1、感染性疾病的微生物学诊断2了解了解临床微生物临床微生物学在感染性疾病中学在感染性疾病中的应用的应用熟悉熟悉常用的临床微生物常用的临床微生物学学检测技术检测技术熟悉熟悉抗菌药物敏感实验抗菌药物敏感实验原理及准则原理及准则掌握掌握细菌耐药细菌耐药机制及常见耐药表型机制及常见耐药表型教学目标教学目标3一、临床微生物的应用一、临床微生物的应用4Case study（1）n女性，73岁，因手背部伤口不愈合来我院就诊；n自述21天前被自家狗咬伤；n外院门诊行清创术后5天，伤口内仍有脓性分泌物；n初步诊断：手背狗咬伤，手背感染；n初步治疗方案：盐酸头孢替安+硫酸依替米星联合抗感染治疗。n入院后行清创术，采集
2、脓性分泌物进行培养n第一次培养结果：普通细菌培养：多杀巴斯德菌；厌氧培养：未生长；治疗前治疗前6Pasteurella multocida is a Gram-negative,nonmotile,coccobacillus belonging to the Pasteurellaceae family.It can cause avian cholera in birds and a zoonotic infection in humans,which typically is a result of bites or scratches from domestic pets.Many ma
3、mmals and fowl harbor it as part of their normal respiratory microbiota,displaying asymptomatic colonization.n第二次培养结果：普通细菌培养：多杀巴斯德菌；厌氧培养：产黑普雷沃菌、梭杆菌梭杆菌梭杆菌 产黑普雷沃菌产黑普雷沃菌Anaerobic，Gram-negative bacteria8n药敏实验：多杀巴斯德菌:阿奇霉素 S 厌氧菌：甲硝唑 Sn治疗：阿奇霉素+甲硝唑磷酸二钠治疗n预后：经20余天治疗，患者病情平稳，皮肤向伤口内陷，无异常脓性分泌物。治治疗疗后后9Question该病例
4、应用了何种微生物检测技术？10Case study（2）n男性，45岁，自诉8小时前自3米高处坠落，致左肘及左腕部肿痛畸形，左腕部开放流血；n外院行左腕伤口清创缝合术；n为进一步治疗收入我院；n初步诊断：左尺、桡骨远端开放性骨折，左尺神经损伤。11n入院第一天，患者左手部活动感觉较前减退，查房完全松开石膏绷带，左腕部缝合创口未见红肿及渗出，毛细血管充盈试验正常，入院后给予消肿药物和抗生素预防感染治疗。n入院第二天和第三天，患者体温升高，最高达39，患部肿胀和入院时没有明显变化，继续对症观察治疗。n入院第四天及以后，发现左手腕部出现大小水泡，前臂远端及手指皮肤青紫，手部感觉减退，决定手术切开检查
5、。术中穿刺水泡内容物，发现液体黑暗、张力高、有恶臭味，涂片送检并取样进行细菌培养。n分泌物涂片结果：见到革兰阳性的粗大杆菌n分泌物厌氧培养：产气荚膜梭菌 治疗前治疗前13 产气荚膜梭菌产气荚膜梭菌Clostridium perfringens(formerly known as C.welchii)is a Gram-positive,rod-shaped,anaerobic,spore-forming bacterium of the genus Clostridium.C.perfringens grows readily on blood agar plate in anaerobic
6、conditions and often produces a zone of hemolysis.14nC.perfringens is ever present in nature and can be found as a normal component of decaying vegetation,marine sediment,the intestinal tract of humans and other vertebrates,insects,and soil.nClostridium perfringens is the most common bacterial agent
7、 for gas gangrene,which is necrosis,putrefaction of tissues,and gas production.It is caused primarily by Clostridium perfringens alpha toxin.The gases form bubbles in muscle(crepitus)and the characteristic smell in decomposing tissue.After rapid and destructive local spread(which can take hours),sys
8、temic spread of bacteria and bacterial toxins may result in death.This is a problem in major trauma and in military contexts.15Question 以上两个病例的共同点，遇到类似患者应重视何种细菌的培养？16n深部外伤如车祸、挤压伤后，人或动物咬伤后的继发感染，均可能合并厌氧菌感染。n分泌物有恶臭，或为暗血红色，并在紫外光下发出红色荧光，均可能是厌氧菌感染。n感染组织局部产生大量气体：某些厌氧菌可产生大量气体，造成组织肿胀和坏死，皮下有捻发音，通常是产气荚膜梭菌感染的特征
9、。17Case study（3）n女性，3岁，因左髋活动受限，疼痛4天，发热4天入院；n检查：最高到T 39；WBC:13.64109/L，N:86.8%；CRP和ESR均升高n既往史：1年前于外院行左腹股沟囊肿切除术；n诊断：髋关节急性化脓性关节炎（左）；n治疗：1、行左髋关节穿刺术，脓液培养 2、头孢曲松（罗氏芬）抗感染治疗18n穿刺液培养：沙门菌属（Salmonella）19药敏：亚胺培南（泰能）：S20Question从该病例中你得到了什么启示？21Case study（4）女性，73岁，2012年6月8日入院；诊断：腰椎术后20天，伤口感染；入院后持续发热，最高到T：39；检查：胸片
10、：双肺胸腔积液；WBC:13.64109/L，N:86.8%；CRP:123mg/L(正常值8 mg/L)；ESR:46mm；PCT:0.72ng/mL(正常值0.1ng/mL)；G实验：77.5pg/mL (正常值10pg/mL)；治疗：万古霉素+头孢哌酮/舒巴坦抗感染,治疗效果不佳n痰涂片：上皮细胞25/LPF；G-杆菌（+）；类酵母菌（），假菌丝(+)23 痰培养：白色念珠菌光滑念珠菌铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌 尿培养：白色念珠菌 便培养：白色念珠菌、光滑念珠菌 分泌物培养：屎肠球菌 血培养：荧光假单胞菌24Question从该病例中你得到了什么启示？25n有念珠菌感染的危险因素：有念珠菌
11、感染的危险因素：n恶性肿瘤恶性肿瘤n长期卧床、营养差长期卧床、营养差n插尿管插尿管n广谱抗生素广谱抗生素n抗真菌治疗抗真菌治疗26二、常用的临床微生物检测技术二、常用的临床微生物检测技术27n细菌染色细菌染色 革兰染色；抗酸染色；墨汁染色n细菌培养细菌培养+鉴定鉴定+药敏药敏 普通培养；厌氧培养n真菌培养真菌培养+鉴定鉴定+药敏药敏n血清学实验血清学实验 28 临床常见微生物标本培养临床常见微生物标本培养n血标本培养 n呼吸道标本培养n尿及生殖道标本培养n粪便标本培养n脓液及分泌物标本培养n无菌体液标本培养（脑脊液、关节液、胸腹水等）n厌氧标本培养29n血液感染是一种危重的全身感染，对其进行病
12、原菌的检验，提供病原学的诊断极为重要。n血培养是诊断菌血症的基本而重要的方法，若从患者血液中检出细菌，一般视为感染，提示有菌血症。n继发性感染 血培养血培养 Blood Culture30“只有在发热时，才需要进行血培养。”血培养指征血培养指征想采就采想采就采31怀疑血流感染或脓毒血症时，应常规做血培养怀疑血流感染或脓毒血症时，应常规做血培养 血流感染血流感染的症状及的症状及指征包括指征包括低血压或高血压低血压或高血压WBC/CRP/PCTWBC/CRP/PCT的升高的升高严重的局部感染严重的局部感染心率、呼吸频率异常加快心率、呼吸频率异常加快不明原因的发烧或体温过低不明原因的发烧或体温过低休
13、克、寒战，僵直休克、寒战，僵直32“何时采血进行血培养，无特殊时间要求。”采血时机采血时机33Time(min)体温体温03060菌血症水平菌血症水平Chills寒战寒战Blood Cultures血培养血培养34“为减轻患者痛苦，只采一份血液标本即可。”采血套数采血套数35血培养套数与阳性检出率血培养套数与阳性检出率（）6580969936“每瓶采集多少血液无特殊要求。”采血量采血量37 导致血流感染的G-菌、G+菌、厌氧菌及真菌，其血培养的阳性率均与采血体积相关阳性率阳性率标准体积：采血量为8-10ml,平均8.7ml;低体积：采血量3.5ml;平均2.7mlMermel LA,et al
14、.Ann Intern Med.1993;119:270-272.导管相关血流感染导管相关血流感染（CRBSI）nCatheter related blood stream infectionn中心静脉导管中心静脉导管:通常通常选择选择锁骨下静脉锁骨下静脉、颈、颈内静脉和股静脉。内静脉和股静脉。n经外周静脉置入中心经外周静脉置入中心静脉导管（静脉导管（PICCPICC）：）：通常选择肘部的通常选择肘部的贵要贵要静脉静脉、正中静脉和头、正中静脉和头静脉。静脉。实验室（保留导管）n一般情况取两份血，一套来自外周静脉，另一套来自导管内，两份血源的采血时间应接近且同时送检。实验室（不保留导管）n从独立
15、的外周静脉采两套血，同时在无菌状态下取出导管，剪下导管尖端5cm或近心端，一并送细菌室培养。41n下呼吸道感染是最常见的呼吸道感染症，主要指肺实质性炎症的肺炎和支气管黏膜炎症的支气管炎，是我国常见病和病死率高的感染性疾病。n痰标本的细菌学检查对呼吸道感染的诊断有重要意义。n支气管肺泡灌洗液（PBAL)n支气管毛刷 呼吸道标本培养呼吸道标本培养 Respiratory Culture42送检指征送检指征n下呼吸道感染患者可有发热、咳嗽和咳痰，痰呈脓性、粘稠或血性，可伴有胸痛、气急甚至呼吸困难，肺部可闻及湿啰音。n白细胞总数和中性粒细胞比例明显增高。nX线检查肺部有炎症性浸润或胸腔积液等。43n采
16、集时间：痰：一般以晨痰为好n采集方法：自然咳痰法：清水反复漱口后，用力咳出呼吸道深部的痰，将痰液直接吐入无菌容器中，标本量应2ml；无痰可用3-5NaCl 5ml雾吸约5min导痰 标本采集标本采集4445n尿路感染：指大量微生物在尿路中生长繁殖而引起的尿路炎症。为最常见的感染性疾病，发病率约占人口的2%。多见于成年女性。n尿路感染需要明确部位和急性与慢性，主要依病原菌检测。尿培养尿培养 Urine Culture46送检指征送检指征n尿频、尿急、尿痛、排尿困难和耻骨上压痛n肉眼脓尿或血尿n尿常规检白细胞和（或）亚硝酸盐阳性n留置导尿管的患者出现发热n膀胱排空功能受损，有尿潴留47n采集时间：
17、晨起第一次尿液为佳n采集方法：中段尿采集法：女性：成年女性外阴部先以肥皂水清洗，再以无菌水冲洗，然后排尿弃去前段尿，留取中段尿10ml左右于无菌试管内送检；男性：先用肥皂水清洗尿道口，后用清水冲洗，留取中段尿 标本采集标本采集48 注意事项：注意事项：无菌导尿管采集尿液，应在排出15ml尿液后收集标本，但导尿容易引起逆行性感染留置导尿管采尿，应先以75%酒精消毒导管口，用无菌注射器收集5-10ml尿，长期留置导尿管患者，应在更换新尿管时留取尿标本生殖道（生殖道（Genital tract)Genital tract)标本标本：（1）子宫内分泌物：采集时避免阴道和宫颈口正常菌群污染（2）盆腔脓肿
18、：用无菌注射器从子宫直肠凹陷处抽取脓液（3）前列腺液：按摩前列腺采集标本或前列腺活检组织做细菌培养注：怀疑淋球菌感染，取材标本应注意保温并及时送检4950n入院诊断不是胃肠炎的患者不做常规粪便培养。n一次粪便培养阴性不能完全排除胃肠道病原菌的存在。n腹泻病人在发病早期（6h）内采集到的血便或液状便的效果最好。n便培养主要针对感染性腹泻，如霍乱、沙门、志贺菌、副溶血弧菌等，住院3天以上发生抗生素相关性腹泻患者进行常规培养意义不大，可进行肠道菌群检测或难辨梭菌毒素检测。粪便培养粪便培养 Stool Culture51送检指征送检指征n便涂片镜检白细胞5个/HPn重症腹泻n血便、脓液便n未经抗生素治
19、疗的持续性腹泻52标本采集标本采集n用药前自然排便，采集脓血、黏液部分23g。n外观无异常的粪便应从粪便的表面不同部位取材。n液体便取絮状物12ml,置无菌容器内送检。n如排便困难或婴幼儿患者，可用直肠拭子法采集标本。5354n由创伤、手术、侵入性器械操作等外科治疗引起的感染最为常见。细菌造成伤口感染一般认为需每克组织内细菌数量在105 106个以上。脓液及分泌物培养脓液及分泌物培养 Wound and Abscess Culture55送检指征送检指征n手术部位感染n皮肤软组织感染和烧伤感染n骨骼感染：骨髓炎、椎间盘感染56标本采集标本采集 n开放性脓肿：无菌盐水或70%乙醇擦去表面渗出物，
20、尽可能抽吸或将拭子深入伤口，用拭子深入溃疡基地部或边缘部，采集两个拭子分别做培养和革兰氏涂片染色。n封闭性脓肿：消毒局部皮肤或粘膜表面后，用注射器抽取，将脓液注入无菌试管内送检。57n大面积烧伤的创面分泌物：用无菌棉拭子取多部位创面的脓液或分泌物，置无菌试管内送检。由于烧伤的早期创面是无菌的，通过12小时才可出现大量细菌，因此在烧伤后12小时内，勿采集创面的标本，否则不能获得阳性结果。58n厌氧菌分布十分广泛，是体内正常菌群的组成成员，多为条件致病菌；厌氧菌感染遍及临床各科，且多为混合感染 厌氧培养厌氧培养 Anaerobic Culture59标本采集与运送标本采集与运送n标本的采集与运送是
21、否适当，对厌氧菌培养能否成功至关重要。n采取标本时应尽量避免接触空气，多使用针筒抽取，减少标本与空气接触的机会。n一般情况下，应从无正常菌群寄居的部位采取标本。60 无菌体液培养无菌体液培养Sterile body fluid culturen脑脊液、关节液、腹胸水、滑膜液、羊水、胆汁等培养标本。n这些均由临床医生采样，采样后根据标本外观选择培养。明显炎性的标本可直接注入无菌容器中送检，清或轻度混浊的标本可按血培养方法操作。61三、抗菌药物敏感实验三、抗菌药物敏感实验62抗菌药物敏感实验抗菌药物敏感实验 测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为抗菌药物敏感性实验（Antimi
22、crobial Susceptibility Test），简称药敏实验（AST）。63药敏实验的意义药敏实验的意义n预测抗菌治疗的效果；n指导抗菌药物的临床应用；n发现或提示细菌耐药机制的存在，能帮助临床医生选择合适的药物，避免产生或加重细菌的耐药；n监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握耐药菌感染的流行病学，以控制和预防耐药菌感染的发生和流行。64药敏实验的标准化药敏实验的标准化nCLSI：美国实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute)n每年修订更改n包括质控n新药的判定标准n特殊耐药性的检测65敏感性分类敏感性分类n敏感（S
23、usceptible，S）n用常规用量治疗有效n常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的MIC 5倍以上。n耐药（Resistance,R）n用常规用量治疗不能抑制细菌的生长nMIC高于药物在血、体液中可能达到的浓度66n中介(Intermediate,I)nMIC接近血、体液中药物的浓度，治疗反应率低于敏感株n药物生理浓集部位有效 n加大用药剂量可能有效n缓冲区：防止操作的系统误差造成重大结果的判定错误n剂量依赖敏感（Susceptible-dose dependent,SDD)n高剂量使用该药仍然安全时，高剂量给药可能有效67纸片琼脂扩散法（Kirby-Bauer，KB法），半定量检测方法检
24、测方法-1-168nMIC法（minimal inhibitory concentration)n稀释法(肉汤、琼脂)n自动化仪器法n抗生素连续梯度法(E-test)n单位(ug/ml)检测方法检测方法-2-269n肉汤稀释法：以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进行一系列不同倍数稀释（通常为双倍稀释），经培养后观察其最低抑菌浓度。70 自动化仪器检测美国美国BD公司公司 phoenix 100生物梅里埃公司生物梅里埃公司 VITEK AMS6071E test 法72四、细菌的耐药四、细菌的耐药737475多重耐药菌株全球广泛流行多重耐药菌株全球广泛流行 Gram-negative E
25、nterobacteriaceae with resistance to carbapenem conferred by New Delhi metallo-lactamase 1(NDM-1)are potentially a major global health problem.superbug76细菌耐药原因细菌耐药原因-“成也萧何败也萧何成也萧何败也萧何”n抗生素的筛选和诱导作用n耐药菌传播速度增加n农业、渔业和家禽养殖业中抗生素的添加77个别细菌耐药xx耐药菌为主抗生素暴露 xxxxxxxxxx78固有耐药性固有耐药性(intrinsic resistance)n指细菌对某种抗菌药
26、物的天然耐药性。n来源于该细菌本身染色体上的耐药基因,代代相传,具有典型的种属特性。n如，肠道杆菌对青霉素，铜绿假单胞菌对氨苄西林以及链球菌属对氨基糖苷类药物都属于固有耐药性。细菌的耐药性细菌的耐药性79获得耐药性获得耐药性(acquired resistance)n是指细菌DNA的改变导致其获得耐药性表型。n原先对药物敏感的细菌群体出现了对抗菌药物的耐药性n多由质粒介导的耐药性。n方式：transformation，transduction，conjugation，transposition81 常见耐药表型及耐药菌常见耐药表型及耐药菌n-内酰胺酶(-lactamases)n超广谱-内酰胺酶
27、(extended-spectrum-lactamases)n耐甲氧西林葡萄球菌（methecillin resistance staphylococcus，MRS）n氨基糖苷类抗生素高耐药肠球菌(high-level aminoglycoside resistance strains to enterococcus)n耐青霉素肺炎链球菌(penicillin resistance ,PRSP）82 常见耐药表型常见耐药表型n-内酰胺酶(-lactamases)：细菌产生的-内酰胺酶能水解-内酰胺类抗生素的-内酰胺环使酰胺键断裂而失去抗菌活性。n临床意义：-内酰胺酶阳性表面被检测菌株对青霉素、
28、氨苄西林、阿莫西林等耐药，临床用这些药物治疗无效。83 常见耐药表型常见耐药表型n超广谱-内酰胺酶(extended-spectrum-lactamases，ESBLs)：是一种水解青霉素、头孢菌素及单环类抗菌药物的酶。主要有大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、奇异变形杆菌。n临床意义：检出产ESBLs菌株对所有青霉素类、头孢菌素及单环类抗菌药物耐药，临床治疗无效。84常见耐药菌常见耐药菌耐甲氧西林葡萄球菌（methecillin resistance staphylococcus，MRS）：MRSA和MRSE临床意义：MRS对-内酰胺类抗生素耐药和对-内酰胺类抗生素/-内酰胺酶抑制剂复合
29、物均耐药。85 VRE(Vancomycin-Resitant Enterococci)万古霉素耐药的肠球菌 86 PRP(Penicillin-Resistant S、P)青霉素耐药的肺炎球菌 87 产ESBL(Extended-Spectrum B-lactamse)酶(大肠/肺克)88 Multidrug-resistant non-Fementatives(非发酵菌)铜绿、不动、嗜麦芽899091929394 总总 结结n重视临床微生物学诊断在感染性疾病中的重要性，从感染患者中分离的致病菌必须进行药敏试验和耐药性检测n为有效控制感染，必须根据药敏结果和耐药表型选择抗生素，合理应用抗生素 思考题思考题 袁某某，男，16岁，中学生。打球时右拇指皮肤外伤感染，当时未予以重视，1日后出现高热（40），血压下降至9.3/6.6kPa,伴呼吸困难，低氧血症，白细胞36109/L，中性粒细胞比例95%，同时出现急性肾功能衰竭和DIC，即入ICU救治。通过该病例，分析应该患者采取何种病原学检测方式及其相关注意事项。
