1、第 五 章层析技术生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室徐宏伟徐宏伟n 层析法也称色谱法层析法也称色谱法(chromatography)，是，是1906年俄国植物学家年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为被分开，由此得名为“色谱法色谱法”。n 1941年，英国生物学家年，英国生物学家Martin和和Synge首先首先提出了色谱塔板理论，为后来各种色谱技术的发提出了色
2、谱塔板理论，为后来各种色谱技术的发展奠定了基础。展奠定了基础。n层析法最基本的特征是有一个层析法最基本的特征是有一个固定相固定相和一个和一个流动相流动相，当两相作相对运动时，由于混合物，当两相作相对运动时，由于混合物中各组分在中各组分在物理化学性质物理化学性质(如吸附力、溶解如吸附力、溶解度、分子的形状与大小、分子的电荷性及亲度、分子的形状与大小、分子的电荷性及亲和力等和力等)上的差别，使各组分在两相间进行上的差别，使各组分在两相间进行反复多次的分配而得到分离。反复多次的分配而得到分离。层析类别层析类别 主要依据的理化性质主要依据的理化性质 此类的层析方法举例此类的层析方法举例吸附层析吸附层析
3、 吸附力吸附力 磷酸钙凝胶层析磷酸钙凝胶层析 分配层析分配层析 分配系数分配系数 各种薄层层析、纸上层析各种薄层层析、纸上层析离子交换层析离子交换层析 分子的电荷性、极性分子的电荷性、极性 DEAE-纤维素柱层析纤维素柱层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析 分子大小分子大小 交联葡聚糖柱层析交联葡聚糖柱层析 亲和层析亲和层析 亲和分子间的亲和力亲和分子间的亲和力 n层析技术可按两相的状态不同进行分类，如以层析技术可按两相的状态不同进行分类，如以气体为流动相的叫做气相层析（气体为流动相的叫做气相层析（gas chromatography），以液体为流动相的叫做），以液体为流动相的叫做液相层析（液相层析（
4、liquid chromatography）。）。n由于固定相也有液体和固体的不同，故气相层由于固定相也有液体和固体的不同，故气相层析还可细分为气析还可细分为气液和气液和气固层析两种，同理，固层析两种，同理，液相层析即可细分为液液相层析即可细分为液液和液液和液固层析两种。固层析两种。n根据流动相的形式：n 液相层析、气相层析 层析基本操作过程n 装置选择装置选择上样和洗脱上样和洗脱结果检测结果检测 上样均一性上样均一性 洗脱装置洗脱装置目的不同目的不同 检测方法不同检测方法不同活性检测活性检测基质均匀性基质均匀性柱层析的柱层析的L/d比值比值4、层析装置的仪器化nHPLCv与微机、质谱等连用层
5、析前蛋白质处理n 主要是利用主要是利用盐析法、等电点沉淀、盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。第一节第一节 凝胶过滤层析技术凝胶过滤层析技术 n又称凝胶排阻层析或分子筛方法又称凝胶排阻层析或分子筛方法 n利用某些化学惰性的多孔网状结构的物质利用某些化学惰性的多孔网状结构的物质(多多为凝胶为凝胶)为填料，使混合物中的各种物质按其为填料，使混合物中的
6、各种物质按其分子大小不同得到分离。分子大小不同得到分离。n优点：凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，温度范围广，不需要有机溶剂，分离效果好件比较温和，温度范围广，不需要有机溶剂，分离效果好n 缺点：样品被不断稀释，上样量不能太大，否则分辨率变样品被不断稀释，上样量不能太大，否则分辨率变差差 一、凝胶过滤层析的基本原理一、凝胶过滤层析的基本原理 n多孔性亲水性凝胶多孔性亲水性凝胶 n一是随洗脱液垂直向下移动一是随洗脱液垂直向下移动n二是无定向的扩散运动。二是无定向的扩散运动。n凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层凝胶颗
7、粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。n 凝胶是一种凝胶是一种不带电不带电的具有三维空间的的具有三维空间的多孔网状结构的物的物质，每个颗粒的细质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直微结构及筛孔的直径均匀一致，径均匀一致，小分
8、子可以进入凝胶网孔，而大分子则排阻于颗粒之外。n 大分子大分子物质沿凝胶颗粒物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，程短，移动速率快，先先被洗出被洗出层析柱层析柱n 小分子小分子物质可通过凝胶物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，长，移动速度慢，最后最后被洗出层析柱被洗出层析柱 目目 录录分配系数分配系数(kd)VeVe为某一被分离成分被洗脱时所用洗脱液的体积，称为洗脱体积；为某一被分离成分被洗脱时所用洗脱液的体积，称为洗脱体积；VoVo为凝胶颗粒间自由空间的总容积，称为空白体积或外水体积；
9、为凝胶颗粒间自由空间的总容积，称为空白体积或外水体积；ViVi为凝胶颗粒内部孔穴的总容积，称为内水体积或进人体积。为凝胶颗粒内部孔穴的总容积，称为内水体积或进人体积。体积参数n 分子在柱中移动的速度取决于该分子在固定相和流分子在柱中移动的速度取决于该分子在固定相和流动相间的分配系数动相间的分配系数Kd，Kd表示某一分子在特定的凝胶柱内表示某一分子在特定的凝胶柱内的洗脱行为。的洗脱行为。nKd(Ve一一Vo)ViVe Ve 洗脱体积洗脱体积Vo Vo 外水体积外水体积Vi Vi 内水体积内水体积n Ve=Vo 该成分的分子全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中，该成分的分子全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中，n
10、 因而因而洗脱速度最快洗脱速度最快。即该成分的。即该成分的Kd0。n ViVe-Vo 该成分不被排阻而可完成进入凝胶颗粒内部该成分不被排阻而可完成进入凝胶颗粒内部,n 因而因而洗脱速度最慢洗脱速度最慢。即该成分的。即该成分的Kd=l。n Kd值介于值介于0-l之间，之间，物质的洗脱速度随其物质的洗脱速度随其Kd值的值的 n 增加而降低增加而降低n 一般物质的一般物质的Kd值是值是0Kd l。洗脱行为可以有三种可能的情况:凝胶Kd0Kd=l0Kd lKd具有以下意义：具有以下意义：（1 1）对于完全被排阻的极端大分子，由于）对于完全被排阻的极端大分子，由于VeVeVoVo，因此，因此KdKdO
11、O（2 2）对于能自由扩散凝胶颗粒内部的小分子物质，）对于能自由扩散凝胶颗粒内部的小分子物质，VeVeVoVoViVi，KdKd1 1（3 3）对于能部分扩散入凝胶颗粒内部的大分子物质，）对于能部分扩散入凝胶颗粒内部的大分子物质，KdKd在在0 0 1 1之间之间（4 4）凡）凡KdKd1 1的物质，表明它们能被凝胶吸附或具有离子交换作用，而的物质，表明它们能被凝胶吸附或具有离子交换作用，而不仅仅是分子筛效应不仅仅是分子筛效应（5 5）KdKd值越接近值越接近1 1，表明分子越小，洗脱越慢；相反，表明分子越小，洗脱越慢；相反，KdKd值越接近值越接近0 0，表，表明分子越大，洗脱越快。明分子越
12、大，洗脱越快。柱床体积柱床体积(Vt)为凝胶基架的总体积为凝胶基架的总体积(Vr)与内水体积与内水体积(Vi)及外水体积及外水体积(Vo)之和之和。实验室常用实验室常用VtVo代替代替Vi来计算分配系数，来计算分配系数，所得值称为所得值称为平均分配系数平均分配系数，用，用Kav表示，其定义为表示，其定义为 对于某一特定的凝胶柱，对于某一特定的凝胶柱，Kav与与kd之比是之比是1个常数，个常数，它不随溶质的性质或浓度而改变，因此可代替它不随溶质的性质或浓度而改变，因此可代替kd来度量被分离物的洗脱行为。来度量被分离物的洗脱行为。影响分离效果的因素n 流速流速n 加样体积加样体积n 样品浓度样品浓
13、度n 离子强度离子强度二、常用凝胶的种类和性质二、常用凝胶的种类和性质n立体多孔网状结构，惰性立体多孔网状结构，惰性 n对对pH和温度的稳定性和温度的稳定性 n能反复使用能反复使用 n颗粒大小比较均匀颗粒大小比较均匀 n葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶及琼脂糖凝胶。葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶及琼脂糖凝胶。凝胶过滤层析的介质 n 葡聚糖系列葡聚糖系列n 琼脂糖系列琼脂糖系列n 聚丙烯酰胺系列聚丙烯酰胺系列 n 多孔硅胶多孔硅胶 基本操作基本操作 n凝胶的选择凝胶的选择 n凝胶柱的制备凝胶柱的制备 n上样上样n洗脱洗脱n凝胶柱的重复凝胶柱的重复使用与保存使用与保存 三、凝胶过滤层析的实验技术三、凝胶过滤
14、层析的实验技术 n(一一)凝胶的选择与处理凝胶的选择与处理 n根据被分离物质分子的大小、形状和分离目的进行选择根据被分离物质分子的大小、形状和分离目的进行选择 n1.分离分子量相差悬殊的两种物质，如蛋白质脱盐分离分子量相差悬殊的两种物质，如蛋白质脱盐n2.纯化蛋白质时，则需要根据各组分的分子量分布范围及各纯化蛋白质时，则需要根据各组分的分子量分布范围及各种凝胶的分离范围选用合适的凝胶种凝胶的分离范围选用合适的凝胶 n粗粒粗粒，中粒，中粒：分离效果差，但流速快：分离效果差，但流速快，可用，可用于工业上物质的制备于工业上物质的制备 n细粒细粒：洗脱曲线峰形对称、峡窄、分离度好：洗脱曲线峰形对称、峡
15、窄、分离度好 n超细颗粒超细颗粒：能给予最好分离，但流速慢，实：能给予最好分离，但流速慢，实验时间长验时间长 n(二二)层析柱的选择层析柱的选择 n柱子要直，内径均一；下端死区小柱子要直，内径均一；下端死区小 n柱的有效长度越大，洗脱峰之间的距离则越宽，柱的有效长度越大，洗脱峰之间的距离则越宽，分辨率越高。分辨率越高。n过细的柱子，会因管壁效应而影响分离效果过细的柱子，会因管壁效应而影响分离效果 柱层析的柱层析的L/d比值比值n 2、凝胶柱的制备 n 用于分组分离用于分组分离n 短而粗短而粗 L/D值值10 n 用于分级分离用于分级分离n L/D值比较大值比较大 对很难分离的组分一般需要对很难
16、分离的组分一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在左右长的层析柱，其直径在15cm范围内，小于范围内，小于1cm产产生生管壁效应，大于，大于5cm则则稀释现象严重严重。v柱L/D值的选择n 装柱前，凝胶基质用蒸馏水或洗脱液中装柱前，凝胶基质用蒸馏水或洗脱液中充分溶胀。充分溶胀。n 凝胶柱填装后通常可以采用一种凝胶柱填装后通常可以采用一种有色的物质有色的物质，如，如蓝蓝色葡聚糖色葡聚糖-2000、血红蛋白、血红蛋白等上柱，以检测凝胶柱的等上柱，以检测凝胶柱的均匀程度。均匀程度。n(三三)洗脱剂的选择洗脱剂的选择 n能完全溶解欲分离的样品而且对样品的稳定无能完全溶解欲分离的样品而且对样品的稳定无
17、影响；且不影响对样品的监测，并能很快去除。影响；且不影响对样品的监测，并能很快去除。n洗脱剂的离子强度至少洗脱剂的离子强度至少0.2mol/L n(四四)装柱装柱 n层析柱垂直层析柱垂直，气泡排除，气泡排除，一次倾入层析柱，一次倾入层析柱 n洗脱平衡洗脱平衡 n凝胶柱应均匀、无断层、无气泡凝胶柱应均匀、无断层、无气泡 n(五五)上样上样 n样品应预先离心样品应预先离心，均匀地加样，均匀地加样n(六六)洗脱洗脱 n注意控制流速注意控制流速 n降低流速通常能提高分辨率降低流速通常能提高分辨率 n流速过慢，则纵向扩散和对流反会限制分辨率的流速过慢，则纵向扩散和对流反会限制分辨率的提高提高 n流出液用
18、人工或自动部分收集器定量地分部收集流出液用人工或自动部分收集器定量地分部收集 n(七七)保存保存 n加防腐剂或灭菌后，可置冰箱中保存数月加防腐剂或灭菌后，可置冰箱中保存数月 四、凝胶过滤层析的应用四、凝胶过滤层析的应用 n1、主要用于大分子物质：如蛋白质、核酸、主要用于大分子物质：如蛋白质、核酸、多糖等的分离多糖等的分离n2、脱盐、脱盐，放射性同位素，荧光素，放射性同位素，荧光素n3、蛋白质的分子量的测定、蛋白质的分子量的测定 n离心柱层析法离心柱层析法：分子克隆：分子克隆 3、测定高分子物质的分子量测大于所用载体上限分子的洗脱体积测小于下限的分子的洗脱体积标定凝胶过滤柱的Vo标定凝胶过滤柱的
19、Vi测定一系列已知分子量的标淮样品在柱上的洗脱体积Ve以(Ve-Vi)(Vo-Vi)和1ogMw 作图测得了待测分子量的样品的Ve由(Ve-Vi)(Vo-Vi)从标准曲线上可以求得未知样品的分子量蓝色葡聚糖氨基酸、有色盐类以标准样品的分子量的1ogMw对Ve作图 or n 洗脱液中蛋白质浓度4、高分子溶液的浓缩、高分子溶液的浓缩将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外离心或过滤，去除溶胀的凝胶浓缩的高分子溶液5、蛋白质复性研究、蛋白质复性研究变性蛋白加入凝胶柱变性蛋白加入凝胶柱高浓度变性剂高浓度变性剂存在，
20、蛋白呈存在，蛋白呈无规则卷曲无规则卷曲变性蛋白变性蛋白体积大，只体积大，只能能进入颗粒间隙进入颗粒间隙，迁，迁移速度快移速度快变性剂变性剂分子量小，分子量小，进入颗粒内部进入颗粒内部，迁，迁移速度慢移速度慢缓冲液洗脱蛋白变性剂浓度降低，转成复性缓冲液变性蛋白复性，以天然形态洗脱出柱 五、注意事项五、注意事项n(一一)柱床支持物使用不当柱床支持物使用不当 n(二二)凝胶膨胀过程中操作不当凝胶膨胀过程中操作不当 n(三三)凝胶柱、毛细管和流出口处有气泡凝胶柱、毛细管和流出口处有气泡 n(四四)工作压过高工作压过高 n(五五)层析柱的保洁差层析柱的保洁差 第二节第二节 离子交换层析技术离子交换层析技
21、术n离子交换层析离子交换层析(ion-exchange chromatography)n是根据物质所带电荷的差别进行分离纯化的一种是根据物质所带电荷的差别进行分离纯化的一种方法方法 一、离子交换层析的基本原理一、离子交换层析的基本原理n离子交换剂是以纤维素或葡聚糖凝胶等不溶性物离子交换剂是以纤维素或葡聚糖凝胶等不溶性物质为母体质为母体 n引入阳性或阴性离子基团的特殊制剂引入阳性或阴性离子基团的特殊制剂 n带有阳离子基团的交换剂，可置换吸附带负电荷带有阳离子基团的交换剂，可置换吸附带负电荷的物质，称为的物质，称为阴离子交换剂阴离子交换剂 n带阴离子基团的交换剂，则可置换吸附带正电荷带阴离子基团的
22、交换剂，则可置换吸附带正电荷的物质，称为的物质，称为阳离子交换剂阳离子交换剂 n蛋白质分子是两性物质蛋白质分子是两性物质 n不同的蛋白质有不同的等电点，不同的蛋白质有不同的等电点，n与不同类型离子交换剂以不同的亲和力相互交换吸附。与不同类型离子交换剂以不同的亲和力相互交换吸附。n当缓冲液中的离子基团与结合在交换剂上的蛋白质相竞争时当缓冲液中的离子基团与结合在交换剂上的蛋白质相竞争时n亲和力小的蛋白质分子首先被解吸而洗脱亲和力小的蛋白质分子首先被解吸而洗脱n亲和力大的蛋白质则后被解吸与洗脱亲和力大的蛋白质则后被解吸与洗脱n因此，依靠增加缓冲液的离子强度和因此，依靠增加缓冲液的离子强度和/或改变酸
23、碱度，可改变或改变酸碱度，可改变蛋白质的吸附状况，使不同亲和力的蛋白质得以分离。蛋白质的吸附状况，使不同亲和力的蛋白质得以分离。目目 录录离子交换剂的基质离子交换剂的基质 琼脂糖琼脂糖离子交换剂离子交换剂 离子交换离子交换交联葡聚糖交联葡聚糖聚苯乙烯聚苯乙烯离子交换离子交换纤维素纤维素 二、常用离子交换剂的种类及其性质二、常用离子交换剂的种类及其性质n1、离子交换纤维素树脂、离子交换纤维素树脂 n以纤维素为母体，结合一定的离子基团而成。以纤维素为母体，结合一定的离子基团而成。n离子交换纤维素上的交换基团排列疏散，对蛋离子交换纤维素上的交换基团排列疏散，对蛋白质等大分子的吸附不太牢固，用温和的条
24、件白质等大分子的吸附不太牢固，用温和的条件便可将其洗脱下来，因此不会引起大分子变性，便可将其洗脱下来，因此不会引起大分子变性，是分离蛋白质、核酸、抗生素等不太稳定的生是分离蛋白质、核酸、抗生素等不太稳定的生化物质的理想介质。化物质的理想介质。n常用：常用：DEAE-纤维素（二乙基氨基纤维素）纤维素（二乙基氨基纤维素）n CM-纤维素（羧甲基纤维素）纤维素（羧甲基纤维素）u开放性长链和松散的网状结构，有较大的表面积，大分子可自由通过，使它的实际交换容量要比离子交换树实际交换容量要比离子交换树脂大的多。脂大的多。u亲水性，对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢，用较温和的洗脱条件就可达到分离的目的，
25、因此不致引不致引起生物大分子物质的变性和失活。起生物大分子物质的变性和失活。u回收率高回收率高 优点：优点：n2、离子交换葡聚糖凝胶、离子交换葡聚糖凝胶 n葡聚糖凝胶为母体，结合一定的离子基团而成葡聚糖凝胶为母体，结合一定的离子基团而成n交换容量大，一般为离子交换纤维素的交换容量大，一般为离子交换纤维素的3-5倍倍 n由于其是网状结构，因而其不仅具有由于其是网状结构，因而其不仅具有离子交换离子交换能力能力，还同时兼有，还同时兼有分子筛的作用分子筛的作用。基本操作基本操作 缓冲液的选择 层析柱的选择 洗脱流速加样 洗脱洗脱液的监测收集及组分鉴定 离子交换剂的清洗、再生和保存 离子交换剂的处理 离
26、子交换剂的选择n 三、离子交换层析的实验技术三、离子交换层析的实验技术n（一）离子交换剂的选择与处理（一）离子交换剂的选择与处理n有阴阳离子之分外，还有强弱之分有阴阳离子之分外，还有强弱之分 n应根据被分离物质的物理化学性质，即根据其应根据被分离物质的物理化学性质，即根据其所带电荷的种类、数量及所处的环境所带电荷的种类、数量及所处的环境，尤其是，尤其是环境中是否有其它离子，这些离子的电性、数环境中是否有其它离子，这些离子的电性、数量等因素进行选择。量等因素进行选择。n对吸附性强的离子或不稳定的物质，常选用弱对吸附性强的离子或不稳定的物质，常选用弱酸性或弱碱性离子交换树脂，这样易于洗脱和酸性或弱
27、碱性离子交换树脂，这样易于洗脱和再生，也不易破坏被分离物质再生，也不易破坏被分离物质n对于吸附性弱的离子，常选用强酸性或强碱性对于吸附性弱的离子，常选用强酸性或强碱性离子交换树脂，这样可利用碱性或酸性条件增离子交换树脂，这样可利用碱性或酸性条件增强被吸附物的离子化作用。强被吸附物的离子化作用。n分离蛋白质时分离蛋白质时n若在高于其等电点的若在高于其等电点的pH条件下不发生变性，则可条件下不发生变性，则可选用阴离子交换剂；选用阴离子交换剂；n若在低于其等电点的若在低于其等电点的pH条件下，不发生变性，则条件下，不发生变性，则可选用阳离子交换剂；可选用阳离子交换剂；n如果某蛋白质在高于或低于其等电
28、点如果某蛋白质在高于或低于其等电点1个个pH单位的单位的条件下都很稳定，则选用两种离子交换剂中的任何条件下都很稳定，则选用两种离子交换剂中的任何一种均可达到分离目的。一种均可达到分离目的。2、离子交换剂的处理n 酸碱浸泡n 进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子，一般阳离进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子，一般阳离子交换剂最后用碱子交换剂最后用碱NaOH处理，阴离子交换剂最后用酸处理，阴离子交换剂最后用酸HCl处理。处理。u 膨化膨化将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的配基充分暴露出来。u水悬浮水悬浮去除杂质和细小颗粒n(二二)装柱装柱 n
29、一般以直径与长度之比为一般以直径与长度之比为1：15为宜为宜 n当样品量多且组分复杂时，可选用稍长的柱子当样品量多且组分复杂时，可选用稍长的柱子 n用起始缓冲液充分滴注洗脱，至流出液与进柱用起始缓冲液充分滴注洗脱，至流出液与进柱前溶液有相同的前溶液有相同的pH n应注意离子交换树脂在柱中均匀分布应注意离子交换树脂在柱中均匀分布 n(三三)加样加样 n 加样前，样品应预先对起始缓冲液充分透析加样前，样品应预先对起始缓冲液充分透析平衡平衡 n(四四)洗脱洗脱 n增加缓冲液离子强度增加缓冲液离子强度 n改变改变pH n同时改变离子强度与同时改变离子强度与pH n洗脱的方式洗脱的方式 n一步洗脱法一步
30、洗脱法 n分段洗脱法分段洗脱法 n梯度洗脱法：用浓度梯度洗脱法：用浓度(或或pH)连续改变的洗连续改变的洗脱液进行洗脱。脱液进行洗脱。洗脱速度洗脱速度n 洗脱速度通常要保持洗脱速度通常要保持恒定n 洗脱洗脱速度慢比快的比快的分辨率好分辨率好n 如果洗脱峰相对集中某个区域造成如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠重叠，则应适当，则应适当缩小梯度范围或缩小梯度范围或降低洗脱速度降低洗脱速度来提高分辨率；如果来提高分辨率；如果分辨率较好，但分辨率较好，但洗脱峰过宽洗脱峰过宽，则可适当，则可适当提高洗脱速提高洗脱速度度。洗脱液的监测收集及组分鉴定洗脱液的监测收集及组分鉴定n监测监测n 用紫外检测仪进行，在
31、用紫外检测仪进行，在280nm处观察洗脱液的光吸收处观察洗脱液的光吸收n收集收集n 用分布收集器收集，可以自动收集，也可以手动收集用分布收集器收集，可以自动收集，也可以手动收集n鉴定鉴定n 聚丙烯酰胺凝胶电泳、测定活性等聚丙烯酰胺凝胶电泳、测定活性等离子交换剂的清洗、再生和保存离子交换剂的清洗、再生和保存 n 可溶于碱的污染物可溶于碱的污染物n 0.1 mol/L NaOH洗涤洗涤 Milli-Q纯化的蒸馏水洗涤纯化的蒸馏水洗涤 结合缓冲液洗涤结合缓冲液洗涤n 可以除去诸如脂类、蛋白质和核酸这类的污染物。可以除去诸如脂类、蛋白质和核酸这类的污染物。n 对于疏水性污染物对于疏水性污染物n 乙醇溶
32、液（如乙醇溶液（如70%的乙醇）或非离子型的去污剂洗涤的乙醇）或非离子型的去污剂洗涤n 可以除去脂类和其他的疏水性物质。可以除去脂类和其他的疏水性物质。n 金属污染物金属污染物n EDTA饱和的饱和的10 mmol/L HCL（即（即pH=2）处处理柱子理柱子n 沉淀物杂质沉淀物杂质n 去污剂、尿素和盐酸胍，可将柱子在去污剂、尿素和盐酸胍，可将柱子在6 mol/L 的尿素中平衡和温育，然后用去离子水和缓冲液洗的尿素中平衡和温育，然后用去离子水和缓冲液洗涤。涤。n再生再生n 对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。的过程。n 酸碱交替浸
33、泡酸碱交替浸泡n保存保存n 处理洗净蛋白等杂质后，加入适当的防腐剂，一般加处理洗净蛋白等杂质后，加入适当的防腐剂，一般加入入0.02%的叠氮钠，的叠氮钠，4C下下保存。保存。第三节第三节 亲和层析技术亲和层析技术n亲和层析亲和层析(affinity chromatography)n是利用生物分子间的亲和吸附和解吸而设计的层析是利用生物分子间的亲和吸附和解吸而设计的层析方法，即通过固定于水不溶性的固相支持物方法，即通过固定于水不溶性的固相支持物(载体载体)上的互补物上的互补物(配体配体)的特异性，可逆性的吸附而使物的特异性，可逆性的吸附而使物质分离。质分离。n该层析条件温和，过程简单，纯化的倍数
34、高，该层析条件温和，过程简单，纯化的倍数高，n对分离含量低又不甚稳定的生物活性物质极为对分离含量低又不甚稳定的生物活性物质极为有效有效 n专门的吸附剂，并寻找一种专门的层析条件方专门的吸附剂，并寻找一种专门的层析条件方能进行工作。能进行工作。一、亲和层析的基本原理一、亲和层析的基本原理 n生物大分子具有和某些相对应的专一分子生物大分子具有和某些相对应的专一分子(一一般为结构上与其相应的分子般为结构上与其相应的分子)相结合的特性相结合的特性 n这种结合既是特异性的，又是可逆性的；改变这种结合既是特异性的，又是可逆性的；改变条件又能使这种结合解除条件又能使这种结合解除 n生物分子间的这种结合能力，
35、称为亲和力生物分子间的这种结合能力，称为亲和力 n酶的酶的活性部位活性部位和底物、抑制剂、辅助因子和底物、抑制剂、辅助因子n酶的变构中心与变构因子酶的变构中心与变构因子(或称效应物或称效应物)之间之间n抗原与抗体之间抗原与抗体之间n激素与受体之间激素与受体之间n核糖核酸与其互补脱氧核糖核酸之间核糖核酸与其互补脱氧核糖核酸之间 n亲和力亲和力n 生物分子间存在很多特异性的相互作用，如抗原抗生物分子间存在很多特异性的相互作用，如抗原抗体、酶底物或抑制剂、激素受体等，它们之间都能够专体、酶底物或抑制剂、激素受体等，它们之间都能够专一而可逆的结合。一而可逆的结合。n分离原理分离原理n 通过将具有亲和力
36、的两个分子中一个固定在不溶性基通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。进行分离纯化。二、亲和层析的实验技术二、亲和层析的实验技术n载体活化、配体偶联、样品吸附、解吸分离载体活化、配体偶联、样品吸附、解吸分离 n(一一)载体的种类与选择载体的种类与选择 n必须有高亲水性，使生物大分子容易与它接近必须有高亲水性，使生物大分子容易与它接近n它的非特异性吸附要十分小它的非特异性吸附要十分小n它必须具有大量可供活化而能与配体结合的基它必须具有大量可供活化而能与配体结合的基团团n纤维
37、素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃等胺凝胶、多孔玻璃等n纤维素：有比较强的非特异性吸附作用纤维素：有比较强的非特异性吸附作用n葡聚糖凝胶网孔孔径较小，通透性差，葡聚糖凝胶网孔孔径较小，通透性差，n应用最广的是应用最广的是琼脂糖凝胶制品。琼脂糖凝胶制品。n珠状琼脂糖凝胶珠状琼脂糖凝胶(Sepharose 2B、4B和和6B)n溴化氰溴化氰(CNBr)活化活化 n适于偶联各种含游离适于偶联各种含游离-NH2的配体的配体n珠状琼脂糖凝胶亲水性强，理化性质稳定，具珠状琼脂糖凝胶亲水性强，理化性质稳定，具有疏松的网状结构有疏松的网状结构 n在亲和
38、层析中，常用小分子物质作为配体亲和在亲和层析中，常用小分子物质作为配体亲和吸附与其相配的大分子物质。吸附与其相配的大分子物质。n在载体与配体之间引入一在载体与配体之间引入一“手臂手臂”(间臂间臂)，配配体就得以伸人溶液，从而可大大提高吸附效率。体就得以伸人溶液，从而可大大提高吸附效率。n间臂的长度要恰当，太短效果不显著，太长易间臂的长度要恰当，太短效果不显著，太长易造成弯曲折叠，反而减小吸附能力造成弯曲折叠，反而减小吸附能力 (二二)配体的选择配体的选择 n好的配体是亲和层析的基础好的配体是亲和层析的基础 n1、配体必须有对所纯化物质的特异性和可逆性的亲和作用配体必须有对所纯化物质的特异性和可
39、逆性的亲和作用亲和力太弱，不足以用于亲和层析有效地纯化所需要的物质亲和力太弱，不足以用于亲和层析有效地纯化所需要的物质亲和力太强，要想使被结合物不失活而被洗脱，则可能很困难亲和力太强，要想使被结合物不失活而被洗脱，则可能很困难 n 2配体必须具有在活性部位以外的化学上可修饰的基团配体必须具有在活性部位以外的化学上可修饰的基团：通过这些基团，配体可与载体偶联，而不破坏其与亲和分子结通过这些基团，配体可与载体偶联，而不破坏其与亲和分子结合的活性。合的活性。n(三三)载体活化与配体偶联载体活化与配体偶联 n充分膨胀与洗涤后充分膨胀与洗涤后，在搅拌下滴加溴化氢，在搅拌下滴加溴化氢 npH保持在保持在1
40、1，偶联反应在，偶联反应在pH810范围最有效范围最有效n回旋偶联回旋偶联2小时，或小时，或4偶联过夜偶联过夜 n封闭载体上未被配体偶联的所有活性位点封闭载体上未被配体偶联的所有活性位点 n 配体配体n 与待分离的物质有适当的亲和力与待分离的物质有适当的亲和力n 与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性n 与载体稳定的共价结合与载体稳定的共价结合n 自身应具有较好的稳定性自身应具有较好的稳定性 配体的分类配体的分类n 特异性配体特异性配体n 只与只与单一单一或或很少种类很少种类的蛋白质等生物大分子结合的蛋白质等生物大分子结合的配体的配体 n eg.e
41、g.抗原和抗体、酶和它的抑制剂抗原和抗体、酶和它的抑制剂n n 通用性配体通用性配体n 特异性不是很强，能和特异性不是很强，能和某一类某一类的蛋白质等生物大的蛋白质等生物大分子结合的配体分子结合的配体 n eg.eg.凝集素可以结合各种糖蛋白凝集素可以结合各种糖蛋白 蛋白质亲和层析中的合适配体蛋白质亲和层析中的合适配体基本操作n 选择适当的配体选择适当的配体n 将配体固定化到基质上将配体固定化到基质上n 将目的蛋白混合液加样到基质上将目的蛋白混合液加样到基质上n 除去非特异性结合的蛋白质除去非特异性结合的蛋白质n 洗脱纯的目的蛋白洗脱纯的目的蛋白上样上样n 层析柱较短，通常层析柱较短，通常10
42、cm 左右左右n 样品液的浓度不宜过高样品液的浓度不宜过高n 上样时流速比较慢上样时流速比较慢n 样品缓冲液中有一定的的离子强度样品缓冲液中有一定的的离子强度n 上样时选择适当较低的温度上样时选择适当较低的温度 n(四四)层析层析 n为使样品吸附完全，亲和层析可为使样品吸附完全，亲和层析可反复上样反复上样 n当被分离的混合液通过亲和层析柱时，相应的当被分离的混合液通过亲和层析柱时，相应的分子与配体发生特异性亲和反应而被吸附，其分子与配体发生特异性亲和反应而被吸附，其它杂质则流出柱外。然后，需要用适当的洗脱它杂质则流出柱外。然后，需要用适当的洗脱缓冲液将被吸附的物质解吸下来。缓冲液将被吸附的物质
43、解吸下来。n 1.专一性洗脱专一性洗脱：用于亲和结合力相对弱的物：用于亲和结合力相对弱的物质质，洗脱剂是通过竞争性的与配体结合而将，洗脱剂是通过竞争性的与配体结合而将被分离物解吸洗脱下来的被分离物解吸洗脱下来的 n2非专一性洗脱非专一性洗脱：n(1)pH变化变化：n用用pH梯度洗脱比用单一梯度洗脱比用单一pH洗脱更为有效洗脱更为有效 n（2）离子强度变化）离子强度变化：nNaC1是最常用于增加离子强度的试剂是最常用于增加离子强度的试剂 n(3)改变洗脱液的极性改变洗脱液的极性 n(4)变形洗脱剂变形洗脱剂 n在洗脱后必须立即除去变性剂，以避免其长时间的变在洗脱后必须立即除去变性剂，以避免其长时
44、间的变性作用而使生物分子失活性作用而使生物分子失活 n(五五)纯化产物脱盐纯化产物脱盐 n(六六)亲和吸附剂的再生与贮存亲和吸附剂的再生与贮存 n 三、注意事项三、注意事项n1溴化氰活化溴化氰活化Sepharose 4B的反应，最适的反应，最适pH是是11n2应绝对避免使用电磁搅拌，以免引起载体珠形结构的破坏应绝对避免使用电磁搅拌，以免引起载体珠形结构的破坏 n3应采取适当低的流速应采取适当低的流速n4用极性用极性pH进行洗脱时，为防止极性进行洗脱时，为防止极性pH对生物分子活性的影对生物分子活性的影响，每收集一管洗出液，即进行响，每收集一管洗出液，即进行pH调整，使接近中性。调整，使接近中性
45、。n5.对于结合弱的物质，可以待样品进入胶柱后，关封出口，让样对于结合弱的物质，可以待样品进入胶柱后，关封出口，让样品在柱中停留一段时间（甚至过夜），使其能被充分结合品在柱中停留一段时间（甚至过夜），使其能被充分结合 专一性洗脱 优点：特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。可避免蛋白质变性缺点：较常的时间、较大的洗脱条件。改善方法：选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度 专一性洗脱非专一性洗脱与配体亲和力较小 连续大体积平衡缓冲液冲洗，不影响活性，但洗脱体积较大，待分离物质浓度较低。配体结合较强时 适当的pH、离子强度洗脱，注意尽量不影响待分离物质的活性与配体结合非
46、常牢固时 使用较强的酸、碱或在洗脱液中加入脲、胍等变性剂，使蛋白质等待分离物质变性，洗脱后再复性 (五五)纯化产物脱盐纯化产物脱盐n 洗脱所得的亲和层析产物常含有盐类等小分洗脱所得的亲和层析产物常含有盐类等小分子物质，可经子物质，可经SephadexG-25柱层析除去。柱层析除去。用变性剂洗脱时，为保护生物活性，洗脱后应用变性剂洗脱时，为保护生物活性，洗脱后应将被纯化的物质立即转移到温和的条件，或立将被纯化的物质立即转移到温和的条件，或立即进行透析，以除去变性剂等。即进行透析，以除去变性剂等。(六六)亲和吸附剂的再生与贮存亲和吸附剂的再生与贮存 n通常亲和层析后，经通常亲和层析后，经10个柱床
47、体积的含个柱床体积的含0.5mol/L NaCl的的pH8.5的的0.1mol/L Tris-HCL缓冲液和缓冲液和10个柱床体积的含个柱床体积的含0.5mol/L NaCl的的0.1mol/L、pH4.5的醋酸钠缓冲液洗涤后即的醋酸钠缓冲液洗涤后即获再生，用起始缓冲液平衡后即可再用。获再生，用起始缓冲液平衡后即可再用。n暂时不用的冻干的亲和产物应该贮在暂时不用的冻干的亲和产物应该贮在8以下或冰冻；但是，已以下或冰冻；但是，已经溶胀的亲和产物不能冰冻，而应加上防腐剂后贮于经溶胀的亲和产物不能冰冻，而应加上防腐剂后贮于8以下。以下。第四节第四节 吸附层析技术吸附层析技术n吸附层析：（吸附层析：（
48、adsorption chromatography)n 是以吸附剂为固定相，使混合物随流动相流是以吸附剂为固定相，使混合物随流动相流经固定相时，按其吸附力的大小而得到分离的经固定相时，按其吸附力的大小而得到分离的技术；物质的这种物理吸附作用，能量比较低，技术；物质的这种物理吸附作用，能量比较低，洗脱比较容易，吸附剂比较容易获得洗脱比较容易，吸附剂比较容易获得 一、吸附层析的基本原理一、吸附层析的基本原理 n在表面上聚集的现象称为被吸附在表面上聚集的现象称为被吸附(adsorption)n凡能够将其它物质聚集到其表面的物质称为吸附剂凡能够将其它物质聚集到其表面的物质称为吸附剂 n而被聚集到吸附剂
49、表面的物质就称为被吸附物而被聚集到吸附剂表面的物质就称为被吸附物n一种吸附剂不仅对不同的物质具有不同的吸附力，而一种吸附剂不仅对不同的物质具有不同的吸附力，而且在不同的条件下，对同一种物质的吸附作用也不相且在不同的条件下，对同一种物质的吸附作用也不相同。在相同条件下，吸附过程和解吸（附）过程是同同。在相同条件下，吸附过程和解吸（附）过程是同时进行的，即是可逆的。时进行的，即是可逆的。n各种待分离的分子在不断解吸、吸附，再解吸，各种待分离的分子在不断解吸、吸附，再解吸，再吸附的过程中下移，它们移动的速度与吸附再吸附的过程中下移，它们移动的速度与吸附剂对该分子的吸附力的强弱及洗脱剂对该分子剂对该分
50、子的吸附力的强弱及洗脱剂对该分子的溶解能力有关。的溶解能力有关。二、吸附层析实验技术二、吸附层析实验技术n(一一)吸附剂的选择及处理吸附剂的选择及处理 n氧化铝、活性炭、硅胶、硅酸盐、磷酸氧化铝、活性炭、硅胶、硅酸盐、磷酸 n具有最大的表面积和吸附能力具有最大的表面积和吸附能力n对待分离的各种物质有不同的吸附力，对待分离的各种物质有不同的吸附力，n(二二)装柱与上样装柱与上样：脱气处理：脱气处理 n(三三)洗脱剂与洗脱洗脱剂与洗脱：不起化学反应：不起化学反应，对样品，对样品的溶解度大而又易从样品中除去；粘度小流的溶解度大而又易从样品中除去；粘度小流动性好动性好 n羟基磷灰石柱层析在分离单链与双
