拷贝的单股正链逆转录病毒，两个拷贝的单股正链RNARNA；每个每个RNARNA长约长约9.7Kb9.7Kb，有，有55帽，帽，33端有多聚端有多聚尾；尾；HIV HIV是一种高度变异的病毒；是一种高度变异的病毒；含有含有gaggag、env env 和和 pol pol三个基因以及三个基因以及6 6种调控种调控基因基因 tat,vif,vpr,vpx,nef,rev tat,vif,vpr,vpx,nef,rev。gaggag基因编码病毒的核心蛋白；基因编码病毒的核心蛋白；polpol基因编码病毒复制所需要的酶类（逆转基因编码病毒复制所需要的酶类（逆转录酶、整合酶和蛋白酶）；录酶、整合酶和
28、蛋白酶）；envenv基因所编码病毒包膜蛋白，是基因所编码病毒包膜蛋白，是HIVHIV免疫学免疫学诊断的主要检测抗原。诊断的主要检测抗原。调控基因编码辅助蛋白，调节病毒蛋白合成调控基因编码辅助蛋白，调节病毒蛋白合成和复制。和复制。（二）分子诊断方法（二）分子诊断方法抗体的检测：酶联免疫吸附法（抗体的检测：酶联免疫吸附法（ELISAELISA）和免）和免疫荧光检测法（疫荧光检测法（IFAIFA）；感染）；感染2 2周后才能逐渐周后才能逐渐产生病毒抗体；产生病毒抗体；抗原的检测：酶联免疫吸附法（抗原的检测：酶联免疫吸附法（ELISAELISA）检测）检测P24P24抗原，灵敏度低抗原，灵敏度低1.
29、1.病毒载量检测病毒载量检测 感染者体内感染者体内HIVHIV的定量检测，对病情判断和的定量检测，对病情判断和治疗效果检测极有价值。治疗效果检测极有价值。目前常用三种技术：目前常用三种技术：RT-PCR RT-PCR 最低检测限最低检测限5050拷贝拷贝/ml/ml bDNA bDNA 最低价测限最低价测限5050拷贝拷贝/ml/ml NASBA NASBA 最低检测限最低检测限2020拷贝拷贝/ml/mlPCR PCR RNA RNA逆转录逆转录cDNAcDNA整合到宿主基因组中复制，整合到宿主基因组中复制，以被感染细胞以被感染细胞DNADNA为模板为模板PCRPCR扩增；扩增；HIV HI
30、V为高变异病毒，不同患者体内分离的为高变异病毒，不同患者体内分离的病毒基因结构有差异，引物设计应根据各编病毒基因结构有差异，引物设计应根据各编码区的保守序列设计；码区的保守序列设计；灵敏度高，特别是用于无症状灵敏度高，特别是用于无症状HIVHIV感染者。感染者。扩增位置扩增位置 引物序列引物序列 扩增片断（扩增片断（bp)bp)gaggag基因基因 5-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3 5-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3 342 342 5-CCAGTAGGAGAAATCTATAAAA-3 5-CCAGTAGGAGAAATCTATAAAA-3 gapgap基因
31、基因5-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-3 5-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-3 115 115 5-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATCC-3 5-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATCC-3 polpol基因基因5-TAGAATTCCTCAGATCACTCTT-3 5-TAGAATTCCTCAGATCACTCTT-3 360 360 5-GCAAGCTTATGGGCCATCCATTCC-3 5-GCAAGCTTATGGGCCATCCATTCC-3 核酸序列依赖的扩增核酸序列依赖的扩增 NASBA
32、NASBA Nucleic acidNucleic acidsequence-basedsequence-basedamplificationamplification NASBANASBA原理原理:将引物、标本加入扩增反应液，将引物、标本加入扩增反应液，6565使使RNARNA分子二级结构打开分子二级结构打开,降温至降温至3737加入逆加入逆转录酶转录酶,T7RNA,T7RNA聚合酶和聚合酶和RNaseRNaseH,H,并在并在3737反应反应1 11.51.5小时小时,其产物经琼脂糖电泳，溴乙锭染色其产物经琼脂糖电泳，溴乙锭染色即可在紫外仪下看到条带。其主要产物为单链即可在紫外仪下看到条带
33、。其主要产物为单链RNA,RNA,用于用于RNARNA的扩增、检测及测序。的扩增、检测及测序。NASBANASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种需温度循环。整个反应过程由三种 酶控制，酶控制，循环次数少，忠实性高循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于其扩增效率高于PCRPCR，特异性好。特异性好。2.病毒表型和耐药检测 HIV表型主要依据逆转录酶和蛋白酶基因突变的检测 最常用的耐药检测方法是基因型检测方法,即查找与病毒耐药有关的基因突变。检测病毒逆转录酶（RT）和蛋白酶（PI）基因的序列，然后把这些结果与已知的没有发生突变的HI
34、V（称为野生株）基因序列进行比较，与之不同的基因序列就认为发生了突变。检测出的任何突变都有可能导致形成HIV耐药性，但具体结果的解释必须要有非常有经验的专家和医师来进行。（三）临床意义（三）临床意义1.1.原位杂交：可以显示病毒感染的部位；原位杂交：可以显示病毒感染的部位；2.PCR2.PCR：可对无症状的感染者进行早期诊断；：可对无症状的感染者进行早期诊断；3.3.病毒载量检测：在临床进展情况的判定及疗病毒载量检测：在临床进展情况的判定及疗效观察上极有价值。效观察上极有价值。第三节：病原菌的基因检测第三节：病原菌的基因检测 概述概述 正常菌群：存在于人体表及与外界相通部正常菌群：存在于人体表
35、及与外界相通部位的细菌；位的细菌；条件致病菌：正常菌群与人体平衡破坏，条件致病菌：正常菌群与人体平衡破坏，引起疾病的一类细菌；引起疾病的一类细菌；病原菌：具有毒性和侵袭力的细菌，造成病原菌：具有毒性和侵袭力的细菌，造成人体感染；人体感染；病原菌的诊断方法：病原菌的诊断方法：直接涂片法直接涂片法 生化试验生化试验 血清学试验血清学试验 分离培养分离培养 动物实验动物实验 分子生物学：灵敏、特异，可进行早分子生物学：灵敏、特异，可进行早期诊断、分型、耐药性检测；期诊断、分型、耐药性检测；不能确诊或进行不能确诊或进行分型、耐药性的分型、耐药性的检测，或费时等检测，或费时等 全世界全世界1/51/5人
36、口感染，每年约人口感染，每年约300300万死于万死于结核，中国占结核，中国占70%70%，免疫低下个体特别是，免疫低下个体特别是HIVHIV感染者更易于感染结核分枝杆菌。感染者更易于感染结核分枝杆菌。结核分枝杆菌为革兰氏阳性菌，细长略结核分枝杆菌为革兰氏阳性菌，细长略带弯曲，分枝状，有荚膜，抗酸染色阳性，带弯曲，分枝状，有荚膜，抗酸染色阳性，对多种抗生素有抵抗力。对多种抗生素有抵抗力。一一.结核分枝杆菌结核分枝杆菌形形 态态 (一一)基因组结构基因组结构 1.TB H37Rv 1.TB H37Rv株基因组是环状双链株基因组是环状双链DNADNA，共有共有4 4 411 529bp;411 5
37、29bp;2.2.共有共有40334033基因，功能已知的有基因，功能已知的有17341734个个,1694,1694个可能为新基因个可能为新基因;3.3.基因组中有许多药物抗性因子的编码序列，基因组中有许多药物抗性因子的编码序列，包括水解酶或者药物修饰酶。包括水解酶或者药物修饰酶。（二）分子诊断方法（二）分子诊断方法 普通普通PCRPCR、FQ-PCRFQ-PCR、竞争性、竞争性PCRPCR、免疫杂交、免疫杂交PCR PCR 扩增靶序列：扩增靶序列：65KDa 65KDa抗原基因（细菌细胞壁上蛋白）抗原基因（细菌细胞壁上蛋白）MPB MPB蛋白基因（结核杆菌复合群特有）蛋白基因（结核杆菌复合
38、群特有）rRNA rRNA基因基因 （种属鉴定）（种属鉴定）ISDNA6110 ISDNA6110插入序列插入序列靶序列靶序列 引物序列引物序列 扩增片断（扩增片断（bpbp）IS6110IS6110插入插入 5-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3 5-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3 317 317 5-TCAGCCGCGTCCACGCCGCCA-3 5-TCAGCCGCGTCCACGCCGCCA-3 16SrRNA 5-GGTGGTTTGTCGCGTTGTTC-3 16SrRNA 5-GGTGGTTTGTCGCGTTGTTC-3 463 463 5-TGCACACAG
39、GCCACAAGGGA-3 5-TGCACACAGGCCACAAGGGA-3 DNADNA重复序列重复序列 5-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3 5-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3 245 245 5-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3 5-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3 TB耐药检测 利福平耐药-RNA聚合酶rpoB基因 异烟肼耐药-katG基因 链霉素耐药-S12的rpsL基因 16SrRNA的rrs基因 喹诺酮的耐药-DNA解旋酶的gyrA和gyrB基因 水解酶或药物修饰酶（-内酰胺酶、氨基糖苷乙酰基转移酶和药物外排系统等）细菌耐药基因的
40、检测细菌耐药基因的检测 细菌耐药性的产生导致治疗失败、感染复发、细菌耐药性的产生导致治疗失败、感染复发、增加昂贵抗生素的使用。增加昂贵抗生素的使用。机理：由于细菌基因组的变异，导致机理：由于细菌基因组的变异，导致 1.1.细菌细胞外膜通透性改变；细菌细胞外膜通透性改变；2.2.产生灭活酶和钝化酶，如产生灭活酶和钝化酶，如-内酰胺酶；内酰胺酶；3.3.药物作用靶位改变；药物作用靶位改变；4.4.代谢途径改变；代谢途径改变；（三）临床意义（三）临床意义1.1.准确、快速、早期诊断准确、快速、早期诊断TB TB 2.2.区分区分TBTB与其它分枝杆菌与其它分枝杆菌 3.3.疫情监控和抗痨治疗疗效的评
41、价疫情监控和抗痨治疗疗效的评价 二、二、淋球菌淋球菌 淋球菌是淋病的病原菌，人是淋球菌淋球菌是淋病的病原菌，人是淋球菌的唯一自然宿主。淋病在我国性传播疾病种的唯一自然宿主。淋病在我国性传播疾病种中，发病率居首位。淋球菌耐药菌株的出现中，发病率居首位。淋球菌耐药菌株的出现和流行对淋病的控制带来很大困难。和流行对淋病的控制带来很大困难。传播途径：传播途径：1.1.直接性接触感染直接性接触感染 2.2.间接接触感染间接接触感染（一）基因组结构（一）基因组结构 1.1.染色体分子量染色体分子量980M980M，可编码约，可编码约50005000个基个基因，因，GCGC含量为含量为50%50%；2.2.
42、无操纵子结构无操纵子结构 3.3.含有含有1 1至数个至数个质粒质粒（2.6MDa2.6MDa，24.5MDa24.5MDa），），通过质粒介导耐药性在不同菌株间的转移；通过质粒介导耐药性在不同菌株间的转移；（二）分子诊断（二）分子诊断 1.PCR:1.PCR:扩增的靶序列：编码外膜蛋白扩增的靶序列：编码外膜蛋白的结构基的结构基因，或因，或16SrRNA16SrRNA基因、基因、CPPBCPPB基因（同时存在于基因（同时存在于染色体及质粒上）染色体及质粒上）靶序列靶序列 引物序列引物序列 扩增片断（扩增片断（bpbp）CPPBCPPB基因基因 5-GTTTGGCTGGTTGATTCAAG-3
43、633 5-GTTTGGCTGGTTGATTCAAG-3 633 5-GCAAGATTTCCGATTTGGCG-3 5-GCAAGATTTCCGATTTGGCG-3 外膜蛋白外膜蛋白5-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3 494 5-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3 494 5-TTTTCACATCTACGCGGCGG-3 5-TTTTCACATCTACGCGGCGG-3 5-CCGAAGCTCAAGACAACCTC-3 5-CCGAAGCTCAAGACAACCTC-3 1811812.LCR2.LCR（Ligase chain reaction Ligase chain
44、 reaction ）连接酶链反应连接酶链反应(Ligase chain reaction(Ligase chain reaction，LCR)LCR)，是一种新的，是一种新的DNADNA体外扩增和检测技术，体外扩增和检测技术，主要用于点突变的研究及靶基因的扩增主要用于点突变的研究及靶基因的扩增.原理：在原理：在PCRPCR反应体系中加入二条引物，加热反应体系中加入二条引物，加热 (94(9495)95)使使DNADNA变性，双链打开，然后降温变性，双链打开，然后降温退火退火(65)(65)，引物与模板，引物与模板DNADNA结合并留下一缺结合并留下一缺口，如果引物与模板完全互补，口，如果引物
45、与模板完全互补，DNADNA连接酶即连接酶即连接封闭缺口，连接封闭缺口，PCR PCR反应接着进行，扩增出反应接着进行，扩增出大量的目标大量的目标DNA.DNA.若有点突变，引物不能与模若有点突变，引物不能与模板精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发板精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接酶不能封闭缺口，生变化，连接酶不能封闭缺口，PCR PCR反应不反应不能进行，无扩增产物生成，据此可判断模板能进行，无扩增产物生成，据此可判断模板DNADNA中有无突变中有无突变.（三）临床意义（三）临床意义 1.1.分子诊断技术具有灵敏性高、快速、特异性分子诊断技术具有灵敏性高、快速、特异性好的优点
46、，可检测极微量的淋球菌。好的优点，可检测极微量的淋球菌。2.2.应用于以下几方面：应用于以下几方面：对菌株进行分型和耐药性分析。对菌株进行分型和耐药性分析。抗生素治疗效果的观察。抗生素治疗效果的观察。进行流行病学分析。进行流行病学分析。对疑似病例的诊断和鉴别诊断。对疑似病例的诊断和鉴别诊断。第四节第四节 衣原体的基因检衣原体的基因检测测 衣原体是介于立克次氏体与病毒之间，衣原体是介于立克次氏体与病毒之间，能通过细菌滤器，专性活细胞内寄生的一类能通过细菌滤器，专性活细胞内寄生的一类原核生物。原核生物。沙眼衣原体是一种在人体内长期生存并沙眼衣原体是一种在人体内长期生存并又广泛传播的病原体，常导致人
47、泌尿生殖道又广泛传播的病原体，常导致人泌尿生殖道疾病及眼病，有疾病及眼病，有1515种血清型。种血清型。一、基因组一、基因组 沙眼衣原体（血清型沙眼衣原体（血清型D D）基因组大小）基因组大小1042Kbp1042Kbp，GCGC含量为含量为41.3%41.3%，另有一个，另有一个7493bp7493bp的质粒，整个基因组有的质粒，整个基因组有894894个蛋白编码基因，个蛋白编码基因，其中其中604604个个(68%)(68%)编码蛋白的功能已明确，编码蛋白的功能已明确，3535个个(4%)(4%)编码基因在编码基因在GenBankGenBank收录的其他细菌收录的其他细菌中有同源序列，但功
48、能不清，剩下的中有同源序列，但功能不清，剩下的255255个个(28%)(28%)在在GenBankGenBank中没有检索到同源序列。中没有检索到同源序列。二、分子诊断二、分子诊断 1.PCR 1.PCR 扩增靶序列主要有外膜蛋白扩增靶序列主要有外膜蛋白(MOMP)(MOMP)基因、基因、特有质粒特有质粒DNADNA和和rRNArRNA基因序列。基因序列。rRNArRNA基因基因 5-GAAGGCGGATAATACCCGCTG-3 5-GAAGGCGGATAATACCCGCTG-3 5-GATGGGGTTGAGCCATCC-3 5-GATGGGGTTGAGCCATCC-3 MOMPMOMP基
49、因基因 5-GATAGCGAGCACAAAGACTAA-3 5-GATAGCGAGCACAAAGACTAA-3 5-CCATAGTAACCCATACGCATGCTG-3 5-CCATAGTAACCCATACGCATGCTG-3 2.LCR 2.LCR LCR LCR的扩增效率与的扩增效率与PCRPCR相当，其产物的检相当，其产物的检测也较方便灵敏测也较方便灵敏 三、临床意义三、临床意义 沙眼衣原体感染常缺乏特异症状，易形成沙眼衣原体感染常缺乏特异症状，易形成隐匿感染，分子诊断技术敏感性和特异性高，隐匿感染，分子诊断技术敏感性和特异性高，适用于早期诊断和无症状携带者的检查；适用于早期诊断和无症状
50、携带者的检查；第五节第五节 支原体的基因检测支原体的基因检测 肺炎支原体肺炎支原体(mycoplasma pulmonis,MP)(mycoplasma pulmonis,MP)是原发性非典型肺炎的病原体。是原发性非典型肺炎的病原体。一、基因组结构一、基因组结构 肺炎支原体肺炎支原体M129M129株基因组有株基因组有816394bp816394bp，G+CG+C含量为含量为40%40%，含，含677677个开放阅读框，个开放阅读框，3939个个RNARNA编编码基因。码基因。二、分子诊断方法二、分子诊断方法 1.PCR 1.PCR 扩增靶序列常选在扩增靶序列常选在16S rRNA16S rR
