1、发酵染菌及防治发酵染菌及防治发酵染菌能给生产带来严重危害，防止杂菌污染是任何发酵工厂的一项重要工作内容。尤其是无菌程度要求高的液体深层发酵，污染防止工作的重要性更为突出。所谓“杂菌”，是指在发酵培养中侵入了有碍生产的其他微生物。几乎所有的发酵工业，都有可能遭受杂菌的污染。染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者可能导致倒罐，甚至停产。第一节 发酵异常现象及染菌分析一、种子培养和发酵的异常现象n种子培养异常菌种生长缓慢菌丝结团代谢不正常一、种子培养和发酵的异常现象n发酵异常菌体生长差pH异常溶氧水平异常泡沫过多菌体浓度过高或过低目前生产上常用的杂菌检查方法有：显微镜检查：革兰氏染色 镜检平板划线
2、检查：倒平板 待测样品划线 培养观察酚红肉汤培养检查：无菌肉汤培养基接入样品 培养观察，此法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体检查。二、染菌隐患的检查显微镜检查方法简便、快速，能及时发现杂菌，但由于镜检取样少，视野的观察面也小，因此不易检出早期杂菌。平板划线法和肉汤培养方法的缺点是需经较长时间培养(一般要过夜)才能判断结果，且操作较繁琐，但它要比显微镜能检出更少的杂菌，而且结果也更为准确。三、发酵染菌的原因n发酵工艺流程各环节漏洞培养基灭菌不彻底无菌空气带菌种子带菌消泡剂带菌工艺用水带菌管道及附属设备或罐体出理渗漏或死角泡沫批次发酵结束后清洗不彻底逃溢n发酵过程管理不善工人的培
3、训不到位导致操作失误发酵车间卫生环境差设备未定期检修管理制度不完善四、染菌原因的分析n染菌的杂菌种类分析不同杂菌污染原因分析表杂菌原因耐热的芽孢杆菌培养基或设备灭菌不彻底，设备存在死角等真菌种子带菌、空气过滤效率低，除菌不彻底、设备渗漏等发酵染菌的规模分析大批量发酵罐染菌 不同时期染菌原因分析表染菌时期原因发酵前期种子带菌、连消设备染菌发酵中、后期如杂菌类型相同，一般是空气净化系统存在空气系统结构不合理、空气过滤介质失效部分发酵罐染菌不同时期染菌原因分析表个别发酵罐染菌染菌时期 原因发酵前期种子带菌、连消系统灭菌不彻底发酵后期中间补料染菌、如补料液带菌、补料管渗漏不同污染阶段分析种子培养期染菌
4、发酵前期染菌发酵后期染菌五、染菌隐患的处理n严格按照生产工艺要求的各项指标、参数、条件进行操作；n投产前进行整个发酵系统的无菌测试；n严格工人的管理，实行操作记录制度；n加强在线检测的技术手段，各种生物传感器、探头要定期校正；n定期对设备进行检修。第二节 染菌发酵的影响n染菌对不同发酵过程的影响（如青霉素的发酵、核酸的发酵、柠檬酸的发酵、谷氨酸的发酵、疫苗深层培养）n杂菌的种类和性质对发酵过程的影响（如青霉素的发酵、链霉素的发酵、四环素的发酵等）n染菌发生的时间不同对发酵的影响（种子培养期染菌、发酵前期染菌、发酵中期染菌、发酵后期染菌）n染菌程度对发酵的影响第三节 杂菌污染后的挽救和处理n种子
5、培养期染菌的处理（一旦发现种子染菌，应灭菌后排放，并对种子罐和管道进行彻底灭菌。同时还应采用未受污染的正常种子接入发酵罐中，以保证生产的连续性。）发酵前期染菌的处理n如培养基中的碳、氮源含量还比较高时，终止发酵，将培养基重新灭菌，再接入种子进行发酵。n如果此时染菌已造成较大的危害，培养基中的碳、氮源的消耗量已比较多，则可放掉部分料液，补充新鲜的培养基，重新灭菌，再接种进行发酵。n也可采取降温培养、调节pH、调整补料量、补加培养基等措施。发酵中、后期染菌的处理n可以适当加入杀菌剂或抗生素以及正常的发酵液，以抑制杂菌的生长速度，也可采取降低培养温度、降低通风量、停止搅拌、少量补糖等措施。n如果发酵
6、过程的产物代谢已达到一定水平，此时可放罐。n对于没有提取价值的发酵液，排放前应灭菌。染菌后对设备的处理n必须在放罐后进行彻底清洗，空罐需加热灭菌，也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12小时以上。第四节 染菌的预防措施n一、强化空气净化过程1、空气净化流程2、过滤介质选择n传统的空气净化系统使用活性炭、棉花、超细玻璃纤维作为过滤芯，其过滤效果差，且操作复杂。n目前，采用膜过滤，如用偏二氟乙烯（PVDF）制成的折叠微孔滤膜芯不仅过滤精度高，且流量大。3、过滤介质的填装n对于棉花过滤器最合适的充填密度是160-180kg/m3，玻璃纤维是130-180kg/m3 左右。4、空气净化系统的管理n要根据发酵的
7、特点和要求，选用合理的空气流速并选用高效的气液分离设备（如气液过滤网）。二、严格培养原料及设备的灭菌n原料的预处理（筛选除杂、粉碎、浸泡润湿、糊化、液化、糖化等）n培养基的灭菌设备的灭菌n实罐灭菌（充分排净罐内的冷空气、在降温过程中要将无菌空气通入罐内保持一定压力。）对设备死角的处理n所谓设备、管道的死角是指灭菌时因某些原因使灭菌温度达不到或不易达到的局部地区。法兰连接的死角渣滓在罐底所形成的死角环式空气分布管所形成的死角不锈钢衬里的死角接种管路的死角不合理补料管配置造成的死角三、定期检测发酵设备及管道n发酵设备的定期检查（如搅拌系统转动有无异常、机械密封是否严密，罐内的螺丝是否松动等）n管道、阀门的定期检查四、严格培养物的移接n无菌室n灭菌锅n接种用具的要求五、对噬菌体的防治措施五、对噬菌体的防治措施n定期检查噬菌体并采取有效措施消灭噬菌体；n检查生产系统，消除各种不安全因素；n选育抗噬菌体菌株和轮换使用生产菌株；n采取应急的挽救措施。感染噬菌体常用的应急方法感染噬菌体常用的应急方法n加入少量药物用以阻止噬菌体吸附或抑制噬菌体蛋白质的合成及增殖。n当生产进行中污染了噬菌体时，可补入适量的新鲜发酵培养基或促使菌种生长的生长因子，有利于菌种生长，抑制噬菌体的增殖，使发酵得以顺利进行。n大量补接种子液或重新接种抗性菌种培养液。
