1、第二章第二章生物大分子的纯化方法生物大分子的纯化方法等生物大分子的结构与功能的等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题研究是探求生命奥秘的中心课题达到足够纯度的生物大分子的制备工作作为前题达到足够纯度的生物大分子的制备工作作为前题。概概 述述 沉淀法（包括：沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀沉淀等）等）离心离心吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析和层析快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。常用的分离纯化方法和技术有：常用的分离纯化方法和技术有：沉淀沉
2、淀法法沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。基本原理：基本原理：不同溶解度的产生的原因：不同溶解度的产生的原因：溶解度的大小与下列因素有关：溶解度的大小与下列因素有关：蛋白质沉淀法蛋白质沉淀法有机聚合物沉淀有机聚合物沉淀选择性沉淀法（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）选择性沉淀法（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）结晶沉淀法结晶沉淀法 在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：中性盐沉淀（盐析法）中性盐沉淀（盐析法）在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为程称为“”。在蛋白
3、质领域应用最广，其突出的在蛋白质领域应用最广，其突出的：成本低，不需要特别昂贵的设备。成本低，不需要特别昂贵的设备。操作简单、安全。操作简单、安全。对许多生物活性物质具有稳定作用。对许多生物活性物质具有稳定作用。盐分级沉淀：多次盐析的应用盐分级沉淀：多次盐析的应用中性盐的选择：中性盐的选择：常用的中性盐中最重要的是常用的中性盐中最重要的是(NH4)(NH4)2 2SOSO4 4，因为它，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的与其他常用盐类相比有十分突出的：几种盐在不同温度下的溶解度（克几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）毫升水）0 20 80 100（NH4)2SO4 Na2SO4 4
4、.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 1012)2)分离效果好分离效果好3)3)不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用 4)4)价格便宜，废液不污染环境价格便宜，废液不污染环境缺点缺点：需要一定时间脱盐需要一定时间脱盐盐析的操作方法：固体法、饱和溶液法、透析法盐析的操作方法：固体法、饱和溶液法、透析法最常用的是最常用的是原则：缓慢均匀少量原则：缓慢均匀少量 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法用过滤方法各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录
5、（各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录（p24-25）中）中查出。查出。盐析曲线盐析曲线的制作的制作如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下：度。具体操作方法如下：取待分离样品溶液取待分离样品溶液(已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度)，冷至冷至05，调至该蛋白质稳定的，调至该蛋白质稳定的pH值，值，分分610次次分别加入不同量的硫酸铵分别加入不同量的硫酸铵第一次加硫酸铵至蛋白质溶液第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚刚刚刚开
6、始出现沉淀时，记下开始出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是所加硫酸铵的量，这是继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得到到，然后取上清再加至混浊，离心得到第，然后取上清再加至混浊，离心得到第二个级分，如此连续可得到二个级分，如此连续可得到610个级分个级分按照每次加入硫酸铵的量，在附录中查出相应的硫酸铵饱按照每次加入硫酸铵的量，在附录中查出相应的硫酸铵饱和度。将和度。将，测定其蛋白质含量和酶活力，测定其蛋白质含量和酶活力以每个级分的以每个级分的对对作图，作图，即可得到盐析曲线即可得到盐析曲线 蛋白质量蛋白质量(mg)或酶活力或酶活力
7、10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫铵饱和度硫铵饱和度 1)1)蛋白质的浓度：蛋白质的浓度：较适中的浓度较适中的浓度0.2%0.2%2.0%2.0%2)pH2)pH值对盐析的影响：值对盐析的影响：pI pI 3)3)温度的影响：离子强度温度的影响：离子强度 0 044 盐析的影响因素：主要盐析常数盐析的影响因素：主要盐析常数K Ks s常用方法：凝胶过滤法和透析法常用方法：凝胶过滤法和透析法脱盐脱盐降低水溶液的介电常数，使溶剂的极性减小降低水溶液的介电常数，使溶剂的极性减小有机溶剂脱水作用有机溶剂脱水作用有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 分辨能力比盐析法高分辨能力比盐析
8、法高 沉淀不用脱盐，过滤比较容易沉淀不用脱盐，过滤比较容易 有机溶剂沉淀法的优点是：有机溶剂沉淀法的优点是：有机溶剂的选择和浓度的计算有机溶剂的选择和浓度的计算与水互溶与水互溶:乙醇、甲醇和丙酮乙醇、甲醇和丙酮。进行沉淀操作时，欲使溶液达到一定的有机溶剂进行沉淀操作时，欲使溶液达到一定的有机溶剂浓度，需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下浓度，需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下式计算：式计算：温度：温度：样品浓度：蛋白质初浓度：样品浓度：蛋白质初浓度：pH值：值：离子强度：离子强度：有机溶剂沉淀的影响因素有机溶剂沉淀的影响因素仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用碱性蛋白
9、质、凝集素、种金属碱性蛋白质、凝集素、种金属蛋白质沉淀法蛋白质沉淀法HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n4)(Polyethylene Glycol,PEG)亲水性强，溶于水和许多有机溶剂亲水性强，溶于水和许多有机溶剂对热稳定对热稳定有广范围的分子量有广范围的分子量在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为400 6000 的的 PEG 有机聚合物沉淀法有机聚合物沉淀法操作条件温和，不易引起生物大分子变性操作条件温和，不易引起生物大分子变性沉淀效能高，使用很少量的沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相当即可以沉淀相当多的生物大分子多的生物大分子
10、沉淀后有机聚合物容易去除沉淀后有机聚合物容易去除 热变性热变性 表面活性剂和有机溶剂变性表面活性剂和有机溶剂变性 选择性酸碱变性选择性酸碱变性 选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法在特定的条件下，改变溶解度产生沉淀的方法。在特定的条件下，改变溶解度产生沉淀的方法。不等同于不等同于结晶沉淀法：结晶沉淀法：透析透析自自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有近年发明透析方法至今已有近150年。年。透析已成为透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一之一除盐除盐除少量有机溶剂除少量有机溶剂除去生物小分子杂质除去生物小分子杂质浓缩样品浓
11、缩样品半透膜：纤维素半透膜：纤维素将半透膜制成袋状将半透膜制成袋状袋内外两边的浓度袋内外两边的浓度达到平衡为止达到平衡为止“保留液保留液”“渗出液渗出液”或或“透析液透析液”MwCO扩散压扩散压(透析的动力透析的动力)透析的速度透析的速度:膜的厚度膜的厚度 溶质的浓度梯度溶质的浓度梯度 膜的面积膜的面积 温度温度检查透析效果的方法是：用检查透析效果的方法是：用 BaCl2检查检查(NH4)2SO4，用，用 AgNO3 检查检查NaCl、KCl等等制备核酸制备核酸DNA-蛋白质蛋白质(DNP)RNA-蛋白质蛋白质(RNP)去污剂去污剂有机溶剂有机溶剂蛋白水解酶蛋白水解酶DNPRNP复合物的解聚复
12、合物的解聚十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠(SDS)或或Tween40 乙酸钾溶液乙酸钾溶液 离心除去沉淀物离心除去沉淀物上清液即为初步纯化的核酸制品上清液即为初步纯化的核酸制品(1)(1)去污剂去污剂苯酚、氯仿苯酚、氯仿 上层水相上层水相(含核酸含核酸)和下层有机相和下层有机相界面：变性凝聚蛋白界面：变性凝聚蛋白 收集水相收集水相(2)(2)有机溶剂有机溶剂 水相和有机相的位置水相和有机相的位置充分接触，速度适当充分接触，速度适当苯酚重新蒸馏苯酚重新蒸馏异戊醇混合液异戊醇混合液 注意点注意点 ：溶菌酶溶菌酶蛋白酶蛋白酶K 蛋白酶蛋白酶E(需灭活需灭活DNase)(3)(3)蛋白水解酶蛋白水解酶杂
13、质的消除杂质的消除(1)多糖多糖 体内的糖原和淀粉自然分解体内的糖原和淀粉自然分解选择性沉淀剂如异丙醇、十六烷基三甲基溴化铵选择性沉淀剂如异丙醇、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，适用于酸性多糖，适用于酸性多糖)(2)DNA与与RNA的分离的分离 盐析法盐析法 DNA和和RNA在在NaCl溶液中溶解度不同溶液中溶解度不同 1-2mol/L;0.14mol/L 酶水解法酶水解法 DNase和和RNase核酸沉淀核酸沉淀(1)(1)有机溶剂有机溶剂 乙醇乙醇-盐溶液盐溶液 DNA片段片段1kb或核酸溶液浓度或核酸溶液浓度1kb的核酸溶液，置室温下仅需数分钟，高的核酸溶液，置室温下仅需数分钟，高速离心速离心 异丙醇异丙醇核酸沉淀的形状与其分子质量密切相关核酸沉淀的形状与其分子质量密切相关 106Da：丝状纤维：丝状纤维 106Da：凝胶：凝胶(2)(2)聚乙二醇聚乙二醇:阶梯式浓度阶梯式浓度 1.65kb的的DNA，5PEG 1.2kb的的DNA，6PEG 0.6kb的的DNA，7PEG(3)(3)十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)
