1、 n 我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌三项。n致病菌：能够引起人类发病的细菌。对不同的食品和不同的场合，应该选择一定的参考菌群进行检验。一、生物学特性一、生物学特性 是一大群在血清学上相关的革兰氏阴性杆菌，无芽孢、是一大群在血清学上相关的革兰氏阴性杆菌，无芽孢、无荚膜，周身鞭毛，能运动的需氧或兼性厌氧短杆菌。无荚膜，周身鞭毛，能运动的需氧或兼性厌氧短杆菌。最适生长温度为最适生长温度为35 35 37 37，最适，最适pHpH为为7.27.27.47.4，较较抗寒，抗寒，能耐受较高盐浓度能耐受较高盐浓度。第一节第一节 沙门氏菌沙门氏菌检验技术检验技术不分解乳糖（亚利桑那
2、菌除外）。不分解乳糖（亚利桑那菌除外）。分解葡萄糖产酸产气（伤寒沙门菌产酸不分解葡萄糖产酸产气（伤寒沙门菌产酸不产气）。产气）。多数产生多数产生H H2 2S S，不产生靛基质，不液化明，不产生靛基质，不液化明胶，不分解尿素，不产生乙酰甲基甲醇，胶，不分解尿素，不产生乙酰甲基甲醇，多数能利用枸橼酸盐，能还原硝酸盐为亚多数能利用枸橼酸盐，能还原硝酸盐为亚硝酸盐，在氰化钾培养基上不生长。硝酸盐，在氰化钾培养基上不生长。沙门菌生物学性状沙门菌生物学性状 目前至少有目前至少有6767种种O O抗原和抗原和25002500个以上血清型个以上血清型,根据其对宿主的致病性根据其对宿主的致病性,可分为可分为三
3、类三类伤寒杆菌伤寒杆菌副伤寒杆菌副伤寒杆菌(甲、乙、丙甲、乙、丙)人人肠热症肠热症鼠伤寒杆菌鼠伤寒杆菌肠炎杆菌肠炎杆菌 猪霍乱杆菌猪霍乱杆菌儿童伤寒儿童伤寒人、动物人、动物急性胃肠炎急性胃肠炎猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌 败血症败血症沙门氏菌属沙门氏菌属(Salmonella)二、检验所需器材二、检验所需器材三、检验程序三、检验程序沙门氏菌检验程序沙门氏菌检验程序2010nSN方法方法：以无菌方式进行多点取样25g+225ml缓冲蛋白胨水，经37水浴4h培养，进行非选择性增菌；确保濒于死亡的细菌进行复活。其后移取10ml转种于盛有
4、100ml四硫磺酸盐煌绿增菌液，经421培养202h，进行选择性的增菌；使目的菌优胜出来。将增菌液摇匀，以无菌操作，分别接种DHL和BS平板上于37培养242h，进行分离培养；使目的菌分离出来。观察每个平板上的菌落，选取3-5个菌落接种于TSI或尿素酶琼脂上，于37中培养242h，进行筛选试验；将符合沙门氏菌特征的TSI中的培养物，接种于营养琼脂平板上，37中培养242h，进行纯化培养；选取单个菌落，接种于20E微量生化管中，进行API生化鉴定；同时取单个菌落，在洁净的玻板上，作血清学鉴定。四、操作方法四、操作方法n分五个步骤：分五个步骤：1.前增菌前增菌n2.选择性增菌选择性增菌n3.选择性
5、平板分离选择性平板分离 n4.生化实验生化实验n5.血清型分型鉴定血清型分型鉴定n n四、操作方法四、操作方法 分五个步骤：分五个步骤：n1.前增菌：前增菌：用无选择性的培养基使处于濒死状态的细菌恢复活力;BPWn2.选择性增菌：选择性增菌：使沙门氏菌优势繁殖，其它细菌受到抑制;SC+TTBnSC（亚硒酸盐胱氨酸增菌液）TTB（四硫磺酸钠煌绿增菌液）胱氨酸促生长四硫酸钠和煌绿抑菌氯化镁和孔雀绿抑菌n适合伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌生长，37适合其他沙门菌生长，42，1824h.为防漏检宜SC+TTBn3.选择性平板分离培养选择性平板分离培养：BS+XLD/HE/显色培基n4.生化试验：生化试验
6、：（1）初步生化实验：三糖铁实验n（2）对疑似沙门氏菌继续作系统生化实验n 最低限度生化实验：靛基质、尿素、KCN、赖氨酸。n鉴定分离出来的细菌是否符合沙门氏菌的生化谱，可采用API 20E 等成套生化试剂n5.血清型分型鉴定n A-F多价O血清：把ABCDEF各群含有的共同O抗原的抗体混合起来作成混合血清。n位相变异实验原理：在半固体培养基中加入已知相的血清，使解离出的已知相的菌体和血清发生反应，这样已知相的菌体就不能运动了，未知相的菌不能和血清发生反应，能够运动，并被解离出来。n血清学鉴定：血清学鉴定：特异性诊断血清鉴定到种（一）增菌培养（一）增菌培养n 前增菌称取 25 g（mL）样品放
7、入盛有 225 mL BPW 的无菌均质杯中，以 8 000 r/min10 000 r/min 均质 1 min2 min，或置于盛有 225 mL BPW 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min2 min。若样 品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定 pH 值，用 1 mol/mL 无菌 NaOH 或 HCl 调 pH 至 6.80.2。无菌操作将样品转至 500 mL 锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于 36 1 培养 8 h 18h。如为冷冻产品，应在 45 以下不超过 15 min，或 2 5 不超过 18 h 解冻。增菌n 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1 m
8、L，转种于 10 mL TTB 内，于 42 1 培养 18 h24 h。同时，另取 1 mL，转种于 10 mL SC 内，于 36 1 培养 18 h24 h。分离n分别用接种环取增菌液 1 环，划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个 XLD 琼脂平板（或 HE 琼脂 平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于 36 1 分别培养 18 h24 h（XLD 琼脂平板、HE 琼脂 平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或 40 h48 h（BS 琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表 1。检测检测沙门氏菌沙门氏菌方法分方法分5个步骤：个步骤：1.1.前增菌：前增菌：在含有营养的在含
9、有营养的非选择性培养基非选择性培养基中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。生理状态。沙门氏菌检测中前增菌的目的是沙门氏菌检测中前增菌的目的是使沙门氏菌使沙门氏菌恢复其活力。恢复其活力。检测经过加工的食品中的沙门氏菌需要前增菌主要因为加工过程中沙门氏菌受到损伤而处于濒死状态。2.选择性增菌选择性增菌n 在含在含选择性抑制剂选择性抑制剂的培养基中，样品进的培养基中，样品进一步增菌。一步增菌。n沙门沙门沙门氏菌检测中增菌的目的沙门氏菌检测中增菌的目的是是使使沙门氏沙门氏菌以外的细菌（主要是艾希氏菌属）受到抑菌以外的细菌（主要是艾希氏菌属）受到抑
10、制，而使沙门氏菌得到一定的增殖，提高沙制，而使沙门氏菌得到一定的增殖，提高沙门氏菌的检出率。门氏菌的检出率。n3.选择性平板分离选择性平板分离n 划线接种于：划线接种于：nBS和和XLD琼脂平板或琼脂平板或HE琼脂平板各一个，于琼脂平板各一个，于36+1分别培养分别培养1824小时小时(XLD、HE)或或4048小时小时(BS)。n 这一步采用这一步采用固体固体选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。亚硫酸亚硫酸铋琼脂铋琼脂(BS(BS琼脂琼脂)上典型特征上典型特征 木糖赖氨酸脱氧胆
11、盐（木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂上典型特征 HEHE琼脂琼脂上上典型特征（三）生化试验（三）生化试验n挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落，接种于三糖铁琼脂培养基中。在三糖铁琼脂内，各菌属的主要反应结果如表53。n 表52说明在三糖铁琼脂内只有斜面产酸同时H2S阴性的菌株可排除，其他的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时均有不是沙门氏菌的可能，都需要作进一步的生化试验，必要时作涂片染色镜检(沙门氏菌为革兰氏阴性短杆菌)。4.4.生物化学试验筛选生物化学试验筛选n 挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落，挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落，接种于三糖铁琼脂培养基中。接种于三糖铁琼脂培养基中。n 排除大多数非沙门氏
12、菌。也提供了排除大多数非沙门氏菌。也提供了沙门氏菌培养物菌属沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。的初步鉴定。TSI(三糖铁三糖铁)培养基培养基大肠杆菌和沙门氏菌大肠杆菌和沙门氏菌肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果 沙门菌常用生化试验沙门菌常用生化试验尿素酶试验尿素酶试验阴性（黄）阳性（红）阴性（黄）阳性（红）靛基质 对照管对照管 阴性阴性()阳性阳性()三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表果见表2。表表2说明，在三糖铁琼脂内斜面产酸，底层产酸，同时赖氨酸脱说明，在三糖铁琼脂内斜面产
13、酸，底层产酸，同时赖氨酸脱羧酶试验阴性的菌株可以排除。其他的反应结果均有沙门氏菌属羧酶试验阴性的菌株可以排除。其他的反应结果均有沙门氏菌属的可能，同时也均有不是沙门氏菌属的可能。的可能，同时也均有不是沙门氏菌属的可能。2、接种接种 蛋白胨水（供做靛基质试验）蛋白胨水（供做靛基质试验）尿素琼脂（尿素琼脂（pH7.2）氰化钾（氰化钾（KCN）将已挑菌落的平板储存于将已挑菌落的平板储存于2-5或室温至少保留或室温至少保留24h，以备必要时复查。以备必要时复查。P150（1）A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、氰化钾和赖氨：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、氰化钾和赖氨酸脱羧酶酸脱羧酶3项中有项中
14、有1项异常，按表项异常，按表可判定为沙门氏菌属可判定为沙门氏菌属。如有。如有2项项异常，为非沙门氏菌属。异常，为非沙门氏菌属。（2）A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项实验结果均为阳性，但需要两项实验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果结合血清学鉴定结果进行判定。进行判定。（3）A3：补做：补做ONPG。ONPG阴性阴性为沙门氏菌，同时为沙门氏菌，同时赖氨酸脱赖氨酸脱羧酶羧酶阳性，阳性，甲型副伤寒沙门氏菌甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。为赖氨酸脱羧酶阴性。（4）必要时进行沙门氏菌生化群的鉴别。）必要时进行沙门氏菌生化群
15、的鉴别。醇发酵试验阳性（黄）阳性（黄）阴性阴性 邻硝基酚邻硝基酚半乳糖苷酶试验（半乳糖苷酶试验（ONPG试验）试验）邻硝基酚邻硝基酚半乳糖苷酶试验（半乳糖苷酶试验（ONPG试验）试验）(1)原理：乳糖发酵过程中需要乳糖通透酶和半乳糖苷酶才能快速分解。有些细菌只有半乳糖苷酶，因而只能迟缓发酵乳糖，所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌均可快速水解邻硝基酚-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-D-galactopyranoside,ONPG）而生成黄色的邻硝基酚。用于枸橼酸菌属、亚利桑那菌属与沙门菌属的鉴别。(2)方法：将待试菌接种于ONPG肉汤中，35水浴或孵箱孵育1824h，观察结果。(3)结
16、果：呈现亮黄色为阳性，无色为阴性。(4)应用：可用于迟缓发酵乳糖细菌的快速鉴定，本法对于迅速及迟缓分解乳糖的细菌均可短时间内呈现阳性。埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、哈夫尼亚菌属、沙雷菌属和肠杆菌属等均为试验阳性，而沙门菌属、变形杆菌属和普罗威登斯菌属等为阴性。肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表 n接种三糖铁琼脂的同时，还要接种蛋白胨水，pH7.2尿素琼脂、KCN培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各一管，于36+1培养1824小时，必要时可延长至48小时，按表5-3判定结果。沙门氏菌的结果应属于A1、A2和B1，其他五种反应结果均可以排除。n反应序号A1，
17、典型反应判定为沙门氏菌属。如果尿素、KCN和赖氨酸三项中有一项异常，按表5-4仍可判定为沙门氏菌，如有两项异常，则按A3判定为枸橼酸杆菌。5.5.血清学分型鉴定血清学分型鉴定 提供培养物菌种的鉴定。提供培养物菌种的鉴定。用分离出的沙门氏菌与已知用分离出的沙门氏菌与已知A-FA-F多价多价O O血清及血清及H H因子进行玻片凝集试验。因子进行玻片凝集试验。1 1）抗原的准备抗原的准备2 2）O O抗原的鉴定抗原的鉴定 用用AFAF多价多价O O血清做玻片凝集试验，以生理血清做玻片凝集试验，以生理盐水做对照。盐水做对照。3 3）H H抗原的鉴定抗原的鉴定 4 4）ViVi抗原的鉴定抗原的鉴定 （五
18、）菌型的判定和结果报告（五）菌型的判定和结果报告n 综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果，按照常见沙门氏菌抗原表及其补充表判定菌型，并报告结果。若结果为阴性，则报告为“未发现沙门氏菌”。n目前，对于沙门氏菌的检验技术已有很大进展一些快速检验方法已有应用。如荧光抗体技术检验食品中沙门氏菌已在国际二得到公认，其些国家作为商品生产的荧光抗体试剂箱即可应用于沙门氏菌的快速检验。我国在这方面也取得一定的进展，如固相载体吸附免疫技术、免疫染色法，酶联A蛋白染色等快速检验方法均具有快速、方便、经济和准确等特点，还有许多新方法、新技术仍处在实验和研究阶段，有待于我们去研究探讨，以便更好服务于实践。n 指示系
19、统指示效果及可疑菌落特点nBS葡萄+H2S 黑色有金属光泽、棕褐或灰色，周围培基黑或棕色，或不产硫化氢而呈灰绿色nDHL乳糖+H2S乳糖（+）：粉红色，（-）：无色半透明n无色半透明，产硫化氢者中心黑色nSS乳糖+H2SnHE乳糖+H2S乳糖（+）：黄色，（-）：蓝色n蓝绿色或蓝色，产硫化氢者中心黑色沙门氏菌检测沙门氏菌检测 概述概述n原理：沙门氏菌为革兰氏阴性短杆菌，无芽孢，一般无荚膜，周生鞭毛（鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌除外）。兼性厌氧，最适生长温度37。在普通显微镜下和在普通培养基中不能与大肠杆菌进行区分。但沙门氏菌不发酵乳糖，在肠道菌鉴别培养基上形成无色透明菌落，而易与大肠杆菌区别。沙门氏
20、菌有着复杂的抗原构造，一般分为菌体（O）抗原、鞭毛（H）抗原和毒力（Vi）抗原三种。沙门氏菌属包括2000个以上血清型，但多数国家从人体、动物和食品中经常分离到有4050种血清型。n致病性n中毒现象沙门氏菌检测沙门氏菌检测 检测方法检测方法GBn前增菌，用无选择性的培养基使处以濒死状态的沙门氏菌恢复活力n选择性增菌，使沙门氏菌得以繁殖，而大多数的其他细菌受到抑制n选择性平板分离沙门氏菌n生化试验，鉴定到属n血清学分类型鉴定。沙门氏菌检测沙门氏菌检测 注意事项注意事项n结果记录n现象观察：菌落特征、革兰氏染色、BS琼脂、HE琼脂、SS琼脂、三糖铁琼脂n常见问题：nSC（亚硒酸盐胱氨酸增菌液）TT
21、B（四硫磺酸钠煌绿增菌液）MMn亚硒酸盐抑菌n胱氨酸促生长 四硫酸钠和煌绿抑菌 氯化镁和孔雀绿抑菌n适合伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌生长，37适合其他沙门菌生长，n42，1824hn为防漏检宜SC+TTB/MM沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征 第二节 金黄色葡萄球菌检验技术 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌近年来，美国疾病控制中心报告，近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，
22、在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占，加拿大则更多，占45%，我国每年，我国每年发生的此类中毒事件也非常多发生的此类中毒事件也非常多。金黄色葡萄球菌的流行病学金黄色葡萄球菌的流行病学 金黄色葡萄球葡萄球菌 表皮葡萄球菌属属分类：分类：腐生葡萄球菌 金黄色金黄色葡萄球菌食物中毒系葡萄球菌食物中毒系毒素型食物中毒。是由于进食毒素型食物中毒。是由于进食含有一种或多种含葡萄球菌肠含有一种或多种含葡萄球菌肠毒素的食物所引起。常见的菌毒素的食物所引起。常见的菌为为金黄色葡萄球菌金黄色
23、葡萄球菌。致病性葡萄球菌性葡萄球菌性食物中毒食物中毒是葡萄是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病，可球菌肠毒素所引起的疾病，可引发不同程度的急性胃肠炎症引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突出而且状，恶心、呕吐最为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。普遍，腹痛、腹泻次之。当金黄色葡萄球菌污染了当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经温度条件适宜时，经8-10小时即小时即可相当数量的肠毒素。可相当数量的肠毒素。雪印牛奶中毒事件雪印牛奶中毒事件 2000年年6月月29日起，日本雪印公司奶粉、低脂肪牛奶、
24、日起，日本雪印公司奶粉、低脂肪牛奶、酸奶等酸奶等3种牛奶制品被查出金黄色葡萄球菌毒素，造种牛奶制品被查出金黄色葡萄球菌毒素，造成成1.5万名消费者中毒万名消费者中毒 原因是在北海道的奶粉生产工厂（该厂的产品都是原因是在北海道的奶粉生产工厂（该厂的产品都是先制成奶粉，再在各地工厂还原成牛奶）出现了停先制成奶粉，再在各地工厂还原成牛奶）出现了停电，使生产线上的原料停留过久，所以出现了细菌电，使生产线上的原料停留过久，所以出现了细菌超标。超标。2001年以后年以后-借助其他公司支援开始分割公司事业。借助其他公司支援开始分割公司事业。2002年年雪印食品被解散雪印食品被解散一、生物学特性n 革兰氏阳性
25、需氧或兼性厌氧革兰氏阳性需氧或兼性厌氧菌，为球菌，排列成葡萄状，无菌，为球菌，排列成葡萄状，无芽孢芽孢、鞭毛，、鞭毛，不运动；不运动；大多数无大多数无荚膜。荚膜。n 最适生长温度最适生长温度3737，最适，最适pHpH为为 7.47.4，对 热 抵 抗 力 较 强，对 热 抵 抗 力 较 强，8030min8030min才能被杀死。才能被杀死。n 可在可在10%-10%-15%15%氯化钠氯化钠和和40%40%胆胆汁中生长汁中生长生物学特性 好氧生长的细胞产生接触酶；产生蛋白酶、好氧生长的细胞产生接触酶；产生蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、脂酶和溶菌酶，大多数菌株脂肪酶、磷脂酶、脂酶和溶菌酶，大多数菌
26、株可可水解水解天然的天然的动物蛋白，动物蛋白，例如例如血红蛋白血红蛋白、纤维、纤维蛋白、卵白、酪朊和多肽类如明胶，水解脂类、蛋白、卵白、酪朊和多肽类如明胶，水解脂类、吐温类和磷脂蛋白质，并释放脂肪酸吐温类和磷脂蛋白质，并释放脂肪酸。所有的所有的毒株毒株产生产生凝固酶凝固酶，人和动物来源的，人和动物来源的菌株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。菌株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。生物学特性生物学特性-培养特征培养特征 大多数菌株产生类大多数菌株产生类胡萝卜胡萝卜素，使细胞团呈现出深橙色到素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，而且在单个菌株中浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，
27、而且在单个菌株中可能也有变化可能也有变化 可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，基红反应阳性，VP反应弱阳性。反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。明胶。具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。素、红霉素等高度敏感。致病性 金黄色葡萄球菌是人金黄色葡萄球菌是人类类化脓感染化脓感染中最常见的中最常见的病原菌，临床表现多种病原菌，临床表现多种多样，可引起局部化脓多样，可引起局
28、部化脓感染，也可引起肺炎、感染，也可引起肺炎、胃胃肠炎、心包炎等，甚肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全至败血症、脓毒症等全身感染。身感染。致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：a.a.溶血毒素：外毒素，分甲、乙、丙、丁、戊五种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引溶血毒素：外毒素，分甲、乙、丙、丁、戊五种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；起肌体局部缺血和坏死；b.b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；c.c.血浆凝固酶血浆凝固酶：侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或
29、凝固：侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；d.d.脱氧核糖核酸酶：产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色脱氧核糖核酸酶：产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；葡萄球菌；e.e.肠毒素：产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，肠毒素：产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，现已鉴定出葡萄球菌肠毒素现已鉴定出葡萄球菌肠毒素有有A、B、C1C3、D、E、G、H共共9种。肠毒素种。肠毒素A是最常见的。是最常
30、见的。金黄色葡萄球菌的致病性金黄色葡萄球菌的致病性葡萄球菌皮肤感染食物中毒症状及发生原因：食物中毒症状及发生原因：症状症状原因 恶心、反复呕吐，中上腹部疼痛，伴有头晕、头痛，腹泻、发冷。严重者可导致大量失水而虚脱。葡萄球菌污染了食品，在适合的pH值和温度（最适范围内）下大量繁殖，产生肠毒素。二、检验所需培养基n10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤氯化钠胰酪胨大豆肉汤 n7.5%氯化钠肉汤氯化钠肉汤n血琼脂平板血琼脂平板nBaird-Parker 琼脂平板琼脂平板n脑心浸出液肉汤脑心浸出液肉汤(BHI)n兔血浆兔血浆n磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液n营养琼脂小斜面营养琼脂小斜面n革兰氏染色液革兰氏染色液n无菌生
31、理盐水无菌生理盐水 三、检验程序nGB 4789.10-2010标准标准n第一法第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验；适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验；n第二法第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数；色葡萄球菌的计数；n第三法第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。第一法第一法检样检样25g样品样品+225ml 7.5%NaCl肉汤或肉汤或 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤氯化钠胰酪胨大豆肉汤血平板血平板36124hr
32、镜镜检检营养肉汤营养肉汤血浆凝固酶血浆凝固酶实验实验报告结果报告结果36124hr36124hr3616hrBP平板平板第一法第一法 第二法第二法 Baird-Parker平板法检验程序平板法检验程序 适用于检测金黄色适用于检测金黄色葡萄球菌数不小于葡萄球菌数不小于10/g（mL）的食品）的食品25g样品样品+225ml生理盐水生理盐水 选三个连续梯度，每个梯度分别取选三个连续梯度，每个梯度分别取1mL接种之至表面接种之至表面干燥的干燥的BP平板（如平板（如0.4mL，0.3mL，0.3mL）平板计数（分别记录每种平板计数（分别记录每种类型的菌落数）类型的菌落数）36148hr镜镜检检营养肉汤
33、营养肉汤血浆凝固酶实验血浆凝固酶实验报告结果报告结果金葡菌数金葡菌数/g(mL)每种类型至少选取一个菌落每种类型至少选取一个菌落36124hr3616hr适用于检测金黄色葡萄适用于检测金黄色葡萄球菌数球菌数不小于不小于10/g（mL）的食品的食品梯度稀释梯度稀释第三法第三法 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌MPN检验程序检验程序 25g样品样品+225ml生理盐水生理盐水 选三个连续梯度，每个梯度各取选三个连续梯度，每个梯度各取3mL加入加入3管胰酪胨大豆肉汤管胰酪胨大豆肉汤36145-48hrBP平板平板血浆凝固酶血浆凝固酶实验实验查查MPN表表36145-48h 报告结果报告结果 适用于检测可
34、能含适用于检测可能含有有少量少量金黄色葡萄金黄色葡萄球菌，却带有球菌，却带有大量大量竞争菌竞争菌的样品的样品梯度稀释梯度稀释第三法第三法 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌MPN检验程序检验程序 金黄色葡萄球菌的检测金黄色葡萄球菌的检测测定方法测定方法n国标方法注意事项国标方法注意事项n现象观察：染色镜检（形态、现象观察：染色镜检（形态、染色染色）n 表面光滑的菌落，菌落色素不稳定，但多数为金黄色。表面光滑的菌落，菌落色素不稳定，但多数为金黄色。n Baird-Parker琼脂平板（琼脂平板（BP平板平板）、血平板血平板、血浆凝固血浆凝固酶试验酶试验n 多数产肠毒素的菌株在多数产肠毒素的菌株在血琼脂
35、平板上能形成溶血圈血琼脂平板上能形成溶血圈，并能，并能产产生血浆凝固酶生血浆凝固酶，这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的，这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。重要指标。四、操作方法 1.增菌培养法（1）检样处理检样处理 将将25g（mL）检样加于检样加于225mL灭菌生灭菌生理盐水中理盐水中的灭菌器内，制成的灭菌器内，制成1：10检样混悬液。检样混悬液。（2）增菌增菌培养培养 吸取液体检样吸取液体检样5ml，接种于，接种于50mL75氯化钠肉汤氯化钠肉汤50ml进行增菌进行增菌。（3）分离培养分离培养 将上述培养物，分别划线接种到将上述培养物，分别划线接种到 Baird-Parker 平板和
36、血平板平板和血平板。血平板血平板 36 1 培养培养 18 h24 h。Baird-Parker 平板平板 36 1 培养培养 18 h24 h 或或 45 h48 h。检测步骤-增菌 利用金黄色葡萄球菌利用金黄色葡萄球菌耐盐耐盐的特性（可耐受的特性（可耐受15%的的氯化钠），用含氯化钠），用含7.5%氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或10%氯化钠氯化钠胰酪胨大豆肉汤胰酪胨大豆肉汤（4）观察菌落形态）观察菌落形态 Baird-Parker 平板平板、血平板上挑取血平板上挑取可疑可疑菌落菌落。金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker 平板上，菌落直径平板上，菌落直径为为 2 mm3 mm
37、，颜色呈灰色到黑色，边缘为，颜色呈灰色到黑色，边缘为 淡色，周淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。类似菌落；但无混浊带及透明圈。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。血圈。检测步骤-分离 BP平板平板：胰蛋白胨胰蛋白胨、牛肉膏牛肉膏和和酵母膏酵母膏提供碳
38、源、氮源、提供碳源、氮源、硫、维生素和痕量矿物元素硫、维生素和痕量矿物元素丙酮酸钠丙酮酸钠是一种生长促进剂是一种生长促进剂亚碲酸盐亚碲酸盐对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄的菌株有毒性，并使菌落产生黑色黄的菌株有毒性，并使菌落产生黑色卵黄卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环提供营养和有利于观察卵磷脂环甘氨酸甘氨酸和和氯化锂氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的其它对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。菌株有抑制作用。BairdParker氏培养基氏培养基-成分成分 胰蛋白胨胰蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g酵母膏酵母膏 1g丙酮酸钠丙酮酸钠 10g甘氨酸甘氨酸 12g氯化
39、锂氯化锂(LiCl6H2O)5g琼脂琼脂 20g蒸馏水蒸馏水 950mLPH7.5 BairdParker氏培养基氏培养基-增菌剂增菌剂的配法的配法 30%卵黄盐水卵黄盐水50mL与除菌过滤的与除菌过滤的1%亚蹄酸亚蹄酸钾溶液钾溶液10mL混合，保存于冰箱内。混合，保存于冰箱内。BairdParker氏培养基氏培养基-制法制法 将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解。冷至25，校正pH。分装每瓶95mL，121高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，冷至50，每95mL加入预热至50的卵黄亚蹄酸钾增菌剂5mL，摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h。检测步骤-
40、分离 在在BP平板上其典型菌落为：圆形，光滑突起，湿润，平板上其典型菌落为：圆形，光滑突起，湿润，直径直径2-3mm，颜色呈灰色到黑玉色，边缘常为淡色，颜色呈灰色到黑玉色，边缘常为淡色（米黄色或灰白色略带灰色或黄色的白色），周围为（米黄色或灰白色略带灰色或黄色的白色），周围为一混浊带，在其外缘常有一透明圈。用接种针接触菌一混浊带，在其外缘常有一透明圈。用接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感。落似有黄油树胶的粘稠感。偶然会遇到不分解脂肪菌株，除无混浊带及透明圈外，偶然会遇到不分解脂肪菌株，除无混浊带及透明圈外，其他外观基本相同。其他外观基本相同。B-P平板BairdParker(BP培养基培养基/
41、贝尔德帕克平板贝尔德帕克平板)用于凝固酶阳性葡萄球菌的分离和菌落计数用。用于凝固酶阳性葡萄球菌的分离和菌落计数用。￥7（90mm)BairdParker平板是一种选择性培养基，在含有氮源的基础上，补充了促进细菌生长的丙酮酸钠，又含有抑制剂：亚碲酸钾，故有较好的选择性。但对于金葡萄球菌没有抑制，其能将亚碲酸钾还原为碲在菌落中心呈黑色，易于观察；加入卵黄，由于卵磷酯酶阳性特征，其菌落周围可出现一明显的沉淀环，以资区别。根据菌落形态，作出相应的处理或报告。例如：金黄色葡萄球菌呈圆形、有光泽隆起，中部黑色，边缘灰色有微透明的浑浊带；革兰阳性杆菌呈棕黑色，无光泽有时在培养48h后也出现浑浊带；酵母菌为白
42、色无透明环。血平板血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在血平板上产生明显的溶血环。因此在血平板上产生明显的溶血环。血平板上其血平板上其典型菌落典型菌落呈金黄色，有时也为呈金黄色，有时也为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血圈。滑，有溶血圈。血平板血平板（5）革兰氏染色镜检革兰氏染色镜检（6）血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验 挑取挑取Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落平板或血平板上可疑菌落 1 个或以上，分别个或以上，分别接种到接种到 5 mL BHI 和营养琼脂斜面，和营养琼脂斜面，36 1 培养培养
43、 18 h24 h。取新鲜配置兔血浆取新鲜配置兔血浆 0.5 mL，放入小试管中，再加入，放入小试管中，再加入 BHI 培养物培养物 0.2 mL0.3 mL，振荡摇匀，置，振荡摇匀，置 36 1 温箱或水浴箱内，每半小温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察时观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用
44、商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI，36 1 培养培养 18 h48 h，重复试验。，重复试验。检测步骤-鉴定 金黄色葡萄球菌可以产生金黄色葡萄球菌可以产生凝固酶凝固酶，因此对其，因此对其鉴别的主要实验是测定其凝固酶。鉴别的主要实验是测定其凝固酶。对于凝固不完全的菌株，可以通过一些其他对于凝固不完全的菌株，可以通过一些其他实验来进一步实验来进一步确认确认，例如：厌氧葡萄糖发酵、溶，例如：厌氧葡萄糖发酵、溶葡萄球菌酶敏感性实验、耐热核酸
45、酶实验等。葡萄球菌酶敏感性实验、耐热核酸酶实验等。所有这些实验不能作为鉴别其产毒与否的依据。所有这些实验不能作为鉴别其产毒与否的依据。血浆凝固酶试验：吸取吸取1:4新鲜兔血浆新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，放入小试管中，再加入培养再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物养物0.5mL，振荡摇匀，置，振荡摇匀，置361温箱或水浴温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现，如呈现凝块凝块,即将试管倒置或即将试管倒置或倾斜时，呈现凝块者，被认为倾斜时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及阳性结果。同时以已
46、知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。肉汤作为对照。n血浆凝固酶试验 n血浆凝固试验也可采用玻片法。把兔血浆滴加于载玻片的一端，然后用白金耳挑取菌落与血浆充分混匀、在载玻片另一端以生理盐水代替血浆做阴性对照。混合后立即观察，若出现凝块即为阳性。n病原性葡萄球菌多数产生血浆凝固酶，非病原性的一般不产生。因此，该法是判定葡萄球菌有无致病性的重要指标。血浆凝固酶试验的原理血浆凝固酶试验的原理 病原性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使血浆中纤维蛋白原变病原性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使血浆中纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白，附于细菌表面，生成凝块，因而具有抗为不溶性纤维蛋白，附于细菌表面，生成凝块，因而具有抗吞
47、噬的作用。凝固酶试验对于判定该菌株是否具有致病力，吞噬的作用。凝固酶试验对于判定该菌株是否具有致病力，很有帮助。葡萄球菌凝固酶试验被广泛地用于常规鉴定金黄很有帮助。葡萄球菌凝固酶试验被广泛地用于常规鉴定金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌。色葡萄球菌与其他葡萄球菌。葡萄球菌所产生的凝固酶有两种：结合凝固酶和游离凝固酶。葡萄球菌所产生的凝固酶有两种：结合凝固酶和游离凝固酶。结合凝固酶（即凝聚因子）：是一种结合于菌体细胞壁的酶，结合凝固酶（即凝聚因子）：是一种结合于菌体细胞壁的酶，它直接作用于血浆中纤维蛋白原，使之变成纤维蛋白，而使它直接作用于血浆中纤维蛋白原，使之变成纤维蛋白，而使葡萄球菌凝集成块，玻片
48、法阳性结果是由此酶（凝聚因子）葡萄球菌凝集成块，玻片法阳性结果是由此酶（凝聚因子）所致。所致。游离凝固酶：是凝血酶原样物质，不直接作用于血浆纤维蛋游离凝固酶：是凝血酶原样物质，不直接作用于血浆纤维蛋白原上，而被血浆中的致活剂（即凝固酶致活因子）激活后，白原上，而被血浆中的致活剂（即凝固酶致活因子）激活后，变成耐热的凝血酶样物质，此物质可使血浆中的液态纤维蛋变成耐热的凝血酶样物质，此物质可使血浆中的液态纤维蛋白原变为固态纤维蛋白，从而使血浆凝固。试管法的阳性结白原变为固态纤维蛋白，从而使血浆凝固。试管法的阳性结果为此酶所致。果为此酶所致。【方法】【方法】（1）玻片法）玻片法 （2）试管法）试管法
49、【结果判断】【结果判断】（1）玻片法：）玻片法：510s内出现凝集者为阳性。内出现凝集者为阳性。（2）试管法：如有凝块或整管凝集出现为阳）试管法：如有凝块或整管凝集出现为阳性。性。4h后无上述现象出现，则放置过夜后再后无上述现象出现，则放置过夜后再观察。观察。【应用】【应用】本试验仅用于致病性葡萄球菌的鉴定。本试验仅用于致病性葡萄球菌的鉴定。【方法】【方法】（1）玻片法：在）玻片法：在1张洁净玻片中央加张洁净玻片中央加1滴滴9gL氯化钠氯化钠(生理生理盐水盐水)溶液，用接种环取待检培养物与其混合（设阳性和阴性溶液，用接种环取待检培养物与其混合（设阳性和阴性对照）对照）制成菌悬液，若经制成菌悬液
50、，若经1020s 内无自凝现象发生，则加内无自凝现象发生，则加入兔新鲜血浆入兔新鲜血浆1环，与菌悬液混合，观察结果。环，与菌悬液混合，观察结果。（2）试管法：用生理盐水将新鲜兔血浆）试管法：用生理盐水将新鲜兔血浆4倍稀释，取倍稀释，取05 ml于试管再加于试管再加0.5ml待测菌浓菌悬液（需做阳性对照及阴性待测菌浓菌悬液（需做阳性对照及阴性对照。），混匀后置对照。），混匀后置37水浴中，每水浴中，每30min观察观察1次结果。次结果。若若3小时内试验管和阳性对照管出现凝固，阴性对照管（即小时内试验管和阳性对照管出现凝固，阴性对照管（即浓菌液管）不凝固，为阳性；若阴性，继续观察到浓菌液管）不凝固
