1、0102结核病实验室检查及意义结核病实验室检查及意义目录目录01.01.分枝杆菌概述分枝杆菌概述02.02.结核病实验室检查结核病实验室检查03.03.小结小结2分枝杆菌概述分枝杆菌概述013分枝杆菌属分类分枝杆菌属分类结核分枝杆菌(M.tuberculosis)非结核分枝杆菌（NTM）麻风分枝杆菌（M.leprae）4结核分枝杆菌的发现结核分枝杆菌的发现1882年年 德国柯赫医生发现结核致病菌德国柯赫医生发现结核致病菌-结核杆菌结核杆菌5结核杆菌的变迁结核杆菌的变迁1897年提出结核病的飞沫传播年提出结核病的飞沫传播1922年，卡介苗为预防结核病年，卡介苗为预防结核病首次对新生儿接种首次对新
2、生儿接种1945年，链霉素的问世使肺结年，链霉素的问世使肺结核不再是不治之症。核不再是不治之症。6结核分枝杆菌结核分枝杆菌特点特点(M.tuberculosis)生物学主要特点：生物学主要特点：1.细胞壁中含有大量细胞壁中含有大量脂质脂质2.引起的疾病都呈引起的疾病都呈慢性慢性并伴肉芽肿并伴肉芽肿3.抗酸染色阳性抗酸染色阳性7结核病结核病+由结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病由结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病8结核病结核病临床表现临床表现症症 状状 体体 征征 1.全身症状：消瘦、全身症状：消瘦、盗汗、低热、乏力盗汗、低热、乏力2.呼吸系统症状：咳呼吸系统症状：咳嗽、约嗽、约1/3咯血咯血3结核
3、变态反应表现结核变态反应表现因肺结核好发于因肺结核好发于肺上叶尖后段及肺上叶尖后段及下叶背段，故锁下叶背段，故锁骨上下、肩胛间骨上下、肩胛间区叩诊音浊区叩诊音浊9结核病发病机制结核病发病机制起始期起始期细胞外增殖期和传播期细胞外增殖期和传播期共生期共生期T T细胞反应期细胞反应期10结核病发病机制结核病发病机制结核分枝杆菌通过飞沫进入呼吸道，被肺泡巨噬细胞吞噬杀灭结核分枝杆菌通过飞沫进入呼吸道，被肺泡巨噬细胞吞噬杀灭，不不留任何痕迹和感染证据。留任何痕迹和感染证据。特点：不存在结核杆菌复制，不存在免疫周围细胞的免疫应答特点：不存在结核杆菌复制，不存在免疫周围细胞的免疫应答起始期起始期结核分枝杆
4、菌在体内复制，形成感染灶，结核分枝杆菌在体内复制，形成感染灶，由由T T细胞介导的细胞免细胞介导的细胞免疫和迟发型变态反应，进一步清除细菌。疫和迟发型变态反应，进一步清除细菌。特点：激活体内免疫反应特点：激活体内免疫反应（CMICMI和和DTHDTH），宿主获得抗结核抵抗力），宿主获得抗结核抵抗力反应期反应期11结核病发病机制结核病发病机制 在在低氧、低氧、低低pHpH、抑制性脂肪酸和宿主免疫机制共同作用下抑制细菌的增殖。、抑制性脂肪酸和宿主免疫机制共同作用下抑制细菌的增殖。结核分枝杆菌未被完全清除，细菌和宿主处于共生状态，结核杆菌主要存结核分枝杆菌未被完全清除，细菌和宿主处于共生状态，结核杆
5、菌主要存在于坏死组织中央在于坏死组织中央。特。特点：可激发和维点：可激发和维持持T T细胞的免疫记忆，在一定条件细胞的免疫记忆，在一定条件下再次发病下再次发病共生期共生期长期休眠的结核细菌在一定条件下，再次增殖，突破宿主免疫屏障长期休眠的结核细菌在一定条件下，再次增殖，突破宿主免疫屏障，引，引起结核起结核病病特点：结核播散特点：结核播散增殖增殖传播期传播期12接触活动性结核病患者接触活动性结核病患者暴露程度不足，结核杆菌被机体免疫力清除暴露程度不足，结核杆菌被机体免疫力清除-没有症状没有症状,结核杆菌仍旧结核杆菌仍旧存在而不能被检测存在而不能被检测 -X-X-光光/CT/CT 扫描显示正常扫描
6、显示正常-没有抗体应答没有抗体应答-诊断困难诊断困难-传统的结核感染检测只有传统的结核感染检测只有 TSTTST（PPDPPD）机体被感染机体被感染受机体免疫力抑制受机体免疫力抑制没有临床症状没有临床症状终身处于感染状态终身处于感染状态潜伏感染潜伏感染有临床症状有临床症状具有传染性具有传染性-结核杆菌可以通过涂片、结核杆菌可以通过涂片、培养检测出培养检测出-胸部的胸部的 X-X-光或光或 CT CT 扫扫描显示异常描显示异常 -肺外结核难以诊断肺外结核难以诊断 (特别是儿童特别是儿童)活动性结核活动性结核5%5%再次激活再次激活活动性结核与潜伏感染活动性结核与潜伏感染13结核病结核病诊断诊断实
7、验室检查实验室检查影像检查影像检查病理检查病理检查+临床临床 指征指征14结核杆菌实验室检查结核杆菌实验室检查02结核诊断结核诊断-临床应用临床应用+几乎所有的临床内科科室都几乎所有的临床内科科室都需要结核的鉴别诊断：需要结核的鉴别诊断：发热待查，结核排筛发热待查，结核排筛结脑的鉴别诊断结脑的鉴别诊断胸腹水患者待查胸腹水患者待查儿童结核儿童结核16结核杆菌结核杆菌结核病结核病实验室检实验室检查查细菌学检查细菌学检查免疫学检查免疫学检查分子生物学检查分子生物学检查分枝杆菌分离培养分枝杆菌分离培养分支杆菌药敏试验分支杆菌药敏试验分枝杆菌菌种鉴定分枝杆菌菌种鉴定体液免疫学诊断体液免疫学诊断细胞免疫学
8、诊断细胞免疫学诊断DNA测序测序DNA探针技术探针技术聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）17结核分枝杆菌结核分枝杆菌-实验室检查实验室检查涂片镜检涂片镜检细菌学检查细菌学检查适用于多种标本；操作简便，价格低廉。适用于多种标本；操作简便，价格低廉。2份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性；份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性；1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+肺部影像学检查符合活动性肺结核表现。肺部影像学检查符合活动性肺结核表现。肺结核治疗评估的主要依据之一肺结核治疗评估的主要依据之一18结核分枝杆菌结核分枝杆菌-实验室检查实验室检查缺点：缺点：不能区别是否为非结核分枝
9、杆菌不能区别是否为非结核分枝杆菌 不能区别死活菌。不能区别死活菌。结核杆菌暴露于异烟肼时，某些条件会失去抗酸性，出现假阴性。结核杆菌暴露于异烟肼时，某些条件会失去抗酸性，出现假阴性。检测灵敏度较低（检测灵敏度较低（104-105 个细菌个细菌/毫升）毫升）。19结核杆菌培养结核杆菌培养细菌学检查细菌学检查+传统方法：传统方法：L-JL-J固体培养基固体培养基+快速培养法快速培养法:检测细菌生长过程中代谢产生的检测细菌生长过程中代谢产生的CO2CO2或消耗的或消耗的O2O2，显微镜直接观察、，显微镜直接观察、变色液体培养基等变色液体培养基等BACTEC MGIT960BACTEC MGIT960
10、系统系统 BACTEC460BACTEC460系统、系统、Bact/ALERT 3DBact/ALERT 3D、ESPESP等。等。痰培养、其他标本培养痰培养、其他标本培养20结核杆菌培养结核杆菌培养阴性培养阴性培养阳性培养阳性培养无或微弱荧光无或微弱荧光FFFO2FO2FO2FO2FO2FFO2FO2CO2O2O2O2O2O2O2O2O2CO2CO2O2FFFFFO2FO2FFFFCO2O2O2O2O2O2强荧光强荧光传感器传感器对氧气高度敏感的钌复合物对氧气高度敏感的钌复合物肉汤肉汤改良改良Middlebrook 7H9肉汤肉汤上部空间上部空间已预先充填已预先充填10%CO221结核杆菌培
11、养结核杆菌培养1 1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+1 1份痰标本结核分枝杆菌培养份痰标本结核分枝杆菌培养 痰涂片阴性，肺部影像学检查符合活动性肺结核影像学表现痰涂片阴性，肺部影像学检查符合活动性肺结核影像学表现+1+1份痰标本结核分枝杆菌培养阳性份痰标本结核分枝杆菌培养阳性用于耐多药结核疗效判定用于耐多药结核疗效判定结核菌培养临床价值结核菌培养临床价值确诊结核确诊结核22抗酸杆菌培养优缺点抗酸杆菌培养优缺点敏感性较直接涂片法高，理论上敏感性较直接涂片法高，理论上10-10010-100条菌条菌/毫升可检出阳性；毫升可检出阳性；特异性较直接涂片法高，可以从菌落
12、生长速度、色素产生初步判断非特异性较直接涂片法高，可以从菌落生长速度、色素产生初步判断非结核分枝杆菌；结核分枝杆菌；分离出具有活力的纯培养物，为进一步药敏试验提供基础。分离出具有活力的纯培养物，为进一步药敏试验提供基础。需时长需时长，根据接种量的大小，一般，根据接种量的大小，一般2-82-8周才能得到肉眼可见菌落。周才能得到肉眼可见菌落。结果受标本保存运送时间、培养基成分和质量、前处理方法等影响，结果受标本保存运送时间、培养基成分和质量、前处理方法等影响，操作操作较直接涂片法较直接涂片法复杂复杂，需经严格培训，需经严格培训 。需培养基凝固灭菌器、离心机、涡旋振荡器、恒温培养箱等需培养基凝固灭菌
13、器、离心机、涡旋振荡器、恒温培养箱等设备设备。成本成本是直接涂片法的是直接涂片法的7-87-8倍。倍。23细胞免疫学检查细胞免疫学检查+结核菌素皮肤试验（结核菌素皮肤试验（PPD试验）试验）+干扰素释放试验（干扰素释放试验（T-SPOT试验）试验）24免疫学检查免疫学检查细胞免疫学检查细胞免疫学检查PPD-PPD-结核菌素试验结核菌素试验迟发型细胞超敏反应迟发型细胞超敏反应1 1）方法：）方法：1:2000 OT1:2000 OT或或PPDPPD液液0.10.1毫升毫升(5(5单位单位)，左前左前臂屈侧中部臂屈侧中部皮内注射，皮内注射，48-72h48-72h测量皮肤测量皮肤硬结硬结的直径的直
14、径。25PPD-PPD-结核菌素试验结核菌素试验2 2）判断标准判断标准：阴性阴性4mm4mm弱阳性弱阳性5-9mm5-9mm阳性阳性10-19mm10-19mm，强阳性强阳性20mm20mm或局部出现水泡与坏死或局部出现水泡与坏死26PPD-PPD-结核菌素试验结核菌素试验3)3)结核菌素试验的意义结核菌素试验的意义阴性阴性：无结核菌感染；不能排除结核感染。：无结核菌感染；不能排除结核感染。阳性阳性：曾有结核感染，并不一定现在患病。：曾有结核感染，并不一定现在患病。强阳性强阳性：活动性结核病可能：活动性结核病可能 A、变态反应尚未建立；、变态反应尚未建立；B、免疫抑制如应用皮质、免疫抑制如应
15、用皮质激素或营养不良等激素或营养不良等27PPD-PPD-结核菌素试验结核菌素试验 PPDPPD所含抗原为致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌及卡介苗菌所含抗原为致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌及卡介苗菌株所共有，其结果受到卡介苗接种及其他分枝杆菌感染的影响，株所共有，其结果受到卡介苗接种及其他分枝杆菌感染的影响，特异性较差特异性较差。当出现免疫功能低下时可出现假阴性结果当出现免疫功能低下时可出现假阴性结果，敏感性低敏感性低。免疫力正常的阴性有一定意义。强阳性有一定意义。有结免疫力正常的阴性有一定意义。强阳性有一定意义。有结核变态反应、淋巴结核强阳性多。核变态反应、淋巴结核强阳性多。经济、简便，可以用于流
16、行病学大规模的筛查和普查，但经济、简便，可以用于流行病学大规模的筛查和普查，但存在着明显的缺陷。存在着明显的缺陷。PPDPPD试验临床价值试验临床价值28T-SPOTT-SPOT实验实验细胞免疫学检查细胞免疫学检查T-SPOTT-SPOT试验原理试验原理结核感染者体内存在特异的效应结核感染者体内存在特异的效应T T淋巴细胞，效应淋巴细胞，效应T T淋巴细胞再次受到淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-IFN-）。）。因此，因此，检测效应检测效应T T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。既用
17、抗体捕获培养中细胞所分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色方式既用抗体捕获培养中细胞所分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色方式将其表现出来。将其表现出来。刺激抗原刺激抗原：ESAT-6ESAT-6蛋白蛋白(早期分泌抗原靶早期分泌抗原靶6）、CFP-10CFP-10蛋白（蛋白（培养滤液蛋白）培养滤液蛋白）由结核分枝杆菌特有的由结核分枝杆菌特有的RD1RD1基因编码基因编码，可刺激活化的效应，可刺激活化的效应T T淋巴细胞产生淋巴细胞产生干扰素。干扰素。RD1RD1基因在基因在BCGBCG以及大部分环境分枝杆菌中缺失。以及大部分环境分枝杆菌中缺失。29T-SPOTT-SPOT试验试验干扰素干扰素检测阴性检测
18、阴性干扰素干扰素检测阳性检测阳性TB抗原多肽T细胞活化T细胞 干扰素30T-SPOT步骤步骤31T-SPOTT-SPOT灵敏度灵敏度ReferenceSensitivity Jafari et al 2006 AJRCCM 174;9:1048-53100.0%(12/12)Ferrara et al Lancet 2006 376;1328-34*83.3%(20/24)Lee et al Eur Respir J 2006 28;24-30*96.6%(84/87)Goletti et al Clin Microbiol Infect 2006 12;6:544-50*91.3%(21/2
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23、结核患者中有很受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率高的检出率 美国美国FDA数据：灵敏度数据：灵敏度95.6%(175/183)国内临床数据：灵敏度国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)32结核杆菌结核杆菌 特异性高特异性高只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应无交叉反应 美国美国FDA数据：特异性数据：特异性97.1%(297/306)国内临床数据：特异性国内临床数据：特异性94.1%(478/508)33PPDPPD皮试与皮试与T-SPOTT-SPOT试验试验PPD皮试皮
24、试T-SPOTT-SPOT试验试验估计的敏感性估计的敏感性(活活动性结核的患者）动性结核的患者）7590%（对免疫对免疫抑制患者的敏感性抑制患者的敏感性进降低明显进降低明显）7595%（对免疫抑对免疫抑制患者的敏感性降低制患者的敏感性降低不明显不明显）估计的特异性估计的特异性（无结核病史或（无结核病史或暴露史的健康人）暴露史的健康人）7095%（接种（接种BCG者的特异性进者的特异性进一步降低）一步降低）90100%（接种（接种BCG者的特异性不变）者的特异性不变）与与BCG的交叉反的交叉反应应存在存在存在的可能性较小存在的可能性较小与与NTM的交叉反的交叉反应应存在存在存在的可能性较小存在的
25、可能性较小与与M.TB暴露的相暴露的相关性关性存在存在相关性较相关性较PPD皮试大皮试大阳性结果与随访阳性结果与随访期间罹患结核的期间罹患结核的相互关系相互关系中到显著的正相关中到显著的正相关无充足的证据无充足的证据 PPD皮试和皮试和T-SPOTT-SPOT试验的比较试验的比较34T-SPOTT-SPOT试验试验结果解释结果解释+阴性结果阴性结果提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。假阴性结果：细胞。假阴性结果：感染阶段不同；少数免疫系统功能不全感染阶段不同；少数免疫系统功能不全/疾病；实验非正常操作。疾病；实验非正常操作。+阳性结果阳性结果
26、提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在结核感染。但是细胞，患者存在结核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断。假阳性结果：否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断。假阳性结果：4种环境分枝杆菌感染时：种环境分枝杆菌感染时：M.kansasii（堪萨斯）、（堪萨斯）、M.szulgai（苏氏）、（苏氏）、M.marinum（海）、（海）、M.gordonae（戈登）（戈登）+减少了医生主观因素对检测结果的影响减少了医生主观因素对检测结果的影响;+故虽然检测仪器昂贵，操作相对较为复杂，但仍可视为进行结核病
27、早期诊故虽然检测仪器昂贵，操作相对较为复杂，但仍可视为进行结核病早期诊断的较为理想的手段。断的较为理想的手段。35非血液样本检测非血液样本检测+T-SPOT可通过一些体液成功地诊断出活动性结核：支气管肺泡灌洗液（“BAL”）（肺部）脑脊髓液（“CSF”）（中枢神经系统）胸腔积液（肺部周围）腹膜液（腹腔）+非血样本的T-SPOT结果很强的话（即存在大量的结核效应T细胞）,揭示在这个器官或部位存在活动性结核+非血样本中不存在结核效应T细胞，说明这个器官或部位没有活动性结核36各国对潜伏感染风险人群的筛查指南各国对潜伏感染风险人群的筛查指南风险人群风险人群美国指南美国指南加拿大指南加拿大指南英国指南
28、英国指南免疫力抑制人群免疫力抑制人群（例如，（例如，HIV感染感染者，使用强的松或者，使用强的松或TNF-抑制剂治疗）抑制剂治疗）TST或或IGRA；如果是阴性或高如果是阴性或高度怀疑的，度怀疑的，TST和和IGRA都要检都要检查查TST，如果，如果TST阴阴性要用性要用IGRA确认确认TST或或IGRABCG接种者（如果接种者（如果也属于其它风险人也属于其它风险人群）群）推荐用推荐用IGRA没有特定的推荐没有特定的推荐TST或或IGRA与传染性肺结核患与传染性肺结核患者密切接触者密切接触TST或或IGRATST，用，用IGRA进进一步确认一步确认TST阳性阳性TST，用，用IGRA进一进一步
29、确认步确认TST阳性阳性医务工作者医务工作者TST或或IGRA推荐用推荐用TSTTST或或IGRA，视情，视情况而定况而定无法再来确认无法再来确认TST结果的人群（例如，结果的人群（例如，流浪汉，注射吸毒流浪汉，注射吸毒者或交通不方便）者或交通不方便）推荐用推荐用IGRA没有特定的推荐没有特定的推荐推荐用推荐用IGRA37小结小结03小结小结结核病诊断金标准：结核病诊断金标准：抗酸杆菌培养抗酸杆菌培养-阳性阳性病理结果病理结果-阳性阳性辅助手段：辅助手段：影像学、分子生物学影像学、分子生物学结核病在临床上仍不容忽视，结核病在临床上仍不容忽视，但诊断仍存在难题但诊断仍存在难题T-SPOT是结核病
30、早期是结核病早期诊断的较为理想的手段诊断的较为理想的手段39参考文献参考文献1.韦海旭，席薇莲，陆利欢，陈健韦海旭，席薇莲，陆利欢，陈健.-干扰素释放分析干扰素释放分析T-SPOTTB在结核性疾病中的诊断价值在结核性疾病中的诊断价值.临床肺科杂志临床肺科杂志.2012,17(8):1439-1440 2.张丽帆，刘晓清张丽帆，刘晓清.干扰素释放分析干扰素释放分析T-SPOT.TB诊断结核感染临床应用进展诊断结核感染临床应用进展.中国医学科学院学报中国医学科学院学报.2009,4:506-5103.中华人民共和国卫生部，肺结核诊断标准，中华人民共和国卫生部，肺结核诊断标准，2008-08-01
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