1、第二十章第二十章重组重组DNADNA技术技术recombinant DNA technique 第一节第一节 重组重组DNADNA技术的基本过程技术的基本过程Basic Process of Basic Process of Recombinant DNA Recombinant DNA Technology Technology*2 是在体外将不同来源的是在体外将不同来源的或或 插插入入，构建成，构建成并将它导入到并将它导入到合适的合适的，使其在细胞中扩增和繁殖，使其在细胞中扩增和繁殖，；再进行扩增、；再进行扩增、。*3 亦称亦称，或或。获取这类同一的获取这类同一的DNADNA分子群体、细胞
2、群体或个体分子群体、细胞群体或个体群体的过程，即无性繁殖。群体的过程，即无性繁殖。又称嵌合又称嵌合DNADNA（chimera DNAchimera DNA），采用克隆技术把），采用克隆技术把来自不同生物的外源来自不同生物的外源 DNADNA插入载体分子所形成的杂合插入载体分子所形成的杂合DNADNA分子。分子。*4 指从同一始祖经无性繁殖传代而来的一群遗传指从同一始祖经无性繁殖传代而来的一群遗传上同一的上同一的DNADNA分子、细胞或个体；分子、细胞或个体；*5思考题思考题 1 1*6*7思考题思考题 1 1*8Common Enzymes Used in RecombinantDNA Te
3、chnology 是一类能识别双链是一类能识别双链DNADNA中的某些中的某些，并由此切割，并由此切割DNADNA双链的核酸内切酶，又称为双链的核酸内切酶，又称为主要是从原核生物主要是从原核生物中分离纯化而来。中分离纯化而来。与与共同构成细菌的共同构成细菌的，限，限制外源制外源DNADNA，保护自身，保护自身DNADNA。*9第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次
4、序。H Hinind d 属属 种种 株株 序序Haemophilus Haemophilus ininfluenzae fluenzae d d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌 d d株的第三种酶株的第三种酶*10和和型限制酶通常是相对型限制酶通常是相对反应过程中反应过程中需有需有MgMg2+2+和和ATPATP参与参与。、和和型（基因工程技术中常用型（基因工程技术中常用型）。型）。型限制酶通常以型限制酶通常以同源二聚体同源二聚体形式存在，形式存在，只具只具有核酸内切酶活性有核酸内切酶活性而无甲基化酶活性，反应过程中而无甲基化酶活性，反应过程中只需有只需有MgMg2+2+参与参与而不需有而不需有
5、ATPATP参与。参与。*11 类酶识别序具有类酶识别序具有回文结构回文结构(palindrome)(palindrome)特点，特点，即具有即具有双重旋转对称结构双重旋转对称结构的的DNADNA反向重复双链序列。反向重复双链序列。型型 大部分大部分型限制酶都能识别由型限制酶都能识别由4 48 8个核苷酸组个核苷酸组成的特定序列。成的特定序列。*12思考题思考题 2 2*13图图20-3 20-3 限制酶限制酶EcoEcoRR对双链对双链DNADNA分子的切割作用分子的切割作用Bam Bam HHGGATCCGGATCCCCTAGGCCTAGGGTCGTCCAGCAGGACGACCTGCTG平
6、端切口平端切口G GCCTAGCCTAGGATCCGATCC G G粘端切口粘端切口HinHinddGTCGACGTCGACCAGCTGCAGCTG平或钝末端（平或钝末端（blunt end)blunt end)粘性末端（粘性末端（sticky end)sticky end)*14GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst 来源不同但能识别相同序列，切割来源不同但能识别相同序列，切割 DNADNA后产生后产生相同的黏性末端的限制酶，又称同功异源酶。相同的黏性末端的限制酶，又称同功异源酶。*15 GGATCC CCTAGG
7、 AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A 识别序列不完全相同，但切割识别序列不完全相同，但切割 DNADNA后，产生相同的黏后，产生相同的黏性末端的限制酶称为同尾酶。这两个相同的黏性末端称为性末端的限制酶称为同尾酶。这两个相同的黏性末端称为配伍未端配伍未端(compatible end)(compatible end)。*16 识别识别DNADNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过识别序列往往超过6 6个核苷酸。为个核苷酸。为型限制酶的特例。型限制酶的特例。Bstp GGTNACC CCANTGG
8、*17 Bbl CGGN(N)4CCG;GCC(N)4NGGC 重组重组DNADNA技术、基因组技术、基因组DNADNA物理图谱绘制、基因组物理图谱绘制、基因组DNADNA同源性研究、切割基因组同源性研究、切割基因组DNADNA或或cDNAcDNA构建基因组文构建基因组文库或库或cDNAcDNA文库等。文库等。DNADNA纯度、结构及甲基度程度；酶切反应的温度、纯度、结构及甲基度程度；酶切反应的温度、时间及缓冲液体系等。时间及缓冲液体系等。*18 只能封闭只能封闭DNADNA链上的链上的缺口（缺口（nicknick）,而不能封闭而不能封闭裂口（裂口（gapgap）。）。需要在一条需要在一条DN
9、ADNA链的链的3 3 末端具有游离的羟基、另末端具有游离的羟基、另一条一条DNADNA链的链的5 5 末端有磷酸基团，而且反应过程需要末端有磷酸基团，而且反应过程需要由由ATPATP提供能量。提供能量。*19 连接的底物可以是两个双链连接的底物可以是两个双链DNADNA分子的互补分子的互补黏性黏性末端末端或或平末端平末端。最早是从。最早是从T4T4噬菌体感染的大肠埃希噬菌体感染的大肠埃希菌分离，易制备，应用广。菌分离，易制备，应用广。只能连接具有互补只能连接具有互补黏性末端黏性末端的两个双链的两个双链DNADNA分子分子底物。需要底物。需要NADNAD+作为辅助因子。作为辅助因子。*20*G
10、AATTC*CTTAAG*5353EcoR IDNA连接酶连接酶*G*C T T A A 5335OHPA A T T C*G*5335 P OH+*21*AGCT*TCGA*5353Alu IT4 DNA连接酶连接酶OHP5335*TC*AG5335 OHPCT*GA*+*22*23*24 能够催化以能够催化以DNADNA或或RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA的反应，的反应，把脱氧核糖核苷酸连续地添加到双链把脱氧核糖核苷酸连续地添加到双链DNADNA分子或引分子或引物链的物链的3 3-OH-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。末端，催化核苷酸的聚合作用。具有具有 具有具有*25依赖依赖
11、RNARNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。具有具有活性活性对对MgMg2+2+浓度非常敏感。浓度非常敏感。是第一个被发现的、耐热的、依赖是第一个被发现的、耐热的、依赖DNADNA的的DNADNA聚聚合酶，合酶，普遍使用的是来源于普遍使用的是来源于AMV(鸟类成髓细胞白血鸟类成髓细胞白血病病毒病病毒)及及M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒莫洛尼鼠白血病病毒)的反转录的反转录酶，酶，具有具有*26 （terminal deoxynucleotidyl transferaseterminal deoxynucleotidyl transferase）(1)(1)底物是底物是或有或有。5533OHCo2
12、+dNTPnppi5533(A/G/C/T)n)n*27(2)(2)底物是底物是或或的双链的双链DNADNA。Co2+dNTPnppi53OH53(A/G/C/T)nCo2+dNTPnppi53OH53(A/G/C/T)n （1 1）主要作用是在载体或目的基因）主要作用是在载体或目的基因 33末端加上末端加上同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于DNADNA重组。重组。（2 2）DNA 3DNA 3末端的同位素标记。末端的同位素标记。*28 （alkaline phosphatasealkaline phosphatase）能特异地切除能特异地切除DNADNA
13、、RNARNA和和dNTPdNTP上上5-5-磷酸基团磷酸基团。（polynuleotide kinasepolynuleotide kinase）又称又称T4T4多核苷酸激酶，能催化多核苷酸激酶，能催化ATPATP的的-磷酸基磷酸基团转移到团转移到DNADNA或或RNARNA片段的片段的5-OH5-OH末端末端。*29重组重组DNADNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶Common Vectors in Recombinant DNA Technology*31 是在克隆载体的基础上，增添了与宿主细胞相适是在克隆载体的基础上，增添了与宿主细胞相适应的应的强启动子强启动子，以及有利于表达产
14、物分泌、分离或纯，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。化的元件。复制起始点复制起始点oriCoriC，*32复制起始点，复制起始点，*33最常用的目的基因最常用的目的基因用于克隆大片段用于克隆大片段DNADNA(自习自习)用于用于SangerSanger双脱氧双脱氧DNADNA测序测序(自自习习)构建基因组构建基因组DNADNA或或cDNAcDNA文库文库(自习自习)包括人或哺乳动物病毒、昆虫及植物包括人或哺乳动物病毒、昆虫及植物病病 毒用于在真核细胞中表达目的蛋白毒用于在真核细胞中表达目的蛋白(自习自习)用于更大用于更大DNADNA片段的克隆片段的克隆(自习自习)*34细菌培养细菌培养
15、染色质染色质质粒质粒 严紧型质粒（严紧型质粒（stringent plaxmidstringent plaxmid）松弛型质粒（松弛型质粒（relaxed plaxmidrelaxed plaxmid）AmprORITetr两个抗性基因，用两个抗性基因，用于筛选阳性克隆。于筛选阳性克隆。两个酶切位点，用两个酶切位点，用于插入目的基因于插入目的基因复制起始点，保证复制起始点，保证高拷贝自我复制高拷贝自我复制。*36 目的基因与目的基因与 pBR322经经BamH I酶切后重组如何酶切后重组如何筛选得到阳性克隆？筛选得到阳性克隆？TetTet平板平板123456789101112123456789
16、101112Amp*37*38AmpTetDNA连接酶连接酶重组质粒重组质粒目的基因目的基因AmprTetrPst I 目的基因与目的基因与 pBR322经经Pst I酶切后进行重组如何酶切后进行重组如何筛选得到阳性克隆？筛选得到阳性克隆？课堂讨论课堂讨论*39用用Pst I酶切酶切OripUC192686 bpAmprP(BLA)PlacAva I(413)BamHI(418)Eco RI(397)Hin dIII(448)Pst I(440)Sma I(415)Xma I(413)Apa LI(178)Apa LI(1121)Apa LI(2367)MCS提供多个单酶提供多个单酶切位点用于
17、克切位点用于克隆操作隆操作Lac Z蓝白斑筛选阳蓝白斑筛选阳性克隆性克隆*40*41*42蓝色菌落：阴性克隆蓝色菌落：阴性克隆;白色菌落：阳性克隆白色菌落：阳性克隆*43思考题思考题 3 31.1.能在体外转录克隆基因的质粒载体能在体外转录克隆基因的质粒载体 由由pUCpUC系列质粒载体派生而来，带有来自噬菌体系列质粒载体派生而来，带有来自噬菌体T7T7、SP6SP6的启动子，为的启动子，为RNARNA聚合酶的附着提供了特异聚合酶的附着提供了特异性识别位点。如性识别位点。如pGEM-3Z/4Z.pGEM-3Z/4Z.2.2.穿梭质粒载体（穿梭质粒载体（shuttle plasmid vecto
18、rshuttle plasmid vector）是一类人工构建的，具有两种不同复制起始点是一类人工构建的，具有两种不同复制起始点和选择标记，可在两种不同的宿主细胞中存活和复和选择标记，可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。制的质粒载体。*44 许多耐热的许多耐热的DNADNA聚合酶聚合酶(如如等等)扩增时，扩增时，都在都在PCRPCR产物产物3-3-末端加上了末端加上了A A碱基。碱基。335PCR产物产物AA5Taq酶酶T载体载体TT5533*45在连接酶的作用下可直接将在连接酶的作用下可直接将PCRPCR产物克隆到产物克隆到TATA载体中。载体中。（自习）（自习）野生野生噬菌体的基
19、因组为线状双链噬菌体的基因组为线状双链 DNADNA，两端两端为为12bp12bp彼此完全互补，称之为彼此完全互补，称之为 的的；进入宿主细胞后形成坏状双链结构，；进入宿主细胞后形成坏状双链结构，按按方式及滚环方式进行复制。方式及滚环方式进行复制。感染细菌后，可进入感染细菌后，可进入及溶及溶。*46 可容纳可容纳7 kb7 kb以下以下的外源片段。的外源片段。在阻遏剂在阻遏剂CICI基因和基因和lacZlacZ基因上，有供外源基因上，有供外源基因片段插入的单一内切酶位点。基因片段插入的单一内切酶位点。可容纳可容纳9 923kb23kb的外源片段。具有两个或两组内的外源片段。具有两个或两组内切酶
20、位点，经酶切除去基因组中噬菌体正常生长非切酶位点，经酶切除去基因组中噬菌体正常生长非必需的序列，由外源基因片段取代。必需的序列，由外源基因片段取代。*47 分子小，分子小，；含质粒自主复制成分含质粒自主复制成分ORIORI，和耐药基因，和耐药基因AmpAmpr r；含带有一个或多个单一酶切位点的多聚物接头；含带有一个或多个单一酶切位点的多聚物接头；含含 噬菌体噬菌体coscos黏性末端及与包装有关的短序列；黏性末端及与包装有关的短序列；又称又称柯斯质粒柯斯质粒(cos site-carrying(cos site-carrying plasmid,cosmid),plasmid,cosmid)
21、,是由是由 噬菌体的噬菌体的coscos黏性末黏性末端和细菌的质粒构建而成。端和细菌的质粒构建而成。接上在真核细胞生活的元件，如接上在真核细胞生活的元件，如SV40SV40复制区及启复制区及启 动子，动子，*50*51基因组为闭环单链基因组为闭环单链DNADNA，感染雄性大，感染雄性大肠埃希菌后，在菌体内复制成相当于质粒的肠埃希菌后，在菌体内复制成相当于质粒的双链双链DNADNA，可用作基因克隆载体。，可用作基因克隆载体。M13mp M13mp系列系列(携带有携带有 含含MCSMCS序列的序列的lacZlacZ基因基因),),外源外源DNADNA不宜大于不宜大于1500 bp1500 bp。是
22、一类从是一类从pUCpUC载体派生载体派生而来的噬菌粒载体。而来的噬菌粒载体。当当RFRF型型M13M13在细菌内达到在细菌内达到100100200200个拷贝后，个拷贝后，M13M13只合成单链只合成单链DNADNA，并包装成噬菌体颗粒分泌到细胞外。，并包装成噬菌体颗粒分泌到细胞外。可用于可用于DNADNA测序、体外定点突变和核酸杂交。测序、体外定点突变和核酸杂交。*52 pBluescript SK（+/-）噬菌粒载体的分子结构示意图。）噬菌粒载体的分子结构示意图。SK表示多克隆位点表示多克隆位点区的一种取向，即区的一种取向，即lacZ基因是按照基因是按照SacIKpnI的方向转录；（的方
23、向转录；（+/-）表示单链）表示单链噬菌体噬菌体f1复制起点的两种相反的取向。复制起点的两种相反的取向。（自习）（自习），简称，简称YACYAC载体，由酵母染载体，由酵母染色体、酵母色体、酵母2 2mDNAmDNA质粒的复制起始序列等元件衍生质粒的复制起始序列等元件衍生而成；可插入而成；可插入100kb100kb2,000kb2,000kb外源外源DNADNA片段，是人类片段，是人类基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体。基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体。，简称，简称BACBAC载体，以细菌载体，以细菌F F因因子为基础构建而成；可插入子为基础构建而成；可插入100kb100kb300k
24、b300kb外源外源DNADNA片片段，是人类基因组计划中序列分析采用的主要载体。段，是人类基因组计划中序列分析采用的主要载体。*54*55逆转录病毒逆转录病毒(retrovirus,RV)(retrovirus,RV)慢病毒慢病毒(lentivirus):(lentivirus):也属于也属于RVRV家族家族腺病毒腺病毒(adenovirus,Ad)(adenovirus,Ad)腺相关病毒腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)(adeno-associated virus,AAV)单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)(her
25、pes simplex virus,HSV)埃埃-巴二氏病毒巴二氏病毒 (Epstein-Barr virus,EBV)(Epstein-Barr virus,EBV)痘苗病毒痘苗病毒(vaccinia virus)(vaccinia virus)（自习）（自习）*56第四节第四节目的基因的获得和体外重组目的基因的获得和体外重组Target DNA Acquirement and Recombinant In Vitro*57 要求已知目的基因的核苷酸序列或其产物的要求已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。氨基酸序列。要求已知目的基因的全序列或基因片段两侧要求已知目的基因的全序列或基因
26、片段两侧的的DNADNA序列。序列。DNADNA文库文库(genomic DNA library)(genomic DNA library)cDNAcDNA文库文库(cDNA library)(cDNA library)*58思考题思考题 4 4*已知氨基酸序列推测可能的已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。序列。*59*避免使用稀缺密码子，及宿主细胞的密码偏好。避免使用稀缺密码子，及宿主细胞的密码偏好。反反转转录录AAnATTnT 55mRNA反转录酶反转录酶mRNAcDNA3TTnTAAnA核糖核酸酶核糖核酸酶HTTnT3cDNA核酸酶核酸酶S1双链双链cDNA35 35 5加热变性加热变性
27、加入加入特异性引物特异性引物DNA聚合酶聚合酶重复上述步骤重复上述步骤扩增出大量的产物扩增出大量的产物聚聚合合酶酶链链式式反反应应退火退火延伸延伸*61限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 gDNA文库文库*62mRNA cDNA
28、 双链双链cDNA cDNA分子分子 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制2.cDNA文库的构建文库的构建*63限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 7 Kb DNA 片段片段 cos LR cos7 Kb 外源外源 cDNA 片段片段 cDNA文库文库c DNA 片段片段 *64gDNA文库：文库：g-文库文库cDNA文库：文库：c-文库文库方法：方法：用 目
29、 的 基 因用 目 的 基 因上的一段上的一段DNADNA做成做成探针与文库中的探针与文库中的DNADNA作核酸杂交，作核酸杂交，从 基 因 文 库 中从 基 因 文 库 中“钓出钓出”有目的有目的基因的克隆。基因的克隆。3.从基因文库中筛选目的基因从基因文库中筛选目的基因*65Screening a genomic library by colony hybridization.Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶，连接酶，15C目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGA
30、TCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG目的基因目的基因自连自连载体载体自连自连GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATT
31、CGGATCTAT4 DNA连接酶，连接酶，15C重组体重组体*68目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连连接酶，接酶，15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连*69Eco RCCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco R由平端加由平端加上新的酶切位上新的酶切位点，再用限制点，再用限制酶切除产生粘酶切除产生粘性末端，而进性末端，而进行粘端连接行粘端连接。*705 3 3 5 载体载体DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT
32、3 5 5 3 3 5 T(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nT重组体重组体3 A(A)nA A(A)nA3 5 5*71PCR扩增扩增+335PCR产物产物AA5T载体载体TT5533蓝白筛选蓝白筛选Taq酶酶*72*73Inporting,Screening and Verification of Recombinant DNA 处于感受态处于感受态 对载体无严格限制对载体无严格限制 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷 不对外源不对外源DNADNA进行修饰进行修饰 能表达重组体所提供表型特征能表达重组体所提供表型特征 将体外构建的重组将体外构建的重组DNADNA分子导入用于复制
33、、分子导入用于复制、扩增和表达的扩增和表达的原核或真核受体细胞原核或真核受体细胞。*74 指将质粒指将质粒DNADNA或以质粒为载体构建的重组或以质粒为载体构建的重组DNADNA导入导入细菌（原核细胞）的过程。如大肠杆菌细菌（原核细胞）的过程。如大肠杆菌K12K12突变株低突变株低渗渗CaClCaCl2 2,0,0处理进入感受态。处理进入感受态。指将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的重组指将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的重组DNA DNA 分子导入真核细胞的过程。分子导入真核细胞的过程。指以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重组指以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重组DNADNA，经体外包装
34、成具有感染性的噬菌体或病毒颗粒，经体外包装成具有感染性的噬菌体或病毒颗粒后，通过感染宿主细胞而借助外壳蛋白将重组后，通过感染宿主细胞而借助外壳蛋白将重组DNADNA注注入到细菌或真核细胞内复制扩增的过程。入到细菌或真核细胞内复制扩增的过程。*751.1.磷酸钙介导的转染磷酸钙介导的转染2.DEAE-2.DEAE-葡聚糖介导的转染葡聚糖介导的转染*76思考题思考题 5 5非转化子非转化子(不能生长）不能生长）自身环化载体自身环化载体未酶解完全载体未酶解完全载体非目的基因插入载体非目的基因插入载体*77*78A typical bacterial transformation experiment
35、.组氨酸缺陷型组氨酸缺陷型大肠杆菌大肠杆菌无组氨酸的培养基无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脱水酶酸脱水酶促进组氨酸合成促进组氨酸合成 DNADNA重组体重组体标志补救标志补救*81 是从基因文库中挑选含有目的基因的阳性克隆是从基因文库中挑选含有目的基因的阳性克隆的常用方法。的常用方法。根据根据MCSMCS两侧的保守序列设计引物，对提取的重两侧的保守序列设计引物，对提取的重组载体进行组载体进行PCRPCR扩增鉴定，并可直接进行测序。扩增鉴定，并可直接进行测序。*82 利用特异性抗体与目的基因表达的蛋白质相互利用特异性抗体与目的基因表达的蛋白质相互结合结合通过放射免疫、化学发光通过放
36、射免疫、化学发光来筛选转化菌。来筛选转化菌。用插入点的限制酶酶切重组用插入点的限制酶酶切重组DNADNA，行琼脂糖凝胶，行琼脂糖凝胶电泳，根据是不有目的基因和载体的泳带来判断重电泳，根据是不有目的基因和载体的泳带来判断重组成功与否。组成功与否。质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）gDNA文库文库 cDNA化学合成化学合成RT-PCR限制酶消化限制酶消化连接酶连接酶转化转化、转染、感染、转染、感染筛选筛选*83*84Exogenous Gene Expression第六节第六节外源基因的表达外源基因的表达包括：包括：涉及目的基因的涉及目的基因的克隆、扩增克隆、扩增
37、，转转录、翻译录、翻译，蛋白质产物的加工修饰蛋白质产物的加工修饰，以及，以及分离、纯分离、纯化化等过程，需要在适合的等过程，需要在适合的表达系统表达系统中完成。中完成。表达系统可根据受体细胞的不同分为表达系统可根据受体细胞的不同分为和和。*85思考题思考题 6 6 表达载体表达载体的构建；的构建；受体细胞受体细胞的建立；的建立；表达产物的分离、纯化等技术表达产物的分离、纯化等技术和策略。和策略。产产 品品功功 能能组织型纤溶酶原激活物组织型纤溶酶原激活物抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞
38、生成素促红细胞生成素剌激红细胞生成剌激红细胞生成生长因子生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗肿瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO,酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱 重组重
39、组DNADNA医药产品医药产品优点优点:*87培养简单、迅速、经济而又适合大规模生产。培养简单、迅速、经济而又适合大规模生产。缺点缺点:外源真核基因不能带有外源真核基因不能带有5 5 端非编码区和内含子结端非编码区和内含子结 构构，必须用，必须用cDNAcDNA或化学合成基因或化学合成基因；外源基因必须置于原核细胞的外源基因必须置于原核细胞的强启动子强启动子和和SDSD序列序列 等元件控制下；等元件控制下；重组载体必须形成重组载体必须形成；外源基因转录生成的外源基因转录生成的mRNAmRNA必须相对稳定并能被有必须相对稳定并能被有 效翻译效翻译，所表达的，所表达的蛋白质产物稳定且对宿主菌不蛋白
40、质产物稳定且对宿主菌不 能有毒害作用能有毒害作用。*88*89外源目的基因不与其他基因融合，外源目的基因不与其他基因融合，直接从起始密码直接从起始密码AUG开始在原核调控元件控制下开始在原核调控元件控制下 表达蛋白质。表达蛋白质。蛋白质致密蛋白质致密地集聚在细胞内地集聚在细胞内水不溶性水不溶性*90*91*92 大多是穿梭载体大多是穿梭载体*93 病毒感染（天然方法病毒感染（天然方法 ）载体转染（化学或物理方法载体转染（化学或物理方法 ）新霉素抗性选择系统新霉素抗性选择系统 胸苷激酶基因胸苷激酶基因HATHAT选择系统选择系统 二氢叶酸还原酶基因选择系统二氢叶酸还原酶基因选择系统 *94 常用
41、的瞬时表达宿主是来源于非洲绿猴肾常用的瞬时表达宿主是来源于非洲绿猴肾CV-1CV-1细胞的细胞的COSCOS细胞。细胞。常用的稳定表达宿主细胞是来源于中国仓鼠卵常用的稳定表达宿主细胞是来源于中国仓鼠卵巢的巢的CHOCHO细胞。细胞。*95*96第七节第七节重组重组DNADNA技术的应用技术的应用Application of recombinant DNA technique 自习自习重组重组DNADNA技术的主要应用技术的主要应用 (1)克隆目的基因，研究疾病相关基因的结构与克隆目的基因，研究疾病相关基因的结构与功能，表达具有生物学活性的蛋白质；功能，表达具有生物学活性的蛋白质；(2)利用定点
42、突变技术，研究蛋白质的结构与功利用定点突变技术，研究蛋白质的结构与功能，或对蛋白质进行结构改造；能，或对蛋白质进行结构改造；(4)开发基因工程药物与疫苗用于疾病治疗；开发基因工程药物与疫苗用于疾病治疗；(3)利用转基因技术和基因剔除技术研究基因功利用转基因技术和基因剔除技术研究基因功能，建立转基因动物模型；能，建立转基因动物模型；(5)建立基因诊断、鉴定与基因治疗的新方法。建立基因诊断、鉴定与基因治疗的新方法。学习要求学习要求 1.1.掌握重组掌握重组 DNA DNA 技术的相关概念、基本原理和主技术的相关概念、基本原理和主要步骤。要步骤。(ppt3ppt3)5.5.熟悉重组体导入受体细胞及筛选方法。熟悉重组体导入受体细胞及筛选方法。(ppt74ppt74)2.2.掌握限制性内切酶概念及作用特点。掌握限制性内切酶概念及作用特点。(ppt9ppt9)3.3.熟悉常用载体及特点。熟悉常用载体及特点。(ppt35ppt35)4.4.熟悉目的基因获取及与载体连接的方法。熟悉目的基因获取及与载体连接的方法。(ppt57ppt57)6.6.了解基因克隆表达技术，了解基因克隆表达技术，。(ppt86ppt86)
