1、第二部分：Spectrophotometry Principle 分光光度法检测原理 所以：待测物浓度可以由检测其颜色深浅得到。不同浓度，颜色深浅不一。没有颜色？间接：通过生化反应生成有色物质，间接计算得到浓度。双缩脲反应分光光度法的原理基础：Lambert-Beer Law ，I 入射光及通过样品后的透射光强度；A吸光度(absorbance)；C样品浓度；d光程，即盛放溶液的液槽的透光厚度；k光被吸收的比例系数；T透射比，即透射光强度与入射光强度之比。简而言之，光被一定浓度介质吸收的比例与入射光的强度无关；在光程上每等厚层介质吸收相同比例值的光。Lambert-Beer Law的适用范围：
2、(1)入射光为平行单色光且垂直照射.(2)吸光物质为均匀非散射体系.(3)吸光质点之间无相互作用.(4)辐射与物质之间的作用仅限于光吸收,无荧光和光化学现象发生.(5)待测物在一定溶度范围之内.为什么需要平行单色光？在非单色光的条件下，由于待测物质在各个波段下吸光系数 K 的不同，造成相关曲线也出现不同程度的偏离。实际上，理论上的单色光是不存在的，我们所做的只能是让入射光的光谱带宽尽可能的小，要尽可能的靠近单色光。为什么仅适用一定范围内？Lambert-Beer Law在有解离、缔合、生成络合物或溶剂化等会对比尔定律产生偏离。解离是偏离朗伯-比尔定律的主要化学因素，当溶液浓度（大于0.01mm
3、ol/L）改变，解离程度也会发生变化，吸光度与浓度的比例关系便发生变化，导致偏离朗伯-比尔定律。前分光模式1、光源灯发出全波段光线2、单色器将全波段光线分为某一波长的单色平行光3、单色平行光经过反应杯溶液4、光电信号接收器检测光线强度后分光模式5、光电信号检测各种光线强度4、衍射光栅将出射光线分为不同波长的单色光3、平行光经过反应杯溶液1、光源灯发出全波段光线2、光线经凸透镜整理成为不同波段平行光双波长模式在双波长模式下A=A（主波长）-A（副波长）较单波长的优点：1、电压不稳定等环境影响下，由于主副波长都产生了相同程度的影响而被消除2、一些常见的干扰因素如轻度溶血，将可以由于在主波长和副波长
4、具有相同的吸光度而被间接消除3、双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响在罗氏仪器上，待测物的12个波长的吸光度都被检测，选择设定中的2个波长进行计算。分光光度法的分析类型一，终点法1-Point End Assay2-Point End Assay二，速率法2-Point Rate AssayRate Assay1Point End：仅检测反应终点的吸光度2-point end assay:检测2个点的吸光度，一点反应启动前样品空白的吸光度，另一点为反应启动后的吸光度。2-Point End Assay反应图：2-Point Rat
5、e Assay：检测两个不同时间点之间的吸光度之差，除以时间差得到的变化率1个或多个反应试剂检测2个点吸光度用于计算通过 Abs/min来计算检测项目的量2-point Rate assay反应图1个或多个反应试剂通过最小二乘法计算反应曲线，得到待测物的量或活性Rate A：一定时间连续多次测定反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据，间接计算检测项目的量的方法。Rate A反应图：检测方法检测物质Examples 校准方法1点终点法底物类TG,CHOL2点线性校准2点终点法底物类TP,ALB,Glu，TB,DB,Ca,Pho,UA,HDL,LDL 2点线性校准特定蛋白类HSCRP,Hb
6、A1c多点非线性校准速率A法酶类AST,ALT,GGT,LDH,CK2点线性校准底物CREA Jaffe,UREA,Ammonia,TDM2点线性校准2点速率法底物UREA,ACP，Urinary/CSF protin2点线性校准光度分析校准及报警Calibration quality criteriaCalibration quality criteria校准限制界校准限制界面面Utility Application screenUtility Application screenSD Limit(SD Limit(标准差限制标准差限制):):实测吸光度和理论计算吸光度的差异实测吸光度和理论
7、计算吸光度的差异Duplicate limit(Duplicate limit(重复性限制重复性限制):):重复性限制重复性限制,相对范围相对范围%和绝对范围和绝对范围Sensitivity limitSensitivity limit(灵敏度限制灵敏度限制):):空白浓度和空白浓度和 c.f.a.sc.f.a.s之间的单位浓度吸光度变化之间的单位浓度吸光度变化差异的最大值和最小值差异的最大值和最小值 S1 Absorbance Limit(S1 Absorbance Limit(空白限制空白限制):):试剂空白就是待测物浓度为试剂空白就是待测物浓度为0 0时的吸光度时的吸光度.校准报告校准报
8、告CHOCHOStd1,2Std1,2双波长双波长检测吸光度差检测吸光度差Std1,2Std1,2主波长主波长检测吸光度检测吸光度校准报警校准报警校准结果校准结果K=(CFAS-0)/(5848-1973)x 10000=1120K=(CFAS-0)/(5848-1973)x 10000=1120K=(CN Cb)K=(CN Cb)(AN Ab)(AN Ab)SD Limit(SD Limit(标准差限制标准差限制):):常见校准校准失败常见校准校准失败的原因的原因1.1.校准的放置顺序可能有误（多个校准的放置顺序可能有误（多个校准品）校准品）2.2.单个校准品自动稀释后校准单个校准品自动稀释
9、后校准 加样精度问题加样精度问题3.3.比色杯或光源灯老化比色杯或光源灯老化4.4.污染的或蒸发浓缩的校准品污染的或蒸发浓缩的校准品5.5.混匀机构问题混匀机构问题Duplicate limit:重复性限制检查同一个校准品的两次吸光度差异Abs1-Ab2校准的时候,每个校准品会重复做两次进行计算原因：如果是新试剂，检查试剂复溶及混匀情况检查样品针和试剂针.样品或试剂上有气泡光源灯或比色杯老化混匀不佳Sensitivity limit(Sensitivity limit(灵敏度限制灵敏度限制)该数值标识出空白和该数值标识出空白和 c.f.a.sc.f.a.s之间的单位浓度吸光度变之间的单位浓度吸
10、光度变化差异的最大值和最小值化差异的最大值和最小值 .在终点法的生化项目校准中，最小吸光度变化是必须检测在终点法的生化项目校准中，最小吸光度变化是必须检测的标准的标准 Sen:Sen:Sensitivity limit(Sensitivity limit(灵敏度限制灵敏度限制):):常见校准校常见校准校准失败的原因准失败的原因1.1.错误的校准品错误的校准品 蒸发浓缩或配制错误蒸发浓缩或配制错误2.2.旧的或污染的试剂旧的或污染的试剂3.3.污染的空白校准品污染的空白校准品空白和CFAS校准品的测得的吸光度值过于接近校准失败校准失败校准液校准液（1 1）吸光度）吸光度Standard 1 Ab
11、sorbance Standard 1 Absorbance S1 Abs S1 Abs 用于检查用于检查线性或非线性线性或非线性校准。校准。报警用于指示第一点校准品吸光度是否超出范围。报警用于指示第一点校准品吸光度是否超出范围。S1 AbsS1 Abs定义校准品定义校准品1 1水平的上限和下限。水平的上限和下限。用于检测试剂空白用于检测试剂空白。校准报警校准报警DUPSENS1 Abs LimitCalib.Limit常见报警类型常见报警类型潜在原因潜在原因Duplicate LimitDuplicate Limit加样不准加样不准(样本、试剂样本、试剂)，搅拌，搅拌 (P)(P)，反应杯，
12、反应杯光源老旧，环境，光源老旧，环境，电压电压Sensitivity LimitSensitivity Limit校准品、水点污染，试剂，校准品单位更改校准品、水点污染，试剂，校准品单位更改未更改数值未更改数值Calibration LimitCalibration Limitcfascfas和水空白，加样不准，系统水，光源灯和水空白，加样不准，系统水，光源灯Standard Deviation Standard Deviation LimitLimit不正确的加样顺序，光路，针不正确的加样顺序，光路，针(加样不精确加样不精确)Standard 1 Absorbance Standard 1
13、Absorbance 水质，试剂，光源水质，试剂，光源Standard ErrorStandard Error仪器，反应过程，其它校准报警仪器，反应过程，其它校准报警造成生化校准报警的潜在可能原因造成生化校准报警的潜在可能原因校准报警校准报警校准报警校准报警校准报警校准报警校准曲线校准曲线Duplicate LimitDuplicate Limit重复性限制重复性限制不更新不更新Sensitivity LimitSensitivity Limit灵敏度限制灵敏度限制不更新不更新Calibration LimitCalibration Limit校准限制校准限制更新更新Standard Devi
14、ation Standard Deviation LimitLimit标准差限制标准差限制可能更新可能更新Standard 1 Absorbance Standard 1 Absorbance Std1Std1吸光度吸光度不更新不更新Standard ErrorStandard Error标准错误伴随标准错误伴随不更新不更新如果校准失败，系统将自动使用之前有效的校准曲线计算标本浓度。如果校准失败，系统将自动使用之前有效的校准曲线计算标本浓度。生化项目检测常用显色指示系统1，NAD+NADH（NADP+NADPH）指示系统2，p-NP（磷酸对硝基苯酚）和 p-NA（硝基苯酚）指示系统 3，H2O
15、2偶联的指示系统 4，抗原抗体反应指示系统，免疫比浊法 5，其它显色反应 1，NAD+NADH（NADP+NADPH）指示系统：反应原理：NADH 和 NADPH 在 340nm 有特征性吸收峰，而 NAD+和 NADP+在 340nm无特征性吸收峰，利用其偶联的脱氢酶(工具酶)反应，根据 340nm 吸光度的变化，可以测定物质的浓度或 活性。临床项目：ALT、AST、CK、LDH、CK-MB、-HBDH、Glu（己糖激酶法）、UREA、NH4+、CO2 等 1.5.2.2.举例说明ALT的测定原理（IFCC）试剂成分和反应公式：R1：NADH、乳酸脱氢酶（LDH）；R2：L-丙氨酸、-酮戊二
16、酸。原理：NADH 的减少，引起 340nm 吸光度的下降，下降速率与 ALT 活性成正比(酶动力学法)。2，p-NP（磷酸对硝基苯酚）和 p-NA（硝基苯酚）指示系统 反应原理：p-NP 和 p-NA 在 405nm 有特征性吸收峰，根据 405nm 吸光度的变化，可以测定物质的浓 度或活。临床项目：ALP、ACP、r-GT、AMY 等。举例说明：ALP的测定原理（IFCC）试剂成分和反应公式。R1：AMP 缓冲液，镁离子，锌离子，PH10.44；R2：对硝基苯磷酸，防腐剂，PH8.5 原理：在镁离子和锌离子的存在下，碱性磷酸酶解离对硝基苯磷酸形成磷酸盐和对硝基苯酚，引起 405nm 吸光度
17、的上升，上升速率与 ALP 活性成正比（动力学法）。3，H2O2偶联的指示系统 反应原理：H2O2在过氧化物酶的作用下，可使单一个或成对的无色的色素原氧化成有色的色素，导致某 一波长吸光度的增加，因此可用来测定物质的浓度或活性。临床项目：过氧化物酶法CHOL，GLU举例说明:GLU 过氧化物酶法的测定原理R1：4-氨基安替吡啉、抗坏血酸氧化酶 R2：葡萄糖氧化酶（GOD）、过氧化物酶（PO D）、酚。测定原理：醌亚胺的生成，导致 500nm 吸光度的增加，增加的程度与 Glu 的含量成正比。4，抗原抗体反应指示系统，免疫比浊法 反应原理：特异性抗体与抗原(待测物质)在相应的缓冲环境下反应生成抗
18、原抗体复合物，形成一定的浊 度，导致特定波长透光率的改变。在抗体过剩的前提下，改变程度与抗原浓度成正比。临床项目：apoAI、apoB、Lp(a)、IgG、IgA、IgM、C3、C4、CRP 等。5，其它显色反应TP 的反应原理：蛋白质中的肽键在碱性溶液中能与铜离子作用产生紫红色络合物，导致 540nm 吸光度的增 加，增加的程度与蛋白质的含量成正比。ALB 的反应原理：在 pH4.2 环境中，溴甲酚绿在有非离子去垢剂聚氧乙烯月桂存在时，可与白蛋白形成蓝绿色复合物，导致 630nm 吸光度的增加，增加的程度与白蛋白的含量成正比。其它的显色反应还有 Ca 和 Mg 等物质的测量方法，c 701c
19、 702c 502/501应用数 光度200200200 计算检测888 血清指数333分析通量（最大）2000 个测试/小时2000 个测试/小时600 个测试/小时反应体积100-250 L100-250 L100-250 L反应温度（孵育池）37 0.1C37 0.1C37 0.1C反应杯406 池（14 区域）406 池（14 区域）160 池（8 区域）反应时间1-分钟步骤中 3-10 分钟 1-分钟步骤中 3-10 分钟1-分钟步骤中 3-10 分钟移液循环1.8 s1.8 s6 s复合方法非接触超声混合非接触超声混合非接触超声混合表 9-3 反应系统反应系统 c 701c 702
20、c 502/501试剂盒类型 cobas c 大容量试剂盒 cobas c pack MULTI 大容量试剂盒 cobas c 大容量试剂盒 cobas c pack MULTI 大容量试剂盒 cobas c 中等容量试剂盒 cobas c pack MULTI 中等容量试剂盒试剂加载/卸载手动自动（试剂管理站进行）自动试剂识别自动（RFID）试剂管理站中自动（RFID）自动（条码）最大量试剂盒7070（试剂管理站中附加 10 个）60 试剂冷却（试剂盘中）5-155-155-12试剂缓冲转子容量-10 个试剂盒-试剂卸载托盘容量-12 个试剂盒10 个试剂盒试剂移液时间安排（最多使用 3 个
21、时间点）R1：3.6 sR2：113.4 sR3：307.8 sR1：3.6 sR2：113.4 sR3：307.8 sR1：3.2 sR2：90.2 sR3：300.2 s试剂移液量5-180 L、增加幅度为 1 L（5-19 L：+20 L 水）质控品剩余试剂体积移液 LLD 与自动检测读数移液 LLD 与自动检测读数表 9-4 试剂系统试剂系统 c 701c 702c 502/501样品类型 血清血浆 尿 脑脊液 上清液 其他 血清血浆 尿 脑脊液 上清液 其他 血清血浆 尿 脑脊液 上清液 全血 其他样品移液量1.5-35L，每次增加0.1L样品堵塞探测压力灵敏式凝块探测系统液面传感器
22、电容传感技术表 9-5 取样系统取样系统 c 701c 702c 502光源卤素灯，12 V/50W光度计多波长分光光度计波长12种波长可供选择：340，376，415，450，480，505，546，570，600，660，700，800 nm光路长度5.6 mm光程吸光度0.0000-3.3000线性吸光度不高于2.5光模式单色光和双色光光度测定系统光度测定分析的流程1清洗反应杯启动后，机械部件将重设并回位。仪器开始进行反应池冲洗。反应盘持续旋转。冲洗喷嘴 A 从反应池吸取反应混合物。数个循环后，通过冲洗喷嘴 B/C，使用去离子水对反应池进行清洗。下一步，使用 CellCln 1，于冲洗臂
23、中，通过喷嘴 D/E 对反应池进行清洗。使用CellCln 2，于冲洗臂中，通过喷嘴 F/G 对反应池进行清洗。使用冲洗喷嘴 H/I，对反应池进行去离子水的冲洗。使用喷嘴 J/K，再次用去离子水对反应池进行冲洗。2水空白管理冲洗喷嘴L分配排出水空白。一个水空白样品测定3次。如果水空白值与反应杯空白值的差异达到或超过0.1，则不得将该反应杯用于分析试验。3分配样品冲洗与水空白测定后，反应池返回至取样位置，并开始进行样品分发。每间隔 1.8 秒，测试顺序开始启动，并在探针 A 与 B 之间交替进行。分析的流程4添加试剂于测定位置添加试剂 R1、R2，与 R3 与时间点（0、2 与 5 分钟）。添加
24、试剂 R1、R2，与 R3 的每个测定时间，使用超声搅拌器，于相应混合位置进行池液体混合。16.2 s 光度计循环时间 1.8 s 取样时间 3.6 s 每个样本探针取样时间（A 或 B）5计算结果每隔 1.8 秒进行一次取样处理。10 分钟内每反应池进行 38 次检测。所有测定完成后，通过反应过程特定时间点吸光度值进行浓度计算。6清洗反应杯仪器通过池冲洗单元进行反应液吸取，水冲洗后，使用清洁剂进行清洗。7自动停止仪器进入待机状态。分析的流程池冲洗单元位于反应盘右侧与后部。吸光度测定后，池冲洗单元进行反应池清洁、冲洗与干燥处理。为确保反应池的光路性能良好，清洁过程中进行水充盈反应池的吸光度测定（池空白）并与前期的测定结果进行比较。池空白值可确保反应池的所有条件处于小的可耐受范围内。如果反应池未达到这些预设定限度，则无法用于常规检测中。A反应结束后抽吸液体B排出冲洗水C排出冲洗用水D排出反应杯清洗剂1E抽吸反应杯清洗剂1F排出反应杯清洗剂2G抽吸反应杯清洗剂2H 排出冲洗水I排出冲洗用水J排出冲洗水K吸取冲洗水并进行干燥处理L排出水空白M 水空白抽吸N 水空白抽吸与干燥处理反应杯清洗过程：
