1、第十四章第十四章 免疫细胞的分离及免疫细胞的分离及其表面标志检测技术其表面标志检测技术第一节第一节 免疫细胞的分离免疫细胞的分离 一、一、外周血单个核细胞分外周血单个核细胞分离离 二、二、淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离 三、三、T T细胞和细胞和B B细胞的分离细胞的分离 四、四、T T细胞亚群的分离细胞亚群的分离第二节第二节 淋巴细胞标志及亚群分类淋巴细胞标志及亚群分类 一、一、细胞表面标志及亚群细胞表面标志及亚群 二、二、B B细胞表面标志细胞表面标志 三、三、NK NK细胞表面标志细胞表面标志第三节第三节 其他的免疫细胞其他的免疫细胞第四节第四节 免疫细胞表面标志的检测及应用免疫细胞表面标
2、志的检测及应用 一、一、免疫细胞表面标志的检测方法免疫细胞表面标志的检测方法 二、二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义淋巴细胞表面标志检测的临床意义思考题思考题小结小结 第一节第一节 免疫细胞的分离免疫细胞的分离 外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离 T T细胞和细胞和B B细胞的分离细胞的分离 T T细胞亚群的分离细胞亚群的分离一、外周血单个核细胞分离一、外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞外周血单个核细胞（peripheral mononuclear cells,PMNC）包括淋巴细胞和单核细胞包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。）。Ficoll分
3、离液法主要用于分离外周血中的单个核细分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。细胞分离基本原理细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同不同细胞表面分化抗原不同不同细胞密度不同不同细胞密度不同人的红细胞密度为人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090 不同细胞密度不同不同细胞密度不同用用1.0771.0770.001
4、0.001的分层液可将细胞分离的分层液可将细胞分离 密度梯度离心密度梯度离心(Ficoll)(Ficoll)离心离心二二、淋巴细胞分离、淋巴细胞分离贴壁粘附法贴壁粘附法 吸附柱过滤法吸附柱过滤法 磁铁吸引法磁铁吸引法 Percoll Percoll 分离液法分离液法 （连续密度梯度离心）（连续密度梯度离心）（去单核细胞）（去单核细胞）E E花环沉降法花环沉降法 尼龙毛柱分离法尼龙毛柱分离法 三、三、T T细胞和细胞和B B细胞的分离细胞的分离四、四、T T细胞亚群的分离细胞亚群的分离 亲和板结合分离法亲和板结合分离法 磁性微球分离法磁性微球分离法 荧光激活细胞分离仪分离法荧光激活细胞分离仪分离
5、法 荧光激活细胞分离仪分离法荧光激活细胞分离仪分离法 磁珠大小可以选择磁珠大小可以选择大小免疫磁珠分离细胞的特点比较大小免疫磁珠分离细胞的特点比较 比较项目比较项目大磁珠大磁珠小磁珠小磁珠对细胞的影响对细胞的影响对细胞造成机械压力，影响对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不利于分离其生物学活性，不利于分离后培养。后培养。对细胞温和，不影响分离细对细胞温和，不影响分离细胞的后续培养。胞的后续培养。对流式细胞仪的影响对流式细胞仪的影响阻塞流式细胞仪的喷嘴，影阻塞流式细胞仪的喷嘴，影响散射光。响散射光。可直接上流式细胞仪检测，可直接上流式细胞仪检测，不影响散射光。不影响散射光。分离条件要求分离条件
6、要求技术简单，分离可在试管中技术简单，分离可在试管中完成。完成。需要很强的磁场来分离细胞。需要很强的磁场来分离细胞。收率收率得率高。得率高。得率不高。得率不高。纯度纯度纯度低。纯度低。纯度高。纯度高。分离时间分离时间分离速度快。分离速度快。分离速度慢。分离速度慢。分离成本分离成本成本低。成本低。需要很强的磁场来分离细胞，需要很强的磁场来分离细胞，需要一次性的分离柱，不能需要一次性的分离柱，不能在普通试管进行。在普通试管进行。免疫磁珠法细胞分选过程免疫磁珠法细胞分选过程免免疫疫磁磁珠珠细细胞胞分分选选装装置置全自动细胞分选系统全自动细胞分选系统流式细胞分析仪流式细胞分析仪第二节第二节 淋巴细胞标
7、志及亚群分类淋巴细胞标志及亚群分类 常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗原（志是簇分化抗原（Cluster of Cluster of differentiationdifferentiation，CDCD）。）。细胞表面分化抗原（细胞表面分化抗原（CDCD抗原抗原）适用于适用于T T、B B细胞的分离细胞的分离已知已知CDCD抗原细胞亚群的分离抗原细胞亚群的分离未知未知CDCD抗原细胞亚群的分离抗原细胞亚群的分离（阴性分选）（阴性分选）一、一、T T细胞表面标志及其亚群细胞表面标志及其亚群 CD3+CD4+CD8-辅助性辅助性T细胞细胞 （help T c
8、ell,Th）CD3+CD4-CD8+细胞毒性细胞毒性T细胞细胞 （cytotoxic T cell,Tc or CTL）CD4+CD25+调节性调节性T细胞细胞 （regulatory T cell,Tr or Treg）二、二、B B细胞表面标志细胞表面标志 SmIgSmIg、FcFc受体、补体受体、受体、补体受体、EBEB病毒受体，部分病毒受体，部分CDCD分子是分子是B B细胞的重要表面标志，其中以细胞的重要表面标志，其中以SmIgSmIg为为B B细胞所特有，是鉴定细胞所特有，是鉴定B B细胞可靠的指标。细胞可靠的指标。CD19/CD5CD19/CD5分子：可将分子：可将B B细胞区
9、分为细胞区分为B1B1细胞和细胞和B2B2细胞，细胞，B1B1细胞为细胞为CD19CD19和和CD5CD5双阳性，而双阳性，而B2B2细胞细胞仅为仅为CD19CD19阳性，阳性，B2B2细胞为通常所指的细胞为通常所指的B B细胞细胞。三、三、NKNK细胞表面标志细胞表面标志 人类人类NK细胞表面标志主要以细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将来认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为淋巴细胞认定为NK细胞。细胞。T细胞及细胞及NK细胞细胞第三节第三节 其他的免疫细胞其他的免疫细胞抗原提呈类细胞表面标志抗原提呈类细胞表面标志第四节第四节 免疫细胞表面标志的检测及应用
10、免疫细胞表面标志的检测及应用免疫细胞表面标志的检测方法免疫细胞表面标志的检测方法淋巴细胞表面标志检测的临床意义淋巴细胞表面标志检测的临床意义一、免疫细胞表面标志的检测一、免疫细胞表面标志的检测抗体致敏细胞花环法抗体致敏细胞花环法 免疫细胞化学法免疫细胞化学法 免疫荧光法免疫荧光法 流式细胞分析法流式细胞分析法 二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义 淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。能的重要指标。对对CD4+CD4+和和CD8+TCD8+T细胞的测定，有助于免细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植疫缺陷疾病
11、、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。排斥反应的监测。临床常见疾病中的临床常见疾病中的T 淋巴细胞的变化淋巴细胞的变化 思考题思考题1.1.免疫细胞都包括哪些细胞？为什么要将其分离免疫细胞都包括哪些细胞？为什么要将其分离纯化？纯化？2.2.淋巴细胞有哪几类细胞？能用形态学的方法加淋巴细胞有哪几类细胞？能用形态学的方法加以区别吗？以区别吗？3.3.将细胞分离的原理有哪些？各有什么特点？将细胞分离的原理有哪些？各有什么特点？4.4.形态学相同的一类细胞为什么还要分亚群？形态学相同的一类细胞为什么还要分亚群？5.T5.T细胞和细胞和B B细胞进一步区分亚群的依据是什么？细胞进一步区分亚群的依据是什么
12、？6.6.什么是细胞表面标志？其作用是什么？什么是细胞表面标志？其作用是什么？7.7.细胞表面标志的检测方法有哪些？细胞表面标志的检测方法有哪些？8.8.利用细胞表面标志（利用细胞表面标志（CDCD抗原）分离细胞的方法抗原）分离细胞的方法有哪几种？有哪几种？9.T9.T细胞、细胞、B B细胞、细胞、NKNK细胞、单核细胞的主要生物细胞、单核细胞的主要生物标志是什么？标志是什么？10.10.淋巴细胞表面标志检测的临床意义是什么？淋巴细胞表面标志检测的临床意义是什么？小小 结结淋巴细胞并不是功能单一的群体，但其淋巴细胞并不是功能单一的群体，但其在光学显微镜下的形态基本是一样的，在光学显微镜下的形态
13、基本是一样的，因此要对其进行进一步的分类和观察就因此要对其进行进一步的分类和观察就不能采用形态学的方法，而要依靠对其不能采用形态学的方法，而要依靠对其表面标志的检测。常用于鉴定和检测计表面标志的检测。常用于鉴定和检测计数淋巴细胞的表面标志是数淋巴细胞的表面标志是CDCD抗原。抗原。进一步区分淋巴细胞亚群可使某一类淋进一步区分淋巴细胞亚群可使某一类淋巴细胞的功能趋向一致和单一。但目前巴细胞的功能趋向一致和单一。但目前看来，还很少有只通过一个看来，还很少有只通过一个CDCD抗原就能抗原就能将某一类淋巴细胞亚群指示出来的将某一类淋巴细胞亚群指示出来的CDCD抗抗原，原，CDCD抗原指示出来的淋巴细胞
14、亚群多抗原指示出来的淋巴细胞亚群多数都是相对特异。数都是相对特异。根据根据T T细胞的免疫效应功能和表面细胞的免疫效应功能和表面CDCD分子分子表达至少可以分为：辅助性表达至少可以分为：辅助性T T细胞、细胞细胞、细胞毒性毒性T T细胞和调节性细胞和调节性T T细胞；细胞；SmIgSmIg为为B B细胞细胞所特有，是鉴定所特有，是鉴定B B细胞可靠的指标，以细胞可靠的指标，以CD5CD5和和CD19CD19为标志可将为标志可将B B细胞分为细胞分为B1B1和和B2B2两个亚群；目前多以两个亚群；目前多以CD3-CD3-、CD16+CD16+、CD56+CD56+作为作为NKNK细胞的典型标志。细胞的典型标志。
