1、细菌检验自动化细菌检验自动化技术的应用技术的应用学习目的与要求 1.熟悉微生物数码鉴定的原理和方法。2.2.了解半自动化、全自动微生物鉴定和药敏试验分析系统的基本原理和步骤3.3.了解自动化血液细菌培养系统的工作原理 细菌鉴定的技术近十几年得到了快速发展，从人工鉴定到自动化技术，细菌鉴定技术的发展经历了以下发展历程：人工鉴定培养基的微量化、标准化和商品化数码分类鉴定技术（生化反应的数字化）自动化鉴定技术（生物信息的电脑化）使细菌的鉴定和药敏试验都实现了自动化。一、微生物数码鉴定法 早在七十年代中期，一些国外公司就研究早在七十年代中期，一些国外公司就研究出出借助生物信息编码鉴定细菌借助生物信息编
2、码鉴定细菌的新方法。这些的新方法。这些技术的应用，为医学微生物检验工作提供了一技术的应用，为医学微生物检验工作提供了一个简便、科学的细菌鉴定程序，大大提高了细个简便、科学的细菌鉴定程序，大大提高了细菌鉴定的准确性。菌鉴定的准确性。目前，微生物编码鉴定技术已经得到普遍应目前，微生物编码鉴定技术已经得到普遍应用，并早已商品化和形成独特的不同细菌鉴定用，并早已商品化和形成独特的不同细菌鉴定系统。如系统。如API、Micro-ID、RapID、Enterotube和和Minitek等系统。这种鉴定系统是自动化鉴定等系统。这种鉴定系统是自动化鉴定系统的基础。系统的基础。数码鉴定 是指通过数学的编码技术将
3、细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立数据库或编成检索本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字（编码），查阅检索本或数据库，得到细菌名称。其基本原理基本原理是计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。(一一)数码鉴定法基本原理数码鉴定法基本原理微量生化反应系统Micro-ID系统VP硝酸盐还原 苯丙氨酸脱羧酶硫化氢吲哚鸟氨酸赖氨酸丙二酸盐尿素七叶甘ONPG阿拉伯糖侧金盏花醇肌醇三梨醇421421421421421+0 2 0 0 2 1 4 0 0 0 2 1 4 0 0 2 3 4 3 4相加所得数字：23434 查
4、出相应细菌为：大肠埃希菌 先将细菌分离纯化。做一个革兰染色。根据染色结果选择不同的生化反应板进行接种（同一个鉴定系统，配有不同细菌的生化反应板）。培养后，读取生化反应结果，得到一组数据。将这组数据查编码本（即数据库），即得到鉴定结果。（二）鉴定步骤：国内的：有河南开封医学生物研究所的肠杆菌科细菌鉴定卡E-15；上海市卫生防疫站的发酵性革兰氏阴性杆菌鉴定系统SWF-A；二、自动化的二、自动化的微生物鉴定微生物鉴定和和 药敏试验分析系统药敏试验分析系统 细菌数码分类技术是细菌自动化鉴定技术的基础，细菌鉴定自动化是把生化反应数字化技术进一步电脑化，数据库用电脑管理，结果用电脑分析和鉴定。鉴定系统的工
5、作原理因不同的仪器和系统而异。不同的细菌对底物的反应不同是生化反应鉴定细菌的基础，而试验结果的准确度取决于鉴定系统配套培养基的制备方法、培养物浓度、孵育条件和结果判定等。大多鉴定系统采用细菌分解底物后反应液中pH的变化，色原性或荧光原性底物的酶解，测定挥发或不挥发酸，或识别是否生长等方法来分析鉴定细菌。1VITEK-ATB半自动细菌鉴定和药敏分析系统 VITEK-ATB是生物-梅里埃公司产品。由计算机和读数器两部分组成，计算机程序包括ATB和API的鉴定数据库、ATB的药敏数据库、数据储存和分析系统及药敏专家系统。鉴定和药敏反应板在机外孵育后，一次性上机读取结果，由计算机进行分析和处理，并报告
6、细菌鉴定和药敏结果。(一)半自动化细菌鉴定和药敏分析系统2AutoScan-4半自动细菌鉴定和药敏分析系统 AutoScan-4是由Dade MicroScan公司(美国)生产。由计算机和读数器两部分组成。鉴定和药敏反应板在机外孵育后，一次性上机，自动判读鉴定和药敏试验结果；亦可人工进行判读，将编码输入计算机，由计算机软件评定结果。有鉴定及鉴定药敏复合板两种测试卡。（二）全自动的微生物鉴定和 药敏试验分析系统 1VITEK 系统 VITEK AMS是由生物-梅里埃公司生产。第一代产品有以下四个规格VITEK AMS 32、60、120、240。系统结构 由计算机主机、孵育箱/读取器、充填机/封
7、口机、打印机等组成。鉴定原理 是采用光电比色法，根据不同微生物的理化性质不同，测定微生物分解底物导致pH改变而产生的不同颜色，来判断反应的结果。每张卡上有30项生化反应。由计算机控制的读数器，每隔1h对各反应孔底物进行光扫描，并读数一次，动态观察反应变化。一旦鉴定卡内的终点指示孔到临界值，则指示此卡已完成。系统最后一次读数后，将所得的生物数码与菌种数据库标准菌的生物模型相比较，得到相似系统鉴定值，并自动打印出实验报告。使用方法 获得细菌的纯培养后，调整菌悬液浓度 根据不同的细菌选择相应的药敏试验卡片，在充液仓中对卡片进行充液。置孵育箱读数器中孵育，自动定时测试、读取数据和判断结果。鉴定范围 V
8、ITEK可快速鉴定包括各种肠杆菌科细菌、非发酵细菌、苛氧菌、革兰阳性球菌、革兰阴性球菌、厌氧菌和酵母菌等500种临床病原菌。具有20多种药敏测试卡、97种抗生素和测定超广谱-内酰胺酶测试卡，快速检测细菌药敏情况。VITEK-2是生物-梅里埃公司开发的新一代微生物分析仪，其工作原理与VITEK AMS没有大的差别，但它的容量更大，自动化程度更高，并且使用64孔的反应卡片，鉴定更准确可靠，可同时测定20种抗生素的药敏试验。系统构成 由主机、真空加样器、孵育箱/读取器、计算机、打印机等组成。工作原理 除采用传统呈色反应采用传统呈色反应法外，同时采用敏感度极高的快速荧光测定技术快速荧光测定技术来检测细
9、菌检测细菌胞外酶胞外酶。鉴定板有普通板和快速板两种，普通板获得结果需要16-18h，快速板测定只需2-3.5h。2.MicroScan Walk/Away系统 此系统有walk/Away-40和96两个型号，40或96分别代表该系统可同时容纳40或96个测试板。该系统有8种鉴定反应板，可鉴定包括革兰阴性菌、革兰阳性菌、厌氧菌、酵母菌、嗜血杆菌和奈瑟菌等近800种细菌。药敏部分采用比浊法进行测定，90菌株可在5.5h内获得对1733种抗菌药物的MIC值。1自动化鉴定系统是根据数据库中所提供的背景资料鉴定细菌，数据库资料的不完整将直接影响鉴定的准确性。目前为止，尚无一个鉴定系统能包括所有的细菌鉴定
10、资料。对细菌的分类是根据传统的分类方法，因此鉴定也以传统的手工鉴定方法为“金标准”。使用自动化鉴定仪的实验室，应对技术人员进行手工鉴定基础与操作技能培训。(三)使用自动化鉴定仪的局限性 2随着人们对细菌本质认识的加深而不断演变，使用自动化鉴定仪的实验室应经常与生产厂家联系，及时更新数据库。实验室技术人员应了解细菌分类的最新变化，便于在系统更新之前即可进行手工修改。3通过自动化鉴定仪得出的结果，必须与其它已获得的生物性状（如标本来源、菌落特征及其它的生理生化特征）进行核对，以避免错误的鉴定。药敏试验分析系统 基本原理基本原理 是将抗生素微量稀释在条孔或条板中，加入菌悬液孵育后放入仪器或在仪器中直
11、接孵育，通过测定细菌生长的浊度，或测定培养基中荧光指示剂的强度或荧光原性物质的水解，观察细菌的生长情况。在含有抗生素的培养基中，浊度的增加提示细菌生长，根据判断标准解释敏感或耐药。三、自动化的血液细菌培养系统 正常血液是无菌的，细菌侵入可导致菌血症、败血症、脓毒血症，及时准确地进行病原学诊断极为重要。传统的血培养是抽取5ml血液注入血培养瓶中，放入孵箱，每天观察结果，费时费力，不能及时发阳性结果，易延误诊断。全自动血液细菌培养仪主要优点主要优点是可以在较短培养时间内提示出血液培养瓶中有无微生物的存在。1BACTEC系列 BACTEC460、NR-730是早期的血液培养仪，目前基本上已被BACT
12、EC9000系列替代（包括9050、9120和9240三种型号，可分别容纳50、120和240个培养瓶）。微生物在生长过程中消耗培养基内的营养物质，产生的二氧化碳二氧化碳直接激活瓶底部预埋的对二氧化碳浓度变化高度敏感的荧光物质，在激发光的激发下放出荧光，荧光的强度变化直接反映瓶内二氧化碳浓度变化，来判断瓶内有无微生物生长。根据不同的培养要求，该系统配置了标准需氧厌氧培养瓶、有中和抗菌药物的树脂培养瓶、厌氧菌和真菌等多种培养瓶。2 2BacTBacTAlertAlert系统系统 该系统有BacTAlert48、72、96、120、240及3D等型号。测定原理 当培养瓶内有微生物生长，代谢过程中产
13、生的二氧化碳可经过半透膜渗透至瓶底，与固定于瓶底的NovelCO2感应器结合，产生颜色变化，通过光电检测得知二氧化碳变化情况。通过计算机处理后，在曲线图上反映、分析、判断阴性或阳性结果，并及时报警。系统配置有需氧培养瓶、厌氧培养瓶、中和抗生素需氧瓶、中和抗生素厌氧瓶、小儿培养瓶、血液分枝杆菌培养瓶和痰液分枝杆菌培养 3.VITAL3.VITAL系统系统测定原理 使用均质荧光技术均质荧光技术的快速培养系统，培养瓶内的液体培养基中含有荧光底物，当细菌生长后，产生的质子、电子和离子与荧光分子结合后，使荧光物变成无荧光化合物，通过测量每瓶内荧光强度来反映细菌生长情况。API 半自动细菌鉴定及药敏分析仪MicroScan自动微生物鉴定药敏测试系统的基本配置Vitek 60VITAL全自动血液培养系统的基本配置ESP血培养仪的基本配置 全自动药敏分析仪 全自动血培养仪
